南京农业大学学报  2016, Vol. 39 Issue (5): 838-844   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201510024
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许伟, 范梦雪, 孟婷婷, 胡文娟, 宫佳杰, 陈晓芳, 姜云晶, 朱电峰, 冯士彬, 李玉, 吴金节, 王希春
XU Wei, FAN Mengxue, MENG Tingting, HU Wenjuan, GONG Jiajie, CHEN Xiaofang, JIANG Yujing, ZHU Dianfeng, FENG Shibin, LI Yu, WU Jinjie, WANG Xichun
脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响
Effect of deoxynivalenol on apoptosis of PC12 cells
南京农业大学学报, 2016, 39(5): 838-844
Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(5): 838-844.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201510024

文章历史

收稿日期: 2015-10-18
脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响
许伟, 范梦雪, 孟婷婷, 胡文娟, 宫佳杰, 陈晓芳, 姜云晶, 朱电峰, 冯士彬, 李玉, 吴金节, 王希春    
安徽农业大学动物科技学院, 安徽 合肥 230036
摘要: [目的] 本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2BaxBid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。 [方法] 用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL-1)对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。 [结果] 不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P < 0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·mL-1时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P < 0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·mL-1时极显著下降(P < 0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·mL-1时极显著下降(P < 0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P < 0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·mL-1时极显著增加。 [结论] DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。
关键词脱氧雪腐镰刀菌烯醇    细胞凋亡    PC12细胞    基因    Bcl-2    Bax   
Effect of deoxynivalenol on apoptosis of PC12 cells
XU Wei, FAN Mengxue, MENG Tingting, HU Wenjuan, GONG Jiajie, CHEN Xiaofang, JIANG Yujing, ZHU Dianfeng, FENG Shibin, LI Yu, WU Jinjie, WANG Xichun    
College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: [Objectives] The experiment aimed at the effect of DON on Bcl-2, Bax, Bid mRNA and the cleaved-Caspase 3, cleaved-Caspase 9 protein in PC12 cells. [Methods] PC12 cells were exposed to deoxynivalenol(DON) at different concentrations(0, 125, 250, 500, 1 000, 2 000 ng·mL-1) for 24 h. The changes of cell ultrastructure, cell apoptosis ratio, apoptosis-related genes expression and apoptosis-related protein expression were determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, qPCR and Western-blot, respectively. [Results] Different concentrations of DON could induce cell apoptosis, compared with control group, the cell apoptosis ratio in experimental groups significantly increased(P < 0.01), and the changes with the increase of DON concentrations, peak at 1 000 ng·mL-1. Compared with control group, the Bax mRNA and Bax/Bcl-2 ratio was significantly increased(P < 0.01), the Bcl-2 mRNA was significantly decreased(P < 0.01) when the concentration of DON above 500 ng·mL-1, and the Bid mRNA was significantly decreased(P < 0.01) when the concentration of DON above 250 ng·mL-1. Western-blot results showed that the cleaved-Caspase 9 in experimental groups were significantly increased(P < 0.01), however, the cleaved-Caspase3 significantly increased(P < 0.01) when the concentration of DON was above 500 ng·mL-1. [Conclusions] DON could induce PC12 cell apoptosis, and Bcl-2, Bax, Bid, Caspase 3 and Caspase 9 participated in the regulation of cell apoptosis.
Key words: DON    apoptosis    PC12 cells    Bcl-2    Bax   

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是一种常见的单端孢霉烯族类毒素, 广泛污染谷物类产品, 如小麦、大麦、玉米等, 在世界范围内均有报道[1-2]。动物食用了被DON污染的饲料, 多出现呕吐症状, 故其又被称为呕吐毒素(vomitoxin, VT)。DON中毒是指动物采食被该毒素污染的饲粮而出现厌食、呕吐、发热、反应迟钝等特征性中毒症状。DON的毒性效应有着种属差异性, 不同的动物对其敏感程度不同, 其中猪最敏感[3]。DON的理化性质非常稳定, 对热有很强的耐受性。因此, 被DON污染的谷物产品经过二次加工进入食物链, 仍可危害人和动物的健康。

DON对人和畜禽具有神经毒性、免疫毒性、生殖和发育毒性以及“三致”毒性等[3]。此外, DON还有很强的细胞毒性, 主要表现在细胞形态改变, 细胞膜破裂, DNA损伤, 抑制蛋白质的合成以及促进凋亡基因的表达等[4-6]。由于神经系统的复杂性, 人们对DON的神经毒性的认识目前仍处于探索阶段。另外, 关于DON对神经细胞毒性的体外研究鲜有报道。

PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞株, 具有神经内分泌细胞的一般特征, 且具有稳定传代的特点, 是一种优良的神经细胞模型。广泛应用于神经生理、病理和药理学等研究[7]。目前关于DON诱导神经细胞凋亡及相关基因和蛋白表达水平影响的研究少见报道。因此, 本试验选择PC12细胞作为研究对象, 了解DON对细胞凋亡相关基因Bcl-2BaxBid及凋亡蛋白Caspase3、Caspase9表达水平的影响, 旨在从细胞和分子水平探讨DON诱导PC12细胞凋亡的作用机制, 为丰富DON神经毒性的研究提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器

PC12细胞, 南京凯基生物科技发展有限公司; BB-15 CO2培养箱, 美国Thermo公司; XDS-1倒置显微镜, 重庆光电仪器有限公司; TEOL-2010高分辨率电子透射显微镜, 日本电子株式会社; 流式细胞仪, 美国BD公司; TC-XP基因扩增仪, 杭州博日科技有限公司; 荧光定量PCR仪, Life Technologies; DON, Sigma公司; 胎牛血清(FBS), 美国CLARK公司; DMEM培养基, 美国Hyclone公司; Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒, 沈阳万类生物科技有限公司; cleaved-Caspase 3抗体、cleaved-Caspase 9抗体, 美国CST公司; β-actin小鼠单克隆抗体, 北京锐抗生物科技有限公司; Trizol RNA提取试剂盒, 大连宝生物工程有限公司; SYBR qPCR Mix, 美国Biomiga公司; First Strand cDNA Synthesis Kit, 日本TOYOBO公司; ECL化学发光试剂盒, 美国Thermo公司。

1.2 细胞培养和分组

将PC12细胞接种于5 cm×5 cm培养瓶中, 在37 ℃、5%浓度CO2培养箱中培养, 使用含10% FBS、100 U·mL-1青霉素以及100 mg·L-1链霉素的DMEM高糖培养基。

将1 mg DON溶于1 mL培养基中, 配成浓度为1 mg·mL-1的DON母液。用培养基继续将DON稀释成125、250、500、1 000和2 000 ng·mL-1。将处于对数生长期的PC12细胞(5×105 mL-1)接种于六孔板培养24 h, 以不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL-1)处理24 h, 收集细胞用于形态学观察和细胞凋亡、Bcl-2BaxBid等mRNA水平及Caspase 3、Caspase 9蛋白等表达情况的检测。

1.3 形态学观察

分别用0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL-1的DON处理细胞24 h后, 在倒置显微镜下观察DON对细胞形态的损伤情况, 并收集各浓度DON处理后的细胞, 2.5%戊二醛固定后进行电镜切片制样。

1.4 细胞凋亡检测

细胞凋亡率采用Annexin V-FITC/PI试剂盒测定。将DON(每组3个重复)处理24 h后的细胞制成细胞悬液。用PBS洗涤2次, 收集细胞沉淀, 向细胞沉淀中加入500 μL binding buffer重悬细胞, 依次加入5 μL Annexin V-binding和5 μL PI(propidium iodide)。室温反应5~15 min后用流式细胞仪检测。

1.5 Bcl-2BaxBid mRNA表达水平测定

收集不同浓度DON处理24 h后细胞, 用Trizol法提取RNA, 采用NanoVue浓度仪测定RNA浓度。采用First Strand cDNA Synthesis Kit在42 ℃ 30 min进行反转录反应, 80 ℃ 5 min进行反转录酶的失活反应。

目的基因Bcl-2BaxBid和内参GAPDH基因的引物序列参照GenBank相应基因序列, 由华大基因公司设计合成。引物序列及参数见表 1

表 1 Bcl-2BaxBidGAPDH基因的引物参数 Table 1 Parameters of primer pairs for Bcl-2, Bax, Bid and GAPDH genes
基因
Genes
GenBank登录号
GenBank accession No.
引物对序列(5′→3′)
Primer pairs sequence(5′→3′)
产物大小/bp
Product size
GAPDH NC_000072.6 GGTGAAGGTCGGTGTGAACG/CTCGCTCCTGGAAGATGGTG 232
Bcl-2 NC_000067.6 TGGGATGCCTTTGTGGAACT/GCAGGTTTGTCGACCTCACT 153
Bax NC_000073.6 GGTTTCATCCAGGATCGAGA/TCCTCTGCAGCTCCATATTGC 151
Bid NC_000072.6 AGCTACACAGCTTGTGCCAT/CAGCTCGTCTTCGAGGTCTG 186

按照StepOneTM Real-time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒说明配制PCR反应液。采用两步法PCR扩增标准程序:

第1步95 ℃ 1 min预变性; 第2步PCR反应:95 ℃ 15 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环; 末段延伸72 ℃, 5 min。熔解曲线72 ℃→95 ℃, 每20 s升温1 ℃。

每个样品的基因Bcl-2BaxBid和内参基因GAPDH均在相同条件下进行扩增反应, 重复3次。

1.6 Western-blot法分析凋亡相关蛋白

收集各组细胞, 用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白, 用于cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白的分析。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度, 加入5×loading buffer后, 95 ℃处理5 min。总蛋白以50 μg的添加量进行SDS-PAGE(50 g·L-1浓缩胶, cleaved-Caspase 9使用120 g·L-1分离胶, cleaved-Caspase 3使用150 g·L-1分离胶)。使用半干转膜仪在120 V条件下转膜40 min, 将蛋白转印到PVDF膜上, 50 g·L-1 BSA封闭液室温封闭4 h。4 ℃条件下加cleaved-Caspase 3(1:750)、cleaved-Caspase 9(1:750)一抗过夜孵育。加二抗(1:10 000)室温孵育2 h。

1.7 数据分析

数据均以x±SD表示, 利用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析, Western-blot图片采用Quantity one软件进行灰度值分析。

2 结果与分析 2.1 DON对PC12细胞生长状态的影响

不同浓度DON处理24 h后, 在倒置显微镜下观察PC12细胞生长情况(图 1)。对照组细胞(图 1-A)多为长梭形, 细胞间连接紧密。试验组细胞(图 1-B~F)随着DON浓度的增加, 细胞数量逐渐减少, 细胞凸起消失, 体积缩小, 失去原有的伸展状态, 逐渐变成圆形, 悬浮细胞逐渐增多。

图 1 DON对PC12细胞生长状态的影响(×400) Figure 1 Effect of DON on PC12 cell growth state(×400) A~F:DON处理质量浓度分别为0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL-1 A-F:DON concentrations are 0, 125, 250, 500, 1 000 and 2 000 ng·mL-1, respectively.
2.2 DON对PC12细胞超微结构的影响

不同质量浓度DON处理24 h后, 在电镜下观察PC12细胞的形态学变化(图 2)。对照组细胞(图 2-A1)可见规则的细胞核、清晰的核仁和正常的细胞器, 染色质分布均匀, 线粒体结构正常及丰富的脊(图 2-A2)。试验组细胞(图 2-B1~图 2-F2)均出现了核膜皱缩, 染色质边集, 线粒体肿胀脊消失, 部分线粒体空泡变性等明显的细胞凋亡特征, 且DON的浓度越高, 这种现象越明显。2 000 ng·mL-1 DON处理组细胞核严重皱缩, 染色质凝集, 有的形成凋亡小体。

图 2 DON对PC12细胞超微结构的影响 Figure 2 Effect of DON on PC12 cell ultrastructure
2.3 DON对细胞凋亡率的影响

图 3-A可见:随着DON浓度的增加, 细胞的凋亡率随之增加, DON浓度达到2 000 ng·mL-1时细胞凋亡率略下降, 但细胞死亡率增加。由图 3-B可见:与对照组相比, 各试验组细胞凋亡率均极显著升高(P < 0.01), DON浓度在125~1 000 ng·mL-1时, 凋亡率呈浓度依赖性升高, 而当DON为2 000 ng·mL-1时, 细胞凋亡率反而较1 000 ng·mL-1有所降低。

图 3 DON对PC12细胞凋亡的影响 Figure 3 Effect of DON on PC12 cell apoptosis A.细胞凋亡图Cell apoptosis picture; B.细胞凋亡率Cell apoptosis rate
*, * *:分别表示与对照组相比差异显著(P < 0.05)和差异极显著(P < 0.01)。
* and * * show significant difference(P < 0.05)and highly significant difference(P < 0.01)compared with control group, respectively.The same as follows.
2.4 DON对凋亡相关基因表达的影响

荧光定量PCR测定Bcl-2BaxBid mRNA的表达量, 结果见图 4。与对照组相比, Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2均极显著增加(P < 0.01), 且随着DON浓度的增加而提高, 在1 000 ng·mL-1时达到峰值; Bcl-2 mRNA表达水平随着DON浓度的增加而降低, 在超过500 ng·mL-1时极显著下降, 在1 000 ng·mL-1时达到最低值; Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·mL-1时极显著提高, 并随浓度的增加而提高, 在1 000 ng·mL-1时达到峰值。

图 4 DON对凋亡相关基因表达的影响 Figure 4 Effects of DON on apoptosis-related genes expression
2.5 DON对凋亡相关蛋白表达的影响

