牛肉品质的5个重要指标包括嫩度、多汁性、风味、肉色和吸水力, 其中, 嫩度是肉品质量的首要指标, 影响牛肉的食用和商业价值^[1-5]。消费者经常抱怨牛肉质量不稳定, 尤其在嫩度方面, 他们宁愿付更高的价钱购买嫩牛肉^[6]。目前牛肉嫩度检测仍然使用传统的方法, 即感官评价和剪切力检测。所谓感官评价是通过人品尝肌肉来判定肌肉老嫩。例如:通过舌头与颊接触时产生的触觉, 嫩肉感觉细而柔和, 老肉感觉粗而木质化; 牙齿咬断肌肉纤维的容易程度, 易嚼碎的嫩, 不易嚼碎的老。感官评价的缺点是主观性强, 耗时, 有损, 重复性差, 花费高。而剪切力法测定牛肉嫩度是把牛肉加热到一定温度, 再用刀具切断, 根据切断力的大小来判定肉的嫩度。剪切力法测定牛肉嫩度虽然客观, 但操作过程相当繁琐、耗时, 而且有损, 影响牛肉的商业价值。因此牛肉产业迫切需要快速、无损、客观检测肉嫩度的技术和方法。随着机器视觉和图像处理技术的发展, 肉类研究者一直在研究牛肉嫩度指标, 实现牛肉嫩度的快速、无损检测^[7]。1997年美国农业部颁发的牛胴体分级标准主要根据牛肉的大理石纹、生理成熟度和肉色等指标进行分级。但是先前的研究^[8-9]表明, 肉色和大理石纹得分对于牛肉的嫩度预测能力十分有限。因此, 必须寻求其他牛肉嫩度指标。一些学者认为牛肉图像的纹理特征与肉嫩度存在一定的关系, 认为纹理特征可以作为牛肉的嫩度指标^[10-14]。另一些学者则探讨了牛肉肌内结缔组织和肉嫩度的关系。Purslow^[15-16]研究了牛肉结缔组织的形态、分布、成分和数量, 结缔组织分为肌内结缔组织和存在于肌肉块之间的肌间结缔组织, 肌内结缔组织主要由肌束膜(包裹肌纤维束)、肌内膜(包裹肌纤维)组成, 结缔组织的数量和分布因不同的肌肉类型而不同, 且和牛肉嫩度存在一定的关系。Girard等^[17]、Dubost等^[18-19]、Jabri等^[20]阐明了肌内结缔组织和肉的嫩度存在一定的关系。近两年来, 还有一些学者从牛肉的外在因素, 寻找合适的嫩度指标, 预测牛肉嫩度。van Wezemael等^[4]认为消费者对牛肉嫩度的主观评价, 更适合作为嫩度指标; Boles等^[21]研究了乳酸浓度和肉的嫩度存在一定的关系。然而, 不论是牛肉的颜色、纹理和肌内结缔组织的微观和宏观形态特征, 还是牛肉外在的一些特征, 诸多文献报道这些特征可以作为嫩度指标, 对牛肉嫩度进行预测或分级, 但研究结果各不相同, 至今没有无损、快速的牛肉嫩度检测方法运用于牛肉生产。因此寻求合适的牛肉嫩度指标, 快速、无损地预测牛肉嫩度并对牛肉进行分级仍然是国内外的一个热点问题。

肌间结缔组织对牛肉嫩度的贡献国内外未见报道。牛背最长肌切面处, 存在一种肌间结缔组织。本研究采用机器视觉技术, 捕获牛背最长肌切面处的肌间结缔组织图像, 通过图像分割算法分割肌间结缔组织区域, 提取肌间结缔组织图像特征参数, 结合熟肉剪切力值, 构建牛肉嫩度预测模型, 采用留一法(Leave-one-out cross validation)进行嫩度预测模型预测性能的验证, 从而实现快速、无损、客观预测牛肉嫩度以及将牛肉进行分级。

