2-羟基-1, 4-萘醌(lawsone, 也称指甲花醌)被广泛用作医药原料药、橡胶防腐剂、除草剂原料、农药和染料中间体等^[1-3]。其在生产和使用过程中会通过动物排泄、废水排放等途径进入水体和土壤, 对环境产生危害, 对动植物生长和人类健康产生威胁^[4]。

含有2-羟基-1, 4-萘醌的废水常采用物理、化学方法处理, 但处理成本高且会带来二次污染。采用高效微生物降解菌处理该类废水具有成本低和环境友好等特点, 已成为目前的研究热点。目前, 仅有Wessendorf等^[5]研究发现一株恶臭假单胞菌L2能以2-羟基-1, 4-萘醌为碳源进行生长。

在采用高效降解菌进行生物强化处理时, 游离细菌因不易定殖和易受冲击等缺陷在实际应用中受到一定的限制。细胞固定化技术通过对微生物细胞起到保护作用, 从而避免细菌受到有毒化合物的影响, 使处理过程容易控制, 细胞流失减少^[6]。然而, 传统固定化技术(如海藻酸钠固定化技术)存在微生物细胞与基质间扩散阻力大、细胞活性易丧失、机械强度较差等缺陷^[7]。近年来, 越来越多的研究开始采用联合固定化技术来解决上述问题。Zhou等^[8]通过把降解苯酚的微生物固定到竹炭上对苯酚废水进行治理, 综合竹炭的吸附特性和细菌的生物降解特性, 取得较好的效果。Castorena等^[9]将咔唑降解菌IMP5GC固定在多孔玻璃圆筒表面, 可以使菌体在玻璃表面附着生长, 避免菌体流失。Manju等^[10]将硝化细菌固定到木屑上, 可以稳定去除水体中的硝酸盐并且增大细菌的耐盐性。与上述固定化基质材料相比, 生物炭(biochar)具有较大的比表面积、丰富的孔隙结构以及良好的吸附特性, 因此, 具有很好的应用前景^[11]。

本研究采用马尾松树干为原料, 高温制备生物炭, 并与海藻酸钠(SA)联合固定笔者所在实验室分离出的2-羟基-1, 4-萘醌降解菌株Pseudomonas taiwanensis LH-3来降解水中的2-羟基-1, 4-萘醌。我们比较了不同环境条件下联合固定化菌株和游离菌的降解性能, 考察联合固定化菌重复利用性能, 以及在SBR反应器中连续降解性能, 旨在为2-羟基-1, 4-萘醌的微生物降解实际工程化应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种来源

供试菌株为笔者所在实验室从农药厂废水处理池活性污泥中分离的2-羟基-1, 4-萘醌降解菌Pseudomonas taiwanensis LH-3。

1.1.2 培养基与试剂

LB液体培养基:蛋白胨10.0 g, NaCl 10.0 g, 酵母粉5.0 g, 去离子水1 L, pH7.0, 121 ℃灭菌20 min。无机盐培养基(MSM):NaCl 1.0 g, (NH₄)₂SO₄ 1.0 g, K₂HPO₄·3H₂O 1.5 g, KH₂PO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, 去离子水1 L, pH7.0, 121 ℃灭菌20 min。试剂:2-羟基-1, 4-萘醌(纯度98%, Aladdin), 海藻酸钠、无水氯化钙均为分析纯, 甲醇、甲酸为色谱纯。

1.1.3 生物炭的制备及结构性能表征

制备过程参照文献[12]:将洗净烘干后的马尾松树干(5 g)放入坩埚中, 压实密封, 放入马弗炉中, 以20 ℃·min^-1的升温速率加热至700 ℃, 恒温4.5 h后关闭马弗炉, 待生物炭自然冷却至室温后取出。将生物炭过1 mm筛并用去离子水洗涤数次, 在75 ℃下烘干24 h备用。采用元素分析仪(Flash EA 1112, Thermo Finnigan, Italy)测定生物炭元素含量, 包括碳(C)、氢(H)、氮(N), 通过差减法获得元素氧(O)含量。在Autosorb-1-C分析仪(Quantachrome Instruments, USA)上采用氮气吸附解吸方法测定生物炭比表面积。

