食物过敏对公众健康的影响已成为全球关注的公共卫生问题和食品安全问题。据统计,约90%的食物过敏反应主要是由常见的8种食物过敏原(大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、蛋类、鱼类和甲壳纲动物)引起^[1],而作为人类饮食中最重要的一类食物——肉类食物,其引起的过敏反应却相对少见。最近研究证实,肉类食物过敏可能是一种新的重要的食物安全问题,其过敏人群在食物过敏总人群中约占0.5%~8.0%^[2]。其中牛肉过敏尤其影响儿童健康,儿童过敏患病率为3.28%~6.52%,约占总人口的0.3%^[3]。现已证实引起牛肉过敏的主要过敏原是存在于血浆中的牛血清白蛋白(Bos d 6,相对分子质量为6.6×10³),由583个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在血浆中质量浓度为35~55 mg·mL^-1,约占血浆总蛋白的60%^[4]。此外,过敏原Bos d 6也是牛奶中的次要过敏原,美国有50%牛奶过敏患者对其过敏,且过敏原Bos d 6引起机体的过敏反应不受其他牛奶过敏原的影响^[5]。

为降低食物过敏对公众健康带来的风险和危害,研究者采用热处理^[6]、辐照^[7]、超声波^[8]、酶解^[9]等技术来降低或消除过敏原的抗原性,但均存在着脱敏效果不理想、对食品感官特性和营养成分有不同程度破坏等弊端^[10]。超高压作为一种新兴的食品加工技术,只作用于对生物大分子立体结构有贡献的氢键、离子键和疏水键等非共价键,使食品中的酶、蛋白质、核糖核酸和淀粉等改变活性、变性或糊化,同时杀死微生物,而食物的天然味道、风味和营养价值不受或受到很少影响^[11]。据报道,超高压技术还能够控制食物过敏原的抗原性,可通过不同程度地改变过敏原蛋白的空间结构,使过敏原抗原性发生变化甚至失活,从而达到降低或消除食品过敏原的目的^[10]。

尽管当前对食物过敏原的研究主要集中在食物过敏原成分的检测分析上^{[12, 13]},但是对食物过敏原抗原性与结构关系的研究却是建立高效、精确的食物过敏原检测技术的基础,也是研制低敏或脱敏食物的基础。我们以过敏原Bos d 6为研究对象,探讨超高压压力和温度对其抗原性的影响,并应用圆二色(circular dichroism,CD)光谱计算超高压协同温度处理后过敏原蛋白质二级结构的含量,推断其构象的变化,分析过敏原抗原性与蛋白质二级结构的变化关系,以初步阐明过敏原抗原性改变的蛋白结构变化机制,旨在为低敏或脱敏食物的开发提供新的思路和方法。

牛血清白蛋白(纯度≥98%)购于美国Sigma公司;鼠抗牛血清白蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG均购于美国Proteintech公司;四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)购于美国Promega公司;明胶购于美国Sigma公司;Tris-HCl缓冲液(1 mol·L^-1,pH7.0)购于北京雷根生物技术有限公司;KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、Na₂CO₃、NaHCO₃、NaCl、KCl、Tween-20和H₂SO₄等均为分析纯。

S-IL-100-850-9-W超高压处理系统购于英国SFP公司;Chriascan数字式圆二色光谱仪购于英国Applied Photophysics公司;iMark酶标仪购于美国Bio-Rad公司;PHS-2C精密酸度计购于上海雷磁仪器厂;96孔酶标板购于美国Corning Incorporated公司等。