1 材料与方法 1.1 样本

样本取自北京御香苑集团。将70头28~36月龄、宰后胴体质量300~480 kg的鲁西黄牛, 屠宰, 经4 d成熟; 在胴体分割时, 在每个胴体左侧取眼肉(背最长肌12~13椎骨处), 置于图像采集装置内进行图像采集。图像采集后测定嫩度值。

1.2 图像采集系统

图像采集系统如图 1。该系统主要由CCD工业相机(MVC2900F USB2.0 CCD)、镜头(PENTEX H614)、碗状可控光源(HPD-150SW)及本课题组设计的密闭采集箱体、数据传输线和PC机组成。

其中, 放置样品的台面采用黑色材料, 黑色台面可以在箱体内部上下一定范围内滑动, 碗状光源箱体内壁涂成白色, 图像在密闭环境下采集, 确保光照均匀。光源亮度通过光源控制器调节。试验时, 将牛肉样本置于工作台上, 调节工作台面高度、相机焦距和光圈使PC机采集的图像最为清晰。记录、固定这些参数, 并在试验中保证这些参数的一致性。图 2是采集的牛背最长肌切面处的肌间结缔组织图像。

1.3 嫩度测量 1.3.1 牛肉剪切力值测定

嫩度的测量在图像采集完成后进行, 测量过程参照农业部行业标准(NY/T 1180—2006肉嫩度的测定:剪切力测定法)。测量前, 先称取样本质量; 将温度探头埋入样本中心, 然后将样本放入聚氯乙烯材质的薄塑料袋, 置于水浴锅中水浴加热, 水温控制在75~80 ℃; 加热过程中, 塑料袋开口向上高于水浴锅水面, 当样品中心温度达到35 ℃时, 将样本上下翻面; 直至中心温度达到70 ℃, 取出样本, 记录加热时间, 称质量, 之后用密封袋装好, 放置于4 ℃冰箱内冷却12 h, 取出测量嫩度。沿与肌纤维平行方向, 切取横截面10 mm×10 mm的10个肉条。测量嫩度时, 使用肉类嫩度测量仪(型号C-LM3B, 东北农业大学研制), 沿垂直于肌纤维平行方向测定剪切力(单位:N), 取平均值。

1.3.2 牛肉嫩度的主观评价

由12位受过专门训练并积累了一定经验的评审人员对70个样本进行主观评价。将试验所测得的70个样本的剪切力值与主观评价试验中评审员的嫩度分级相对照, 得出(表 1):剪切力值小于58.8 N的牛肉为嫩牛肉, 嫩度等级为1;剪切力值大于88.2 N的牛肉为老牛肉, 嫩度等级为3;剪切力值介于58.8~88.2 N之间的牛肉为中等嫩度的牛肉, 嫩度等级为2^[22]。根据以上对应关系, 训练集70个样本中, 嫩牛肉、中等嫩度牛肉、老牛肉的样本数分别为8、40、22。

1.4 嫩度预测软件系统设计

PC机处理系统负责运行软件算法, 主要包括处理图像, 提取图像特征, 数学模型运算, 显示嫩度结果。嫩度预测流程如图 3。

1.5 肌间结缔组织的图像分割及其特征变量提取 1.5.1 图像分割

OHTA颜色空间与RGB颜色空间转换是线性转换^[23], R、G、B各分量与OHTA颜色空间分量I₁、I₂、I₃转换关系如下:

(1)

OHTA颜色空间与RGB颜色空间比较, OHTA颜色空间下的3个分量I₁、I₂、I₃无相关性, 与HIS空间比较, RGB模型转换为OHTA模型是线性变换, 不存在溢出致图像信息丢失的问题, 计算简单。

通过提取大量牛肉图像中的肌间结缔组织区域、肌肉区域和脂肪区域的颜色值, 反复试验发现OHTA颜色空间的第一分量I₁与RGB颜色空间的色差分量(R-G)对肌间结缔组织区域分割贡献最大。令色差分量(R-G)为变量I′₂, 利用大津法(Otsu), 获得I₁分量阈值m₁和I′₂分量阈值m₂, 构建二阈值模型, 分割肌间结缔组织区域。具体步骤如下:

1)读取图像中像素点R、G、B分量值;

2)按式(2)计算I₁、I′₂值

(2)

3)计算出的I₁、I′₂值与前面设定的阈值作比较, 即作如下判断:如果(I₁ > m₁‖I′₂ > m₂), 该像素点置255;

4)读取下一个像素点RGB分量值, 重复步骤1)、2)、3)直到最后一个像素点。

对图 4-a采用二阈值识别模型, 处理结果如图 4-b所示。图 4-b中仍有一些噪声的残留, 这些噪声主要是一些与肌间结缔组织区域颜色特征很接近的肌肉和脂肪。对图 4-b先灰度化, 用9×9邻域中值滤波器去除椒盐噪声、平滑, 结合形态学处理方法, 得分割结果——肌间结缔组织区域, 如图 4-c。

1.5.2 特征变量提取

编程计算从每幅图像中分割出肌间结缔组织区域R、G和B颜色均值:u_R、u_G、u_B。在OHTA颜色空间, I₁分量代表亮度, I₂、I₃分量代表色彩, 且I₁、I₂、I₃个分量正交; 而RGB颜色空间的3个分量R、G和B高度相关, 因此, 将u_R、u_G、u_B代入式(1)计算, 计算后对应的分量分别记为u₁、u₂、u₃。选u₁、u₂、u₃作为肌间结缔组织的特征变量, 其表达式如下。

(3)

1.6 Stepwise多元线性回归

1.5.2节提取的特征变量u₁、u₂、u₃, 对嫩度是否有贡献, 建模前, 先进行特征变量与熟肉嫩度(用剪切力值表示)的Pearson相关性分析。结果表明特征变量u₂、u₃在0.01水平(P=0.000, 小于0.01)与肉嫩度显著相关, 特征变量u₁在0.05水平(P=0.019, 小于0.05)与肉嫩度显著相关。

70个样本数据全部用于训练模型。在3个特征变量中, Stepwise多元线性回归法筛选出变量u₂、u₃。变量u₂、u₃用于建立Stepwise多元线性回归模型, 建立的Stepwise多元线性回归模型见式(4):

(4)

式中:f_yc为预测的嫩度; u₂、u₃为肌间结缔组织的特征变量。

对所建立的嫩度预测模型进行统计学检验。拟合优度检验:R²=0.873, 调整R²为0.869, 说明回归方程拟合效果好, 本研究中提取的特征变量可以解释因变量(用剪切力表示牛肉嫩度)的86.9%变化。方程显著性检验:统计量F=229.516, 对应的概率值P=0.000, 小于0.05, 说明回归方程显著成立。参数显著性检验:u₂对应的t=-16.491, 概率值P≤0.001, u₃对应的t=-8.135, 概率值P=0.000, 说明自变量u₂、u₃与因变量(牛肉嫩度)在总体上存在显著的线性关系, P < 0.05, 特征量u₂、u₃和嫩度总体上存在显著的线性关系。多重共线性检验:方程中常量、变量u₂、u₃分别对应的条件索引为1.000、1.693、6.369, 都小于30, 方差膨胀因子都小于10, 说明回归方程中变量间的共线性关系不明显。自相关检验:对应的DW=1.550, 说明变量间基本无自相关性。

1.7 留一法交叉验证(Leave-one-out cross validation)和剩余标准差

训练模型要求反映潜在群体性能合理大小的样本集, 测试模型要求独立的样本集, 实际情况是仅仅能获得有限数量的样本。为了最有效地利用数据, 用所有样本作为训练样本, 这就是留一法技术(Leave-one-out technique)^[24]。留一法交叉验证(Leave-one-out cross validation)用于评价嫩度模型的预测能力。在这种交叉验证测试中, 设样本总数为n, 用n-1个样本训练嫩度模型, 用剩下的一个样本测试嫩度模型。对所有的样本重复上述过程。建立的嫩度模型的预测精度用剩余标准差RSE表示, 其值越小说明预测的嫩度精度越高。

剩余标准差:

式中:ê_i为第i个实际测量嫩度值与Stepwise线性回归模型的拟合值残差; k为模型中特征量的个数; n为样本总数。

2 结果与分析

采集的肌间结缔组织图像主要用于分割结缔组织区域, 提取该区域的特征参数。图 4-a是从70个样本的图像中任意抽取的2幅图像。分割的肌间结缔组织图像如图 4-c。图 5-a表达了最好的嫩度预测模型, 通过Stepwise多元线性回归模型得到的预测嫩度值与实际测量的嫩度值比较。图 5-b是将实际测量的嫩度值与通过Leave-one-out交叉验证所得到的嫩度值进行比较。

Stepwise多元线性回归模型的牛肉嫩度判别系数R²=0.873, 剩余标准差RSEC=6.067;留一法交叉验证测试模型的牛肉嫩度判别系数R²=0.857, 剩余标准差RSEC=6.453。

表 2表达了用留一法交叉验证检验Stepwise多元线性回归模型的嫩度判定等级效果。由表 2可以看出:嫩度等级为1的预测正确率为62.5%, 嫩度等级为2的预测正确率为95%, 嫩度等级为3的预测正确率为86.36%, 全部预测集的总体等级预测正确率为88.57%。

Li等^[10]将牛肉纹理特征作为嫩度指标, 将牛肉分为老、嫩2级, 总的分级正确率为83.3%。Sun等^[14]将牛肉的多光谱图像纹理特征作为嫩度指标, 建立的线性模型和非线性模型预测牛肉嫩度等级2级, 前者识别嫩牛肉正确率为80%~85%, 识别老牛肉正确率接近80%;后者识别嫩度较老牛肉的效果不理想, 识别嫩牛肉正确率为92%~100%。Dubost等^[18-19]分析了肌内结缔组织的宏观图像、微观图像特征和生化特性呈一定的相关性, 而结缔组织的生化特性影响牛肉嫩度, 认为结缔组织的图像特征可以作为牛肉的嫩度指标。Jabri等^[20]将牛肉的可见光光谱图像的肌内结缔组织特征作为牛肉的嫩度指标, 预测牛肉嫩度, R²=0.89。McDonald等^[8]根据大理石纹得分预测牛肉嫩度, 牛肉嫩度判别系数(R²)很低, 仅为0.13。Wulf等^[9]根据肉色(用b^*值表示肉色)预测牛肉嫩度, R²为0.14。Li等^[11]将大理石和肉色共同作为嫩度指标, R²为0.3。本研究将肌间结缔组织特征作为嫩度指标, R²为0.873, 将牛肉分为3级, 对于各个等级总的验证判别的准确率为88.57%。因此, 总体样本嫩度预测准确率较高, 对于基于机器视觉技术的牛肉嫩度预测效果较好, 具有较好的实用价值和现实指导意义。

3 结论

国内外诸多学者研究了牛肉图像的嫩度指标对牛肉嫩度的贡献, 最终的目的都是在较小的硬件投入下, 快速、无损及以较高的准确率预测牛肉嫩度或牛肉嫩度等级。本研究实现了基于牛肉切面图像的肌间结缔组织区域的特征参数的提取, 研究了它们与牛肉嫩度剪切力值的关系。主要结论如下:1)通过机器视觉技术和图像处理方法分割肌间结缔组织区域, 建立该区域的特征参数。2)利用结缔组织区域的3个特征参数, 对熟肉剪切力值, 建立Stepwise多元线性回归模型, 得到模型的牛肉嫩度判别系数(R²)为0.873, 各个图像特征参数的系数都较好地反映了其与牛肉嫩度剪切力值的对应关系。3)检验回归模型的嫩度判定等级效果, 嫩度等级1判别的准确率为62.5%, 嫩度等级2判别的准确率为95%, 嫩度等级3判别的准确率为86.36%, 全部预测集的总体等级预测正确率为88.57%。

研究结果表明:肌间结缔组织特征是预测牛肉嫩度的重要指标, 所用的软硬件方法对牛肉嫩度的快速、无损、客观预测和分级具有一定的实用价值和现实指导意义。