1.2 试验方法 1.2.1 2-羟基-1, 4-萘醌含量的测定

采用高效液相色谱法测定2-羟基-1, 4-萘醌浓度, 具体测定条件为:岛津LC-20A高效液相色谱仪, Inertsil ODS-SP-C₁₈反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 2 μm)。流动相甲醇、水、甲酸(体积比为70 : 30 : 0.1), 流速为1 mL·min^-1, 紫外检测波长269 nm, 进样体积20 μL, 采用外标法按照峰面积定量^[13]。

1.2.2 种子液制备

采用岛津UV-1750紫外分光光度计进行细菌含量测定, 测定D₆₀₀值。种子液制备:菌株LH-3在LB液体培养基中于30 ℃、160 r·min^-1条件下培养至D₆₀₀=1.0, 12 000 r·min^-1离心3 min收集菌体, 用无菌水洗涤菌体, 离心3 min, 重复3次, 最后重悬于等体积的无菌水中作为种子液, 备用。

1.2.3 固定化小球的制备

在20 mL 20 g·L^-1的海藻酸钠(SA)溶液中, 按照2%(体积比)接种量接入新鲜的种子液(400 μL), 并加入50 mg生物炭充分混合24 h后, 用1 mL注射器将混合液逐滴加入到20 g·L^-1 CaCl₂溶液中, 在4 ℃条件下交联4 h, 制备成联合固定化小球(SA+biochar+bacteria), 用去离子水洗涤数次后备用^[14]。试验所得联合固定化小球直径为(4.0±0.2)mm。海藻酸钠+生物炭小球(SA+biochar)、海藻酸钠+菌小球(SA+bacteria)、海藻酸钠小球(SA)、游离菌(free bacteria)4组对照处理间除成分添加不同外, 制备步骤同上。

1.2.4 固定化小球结构性能测试

采用彼奥德SSA-4200型比表面积与孔径分析仪测定固定化小球比表面积并采用多点BET法计算比表面积。各固定化小球冷冻干燥后沿直径方向切开并在扫描电子显微镜(SEM, 日本电子株式会社)上观察微球切面的微观结构大小和表面特征^[15]。

1.2.5 联合固定化菌降解性能测试

将制备好的联合固定化菌以及4组对照处理样品分别加入到250 mL锥形瓶中, 分别向瓶中加入含200 mg·L^-1 2-羟基-1, 4-萘醌的100 mL无机盐培养基, 置于30 ℃恒温摇床160 r·min^-1振荡培养, 测定12 h内底物质量浓度随时间的变化情况。

1.2.6 联合固定化菌及游离菌在不同环境条件下对2-羟基-1, 4-萘醌降解的影响

在相同接菌量条件下分别测定联合固定化菌和游离菌在不同温度(15、20、25、30、35和40 ℃)、pH值(4、5、6、7、8、9和10)、初始质量浓度(100、200、300、400、500、600和800 mg·L^-1)以及浓度为0.1 mmol·L^-1重金属离子(Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Ag⁺)条件下培养12 h后的降解率, 每个处理重复3次。

1.2.7 联合固定化菌重复批量降解试验

在相同接菌量条件下比较联合固定化菌与海藻酸钠+菌对照处理含200 mg·L^-1 2-羟基-1, 4-萘醌的100 mL无机盐中的批量降解效果, 每个循环降解时间为12 h, 摇床温度为30 ℃, 转速160 r·min^-1。降解结束时将固定化菌从溶液中取出, 用生理盐水洗净后转移到新鲜的含相同浓度2-羟基-1, 4-萘醌的MSM液体培养基中, 再重复上述步骤。

1.2.8 SBR反应器中联合固定化菌与游离菌对2-羟基-1, 4-萘醌浓度耐受性能比较

采用序批式曝气的方式处理2-羟基-1, 4-萘醌废水。试验装置图如图 1所示, 反应器由有机玻璃制成, 筒体直径10 cm, 高40 cm, 总体积3.14 L, 有效容积3 L。2-羟基-1, 4-萘醌废水由反应器上部进入, 曝气由底部扩散装置实现, 出水通过反应器中部的出口收集。反应分2组同时进行, 向反应器1按0.4%接种量接入种子液12 mL, 反应器2加入含同样生物量的联合固定化菌, 开启水泵同时向2个反应器各注入3 L人工配水(2-羟基-1, 4-萘醌起始质量浓度400 mg·L^-1, (NH₄)₂SO₄ 1.0 g·L^-1, K₂HPO₄·3H₂O 1.5 g·L^-1, KH₂PO₄ 0.5 g·L^-1, MgSO₄·7H₂O 0.2 g·L^-1)。每个反应循环为24 h, 进水时间5 min, 好氧曝气时间23.5 h, 沉淀时间12 min, 出水时间3 min, 闲置时间10 min, 每隔24 h换水1.5 L, 反应温度为室温20 ℃。每4个循环提升1次进水浓度。