10×PBS缓冲液(0.1 mol·L^-1,pH7.4):称取80 g NaCl、2 g KCl、2.58 g KH₂PO₄、29 g Na₂HPO₄·12H₂O,加蒸馏水至1 000 mL,抽滤,室温长期保存,用时取100 mL加900 mL蒸馏水配成1×PBS缓冲液;Tris-HCl缓冲液(2 mmol·L^-1,pH7.0);包被缓冲液(0.05 mol·L^-1碳酸盐缓冲液,pH₉.6):称取0.17 g Na₂CO₃、0.258 g NaHCO₃,加蒸馏水至100 mL,4 ℃保存;洗涤液(PBST,pH7.4):含0.05%(体积分数)Tween-20的0.01 mol·L^-1PBS(pH7.4);封闭液:含10 g·L^-1明胶的PBST(pH7.4),4 ℃保存;终止液(2 mol·L^-1 H₂SO₄):量取11.1 mL浓H₂SO₄,加入到80 mL蒸馏水中,冷却后,定容至100 mL。

称取200 mg过敏原Bos d 6标准品,加入20 mL去离子水中混合均匀,用尼龙真空袋密封包装后,立即进行超高压处理。压力分别设定为100、200、300、400、500和600 MPa 6个水平,温度分别设定为25、40和55 ℃ 3个水平,保压时间为10 min。每个处理设3个重复,另设常压(即0.1 MPa)对照组CK。超高压处理后样品立即冻干备用。

采用间接竞争ELISA方法测定过敏原Bos d 6抗原性,测定程序如下:1)抗原包被:用包被缓冲液将未处理抗原稀释至0.25 μg·mL^-1,加入酶标板,每孔100 μL,37 ℃包被2 h(或4 ℃包被过夜),弃包被缓冲液,用PBST洗涤5次,拍干;2)封闭:按每孔200 μL加入封闭液,室温封闭2 h,弃封闭液,用PBST洗涤5次,拍干;3)竞争结合:先将待测抗原(50 ng·mL^-1)加入酶标板,每孔 50 μL,再加入单克隆抗体(1∶32 000),每孔50 μL,室温竞争反应2 h,弃溶液,用PBST洗涤5次,拍干;4)加酶标二抗:加入HRP标记羊抗鼠IgG稀释至工作浓度(1∶10 000),每孔100 μL,室温反应1 h,弃溶液,用PBST洗涤5次,拍干;5)显色:加入TMB显色液,每孔100 μL,室温避光显色30 min,加终止液,每孔100 μL,立即用酶标仪在波长450 nm处测定吸光值(D值)。被测样品的抗原性大小可用抑制率表示,其值越小,表示抗原性越低。计算公式如下:

在室温条件下,分别将待测样品溶解在2 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液中,蛋白终质量浓度为0.05 mg·mL^-1。测试条件:样品槽厚度1 cm,光谱狭缝带宽1 nm,扫描波长范围190~260 nm,扫描速度1 nm·s^-1,光谱累计扫描3次,结果取平均值,并扫描缓冲液,扣除缓冲液信号。CD数据用CDNN4.1软件计算,氨基酸残基的平均分子质量按583计算。

使用Microcal Origin 7.5(Microcal Software 公司)软件分析数据并制图,数据分析采用SPSS 16.0软件进行方差分析(ANOVA,P<0.05)。试验3次重复,以均值±标准差(SD)表示。

如图 1所示:在温度为25 ℃时,过敏原Bos d 6抗原性在压力为常压至100 MPa时呈下降趋势,无显著性差异(P>0.05),但在压力高于100 MPa时,其抗原性显著低于对照组(P<0.05)。随着温度升高至40 ℃和55 ℃时,过敏原Bos d 6抗原性与对照组相比均随着压力的增大呈明显的下降趋势。此外,在同一压力条件下,随着温度的升高,过敏原抗原性的降低幅度较为明显,这表明超高压协同温度处理能有效降低过敏原Bos d 6的抗原性,与单纯的超高压处理相比,在协同温度的情况下,超高压对降低过敏原抗原性的效果更好。

	图 1 压力和温度对过敏原抗原性的影响 Fig. 1 Effects of pressure and temperature on the allergenicity of allergen Bos d 6
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如图 2所示:未处理的过敏原Bos d 6的CD光谱在208和222 nm处出现α-螺旋结构的2个特征吸收峰,吸收峰的强度可反映蛋白α-螺旋的含量。当压力和温度升高时,CD光谱中的过敏原Bos d 6两个负峰强度减弱,说明α-螺旋结构含量减小,这表明超高压协同温度处理改变了过敏原Bos d 6的二级结构。