图 5所示:与对照组相比, DON各处理组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著增加(P < 0.01), 并随着DON浓度的增加而增加, 在1 000 ng·mL-1时达到最大值; cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·mL-1时极显著增加(P < 0.01), 同样也在1 000 ng·mL-1时达到峰值。

图 5 DON对凋亡相关蛋白表达水平的影响 Figure 5 Effect of DON on apoptosis-related proteins
3 讨论

目前, DON的细胞毒性早已被证实, DON对细胞的毒性作用主要表现为引起细胞凋亡和细胞死亡。本试验选择PC12细胞建立体外神经细胞模型, 通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率, 荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达, Western-blot法分析凋亡相关蛋白的表达, 结果证明DON可诱导PC12细胞出现不同程度的凋亡, 为DON神经毒性的进一步研究奠定基础。

DON诱导细胞凋亡与毒素的浓度以及细胞的来源有关[8-9]。研究发现, 低浓度的DON主要引起细胞凋亡, 而高浓度的DON可引起细胞死亡[10-11]。本试验中, DON浓度在0~1 000 ng·mL-1时, 细胞凋亡率随DON浓度的增加而升高, 而在2 000 ng·mL-1时的细胞凋亡率低于1 000 ng·mL-1时的细胞凋亡率, 且死亡率明显升高。这种现象可能是因为高浓度DON诱导细胞死亡的速率大于细胞凋亡的速率。

Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一, 在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用[12]。线粒体途径被Bcl-2家族成员控制, 它是凋亡的监管中心, 通过上调或下调Bcl-2家族的表达, 以及通过其将信号级联放大, 从而控制凋亡。Bcl-2家族目前至少有25个成员, 主要包括抗凋亡基因(Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)以及平衡二者的基因[13-15]

Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白, 具有稳定线粒体膜完整性的功能, 从而抑制线粒体释放细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)和细胞色素C(cytochrome C, Cyt C)[16]。Bcl-2蛋白还与线粒体的PT通道有关, 能够抑制PT通道的开放, 从而阻止了Ca2+外流, 稳定线粒体膜电位[17]。Bax是Bcl-2家族的一员, 具有拮抗Bcl-2蛋白的作用, 是一种促凋亡蛋白, 又可与Bcl-2形成异二聚体抑制后者的抗凋亡效应[18]。Bax能够抑制线粒体释放AIF和Cyt C, 抑制凋亡蛋白酶的激活和维持钙稳态。因此Bax/Bcl-2在细胞凋亡中扮演着重要角色。Bid蛋白是Bcl-2家族的促凋亡蛋白, 可被Caspase 8酶切成具有活性的Bid蛋白, 进一步作用于线粒体, 导致线粒体中的Cyt C释放到胞浆中; Bid蛋白与Bax蛋白起协同作用, 引起Bax蛋白构象发生变化, 使其与线粒体紧密结合, 从而引起线粒体损伤[19-20]。因此, Bid蛋白使内外源凋亡通路联系起来[21]

正常情况下, Bcl-2 mRNA表达水平增强, 能有效抵抗细胞损伤和阻止凋亡信号传导。本试验发现, Bcl-2 mRNA表达水平随着DON浓度的升高而下降, 而Bax的趋势与之相反, 因而Bax/Bcl-2值增加; Bid的相对表达量随着DON浓度的增加而增加, 表现为抗细胞凋亡作用减弱, 促细胞凋亡作用增强。不同浓度的DON作用后, 不同时间PC12细胞中BaxBid mRNA表达与细胞凋亡的趋势一致, 而抗凋亡基因Bcl-2与PC12细胞凋亡的趋势相反, 说明了DON导致的PC12细胞凋亡与Bcl-2BaxBid的表达密切相关。

Caspase家族是一种半胱氨酸蛋白酶家族, 在细胞凋亡分子机制中起重要作用。Procaspase 9是没有活性的, 只有与Cyt C、Apaf-1、ATP、ADP结合成凋亡复合体才具备活性[22]。活化后的Caspase 9切割下游以酶原形式存在的Caspase 3, 使Caspase 3活化。激活的Caspase 3(cleaved-Caspase 3)能剪切LaminA, 使核纤维层断裂, 核酸边集浓缩, 发生细胞凋亡[23]。本试验结果显示, cleaved-Caspase 9和cleaved-Caspase 3蛋白表达量与对照组相比都明显增加, 这促使了PC12细胞向着细胞凋亡的方向发展。

综上所述, DON可改变PC12细胞的生长状态, 显著调节凋亡相关基因与蛋白的表达水平, 通过线粒体信号转导途径诱导PC12细胞凋亡, 为进一步研究DON的神经毒性提供了理论依据。

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