2 结果与分析 2.1 生物炭结构性能表征

马尾松树干生物炭比表面积为572.01 m²·g^-1, 孔体积大小为0.043 cm³·g^-1, 构成生物炭的主要元素C、H、O、N元素质量分数分别为90.3%、1.0%、8.7%和0.021%。

2.2 联合固定化小球结构性能测试结果

联合固定化小球和海藻酸钠+菌小球比表面积分别为22.26和4.02 m²·g^-1。扫描电镜结果(图 2)显示:与海藻酸钠小球相比, 海藻酸钠+生物炭小球表面粗糙。与海藻酸钠+菌小球相比, 联合固定小球菌体分布更加均匀, 细菌成团聚集在一起分布在小孔周围。

2.3 联合固定化菌降解性能测试结果

联合固定化菌以及4组对照处理在无机盐培养基中的降解情况如图 3所示。在最初2 h内, 联合固定化菌去除污染物的量与海藻酸钠+生物炭处理相同, 且明显高于海藻酸钠+菌处理, 因此这一阶段底物去除主要依靠生物炭的吸附作用。经过4 h的降解, 随着菌体活性增强, 联合固定化菌对水中底物的去除则依靠生物炭吸附和微生物降解的协同作用。经过6 h, 海藻酸钠+生物炭处理吸附达到饱和, 此后浓度随时间不再变化。此时联合固定化菌对底物去除大于海藻酸钠+生物炭处理与海藻酸钠+菌处理之和, 联合固定化菌降解速率达到最高。

2.4 不同环境因素对联合固定化菌和游离菌降解的影响

不同环境因素对联合固定化菌和游离菌降解影响结果表明:在极端pH(pH=4或10)条件下联合固定化菌仍能保持较高降解率(图 4-a), 这源于与游离菌相比, 海藻酸钠和生物炭对包埋菌体具有保护作用。当温度为15和40 ℃时, 游离菌降解率分别只有10%和34%, 而联合固定化菌可以达到20%和45%(图 4-b)。当底物浓度为600 mg·L^-1时联合固定化菌降解率仍有64%, 而游离菌只有5%(图 4-c)。当重金属离子浓度为0.1 mmol·L^-1时, 游离菌对金属离子Cd²⁺和Ag⁺很敏感, 降解率均不到20%, 而联合固定化菌仍然可以达到49%和34%(图 4-d)。因此, 联合固定化菌因其生物炭吸附和微生物降解联动作用, 对底物具有更好的去除效果, 且抵抗环境变化能力也更强。

2.5 联合固定化菌重复批量降解试验结果

从图 5可知:海藻酸钠+菌处理经过2个循环降解完成菌体的增殖和活性恢复, 到第3个循环降解率达到100%;第7个循环结束后, 海藻酸钠+菌处理出现膨胀变软并出现部分裂解的现象, 到第8个循环时降解速率减慢。与海藻酸钠+菌处理相比, 联合固定化菌在9个降解循环试验中始终保持降解性能稳定, 降解率均达到100%。

2.6 SBR反应器中联合固定化菌与游离菌对2-羟基-1, 4-萘醌浓度耐受性能比较

在20 ℃条件下, 2-羟基-1, 4-萘醌在2组SBR反应器中的去除效果如图 6所示:在系统连续运行的24 d内, 2-羟基-1, 4-萘醌起始质量浓度从200 mg·L^-1增加到1 200 mg·L^-1, 联合固定化菌降解效果稳定, 抗进水冲击负荷能力强, 对高浓度底物的耐受性强。投加联合固定化菌的反应器出水2-羟基-1, 4-萘醌质量浓度都在50 mg·L^-1以下, 且系统处于沉降阶段时上清液较清; 当系统运行到21~24 d, 进水2-羟基-1, 4-萘醌质量浓度提高到1 200 mg·L^-1时, 游离菌与联合固定化菌相比降解明显受到抑制, 出水2-羟基-1, 4-萘醌质量浓度大于900 mg·L^-1; 当系统运行到第24天, 出水2-羟基-1, 4-萘醌质量浓度增大到1 100 mg·L^-1, 系统失去对底物的降解能力。