	图 2 压力和温度对过敏原Bos d 6 CD光谱的影响 Fig. 2 Effects of pressure and temperature on CD spectra of allergen Bos d 6
图选项

采用CDNN4.1软件拟合计算出过敏原Bos d 6中各种二级结构的含量,结果(表 1)表明:未处理的过敏原Bos d 6的二级结构分别由α-螺旋(67.9%)、β-折叠(3.8%)、β-转角(11.9%)和无规卷曲(16.5%)组成,以α-螺旋为主。随着压力和温度的升高,其二级结构与对照组相比发生了较大的变化,主要表现为α-螺旋含量显著减少(P<0.05),而β-折叠、β-转角和无规卷曲等结构含量呈增加趋势,这表明过敏原蛋白质构象在作用后变得更为松散和伸展。此外,过少的α-螺旋构象也会影响蛋白质的氢键结构或其他结构而产生蛋白质结构的不可逆破坏。

如图 3所示:在温度为25、40和55 ℃时,随着压力的升高,过敏原Bos d 6二级结构中α-螺旋含量降低,其抗原性也随之降低。通过线性拟合分析分别建立两者之间关系模型,两者均呈现出极显著的正相关性(P<0.001),其相关系数R²分别为0.971、0.991和0.986。以上研究也进一步证实了过敏原Bos d 6抗原性与α-螺旋紧密相关,α-螺旋含量的变化将会引起蛋白质构象的改变,从而使其抗原性降低。

	图 3 压力协同温度处理后过敏原Bos d 6抗原性和α-螺旋含量的回归性分析 Fig. 3 Regression analysis between the α-helix content and the allergenicity of allergen Bos d 6 after the combined treatment of pressure and temperature
图选项

过敏原的抗原性、致敏稳定性及在IgE介导的过敏反应中抗原表位的确定与蛋白质结构有着重要的联系,尤其是高级结构对其抗原性起着关键作用^[14]。科学研究证实,超高压可促进过敏原蛋白质的降解、交联和分子构象的改变,降低蛋白质的热稳定性,破坏其抗原决定簇,导致过敏原抗原性的降低^[15]。据报道,150 MPa或更低压力就能破坏稳定蛋白质高级结构的弱作用(非共价键)^[16],而高于200 MPa压力可以通过破坏氢键来改变蛋白质的高级结构,导致蛋白质的非可逆变性,从而影响蛋白质功能特性^[17]。超高压处理除了可以降低食物过敏原的抗原性外,研究还发现超高压结合温度处理后,脱敏效果更佳。随着温度的升高,高温会减弱过敏原蛋白质的一些氢键、疏水键、离子键和静电相互作用,而超高压处理则能增强这种弱化作用的效果,使过敏原的蛋白质构象受到破坏,从而加速过敏原抗原性的降低^[18]。过敏原Bos d 6作为一种典型的球状蛋白,其二级结构中含有大量α-螺旋结构^[19],而α-螺旋在靠近192 nm有一正谱带,在208和222 nm 处有2个负的特征肩峰谱带^[20],因此通过拟合α-螺旋含量可大致得到蛋白质构象的变化情况。本试验结果表明:超高压处理可有效降低过敏原Bos d 6的抗原性和二级结构中α-螺旋含量,而超高压协同温度处理将加剧其抗原性和α-螺旋含量的下降,并且过敏原Bos d 6抗原性与α-螺旋含量密切相关,呈明显的正相关性。由此推测,超高压处理导致的α-螺旋含量下降等情况可引发过敏原Bos d 6蛋白质分子立体构象的改变,使其抗原决定簇被掩盖或破坏,而这种变化可能是导致过敏原抗原性降低的重要原因,而且温度变化对过敏原抗原性的协同影响也非常明显。因此,该技术在降低或消除食物过敏原方面具有巨大潜力,有望为低敏或脱敏食物的开发提供一条新的探索途径。