3 结论与讨论

生物炭是生物质在缺氧或者厌氧的条件下, 在相对较低温度下(小于700 ℃)热解得到的富碳产物。其具有较高的比表面积和较好的孔隙结构并由于其廉价、环境友好等特点, 被广泛应用于土壤肥力改良及污染物修复等方面^[16]。生物炭的比表面积越大越有利于吸附的进行, 曾峥^[17]分别在300、400和500 ℃下用小麦秸秆制备生物炭, 结果发现随着制备温度的升高, 比表面积逐渐增大, 对磷的吸附量也逐渐增大。本研究采用马尾松树干制备生物炭, 制得的生物炭比表面积高达572 m²·g^-1, 孔体积为0.043 cm³·g^-1, 因此具有良好的微观结构。

细菌主要在固定化小球表面附着生长, 通过向固定化小球中添加所制备的马尾松树干生物炭, 可以增大联合固定化小球的比表面积从而有利于细菌在小球上的定殖, 增加联合固定化小球的微生物量。本研究中, 扫描电镜(SEM)结果也证明:添加生物炭可以使小球表面更粗糙, 从而更有利于细菌在其表面的附着。

联合固定化菌降解性能研究结果表明:与不添加生物炭的海藻酸钠+菌处理相比, 降解初始阶段联合固定化菌对底物去除主要依靠生物炭的吸附作用。随着细菌的活化, 微生物降解作用越来越显著, 使得联合固定化菌的吸附—降解—吸附过程源源不断进行, 从而大幅度提高降解速率。联合固定化菌可以充分发挥生物炭吸附和微生物降解的协同作用, 使降解速率大幅提高, 这与Qiao等^[18]通过竹炭固定吡啶降解菌观察到的现象类似。从全过程看游离菌降解速率始终小于联合固定化菌但大于海藻酸钠+菌处理, 这是由于海藻酸钠增大了底物和溶解氧向固定化菌内部的传质阻力, 但通过向海藻酸钠+菌处理中添加生物炭利用其表面丰富的空隙结构提高通透性, 加速菌与底物和氧的交换速率, 从而提高联合固定化菌的传质性能及菌体的活性^[19]。

本研究中, 培养基的初始pH、温度、底物起始浓度、重金属离子对联合固定化菌降解均有影响。当pH值为7~9时, 由于菌的生长受到抑制, 游离菌降解率迅速下降; pH值为4时, 游离菌降解率只有52%, 而此时联合固定化菌降解率仍有78%。温度超过或低于微生物生长的最适温度时, 菌株的生长代谢会受到影响, 酶的活性会降低, 从而引起对底物降解能力的降低。随着底物起始浓度的增加, 游离菌和联合固定化菌降解率都下降, 而高底物浓度对联合固定化菌降解影响较小, 这可能是由于生物炭对污染物的固定作用使得被包埋菌体表面的实际污染物浓度降低, 从而减少对包埋菌体的毒害作用。Liu等^[20]用竹炭固定Paracoccus sp.YF1去除水体中的硝酸盐时发现高浓度硝酸盐对固定化菌的抑制作用小于游离菌。游离菌对Cd²⁺、Ag⁺均较敏感, 降解率均低于20%, 而联合固定化菌对上述重金属的耐受性比游离菌强, 这可能是由于固定化载体形成保护屏障, 使内部包埋的细菌得以存活, 使固定化菌具有较高的抗毒物冲击能力, 对抑制剂的敏感性下降。Uchimiya等^[21]研究发现生物炭表面含有的大量含氧官能团会对重金属离子产生螯合作用, 对Cu²⁺、Pb⁺有强烈的吸附作用使其钝化在生物炭表面, 从而减少对微生物的毒害作用。联合固定化菌与游离菌相比, 在适应温度、pH范围以及耐受有害物质等方面具有较大的优势, 因此在应用上有更加广阔的前景。

综上所述, 在海藻酸钠固定化小球中添加生物炭增加了小球的比表面积和降解性能, 提高了固定化菌对外界环境变化的耐受性和固定化菌重复利用效率以及SBR反应器中的降解稳定性。本研究结果为用固定化微生物技术修复2-羟基-1, 4-萘醌污染水体的实际应用提供了理论依据和数据支持。