富硒乳酸菌对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤的保护作用

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201511003

文章信息

苏华健, 陈雨晴, 李晓萱, 刘云欢, 刘晴, 黄克和

SU Huajian, CHEN Yuqing, LI Xiaoxuan, LIU Yunhuan, LIU Qing, HUANG Kehe

Protective effects of selenium-enriched lactobacillus on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats

南京农业大学学报, 2016, 39(4): 661-667

Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(4): 661-667.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201511003

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收稿日期：2015-11-03

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苏华健, 陈雨晴, 李晓萱, 刘云欢, 刘晴, 黄克和. 富硒乳酸菌对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤的保护作用[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(4): 661-667. 复制到剪切板

SU Huajian, CHEN Yuqing, LI Xiaoxuan, LIU Yunhuan, LIU Qing, HUANG Kehe. Protective effects of selenium-enriched lactobacillus on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(4): 661-667. DOI: 10.7685/jnau.201511003. 复制到剪切板

富硒乳酸菌对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤的保护作用

苏华健, 陈雨晴, 李晓萱, 刘云欢, 刘晴, 黄克和

南京农业大学动物医学院, 江苏南京 210095

收稿日期：2015-11-03

基金项目：国家自然科学基金项目(31472253);国家大学生创新实验计划项目(201410307043)

作者简介：苏华健,本科生。

通信作者：黄克和,教授,博导,从事动物营养免疫学和营养代谢病的研究,E-mail:khhuang@njau.edu.cn。

摘要：[目的] 本试验旨在探讨富硒乳酸菌(SL)对四氯化碳(CCl₄)诱导肝脏纤维化大鼠的保护作用。[方法] 首先制备富硒乳酸菌,然后用CCl₄诱导建立大鼠慢性肝损伤模型。应用HE染色、天狼星红染色进行病理分析,应用自动生化分析仪测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性,通过Real-time PCR法测定Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)及炎症相关基因的表达水平。[结果] SL显著降低了CCl₄诱导肝纤维化大鼠的血清ALT(87.3 U·L^-1)、AST(98 U·L^-1)活性和MDA(2.42 nmol·mg^-1)含量(P＜0.05),但增加了GSH-Px(37.9 U·mg^-1)、SOD(202 U·mg^-1)活性和GSH(3.36 mg·g^-1)含量(P＜0.05)。SL抑制了CCl₄诱导的肝脏炎症和坏死。此外,SL显著降低了CCl₄诱导肝损伤大鼠的α-SMA、CollagenⅠ、转化生长因子(TGF-β1)、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)及炎症相关基因的表达(P＜0.05)。[结论] SL通过缓解肝脏氧化应激,降低肝内炎症反应来保护CCl₄诱导的肝脏纤维化。

关键词：富硒乳酸菌肝纤维化氧化应激炎症

Protective effects of selenium-enriched lactobacillus on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats

SU Huajian, CHEN Yuqing, LI Xiaoxuan, LIU Yunhuan, LIU Qing, HUANG Kehe

College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: [Objectives] The aim of this study was to investigate the effects of selenium-enriched lactobacillus (SL) on the liver fibrosis induced by CCl₄ in rats.[Methods] First,the selenium-enriched lactobacillus were prepared,then the rat model of chronic liver injury was established. The liver pathological condition was analyzed by HE staining and Sirus red stain. The activities of ALT and AST in the rat serum was determined by automatic biochemical analyzer. The expressions of CollagenⅠ,α-SMA and inflammation-related genes were determined by Real-time PCR.[Results] SL significantly decreased serum ALT(87.3 U·L^-1),AST(98 U·L^-1) activities and MDA(2.42 nmol·mg^-1) content(P＜0.05),but increased GSH-Px(37.9 U·mg^-1),SOD(202 U·mg^-1) activities and GSH(3.36 mg·g^-1) content(P＜0.05) in rats treated with CCl₄. SL suppressed hepatic inflammation and necrosis induced by CCl₄. Moreover,SL significantly reduced the expressions of α-smooth muscle actin(α-SMA),CollagenⅠ,TGF-β1,TIMP-1,and inflammation-related genes(P＜0.05) in rats treated with CCl₄.[Conclusions] SL could protect the liver from carbon tetrachloride-induced liver fibrosis by attenuating hepatic oxidative stress and suppressing hepatic inflammation.

Keywords: selenium-enriched lactobacillus hepatic fibrosis oxidative stress inflammation

肝纤维化是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的修复反应^[1],是肝硬化的早期阶段。因此,预防纤维化是动物和人肝病治疗的主要目标之一。一些研究表明,减少肝内氧化应激有助于改善肝纤维化^[2]。因此,自由基清除剂和抗氧化剂已成为抗纤维化有效的制剂。目前,肝纤维化的治疗方法主要包括去除病因、抑制炎症和宿主免疫反应、抑制肝星状细胞(HSC)活化、减少肝细胞外基质(ECM)产生等^[3],目的是减轻炎细胞炎症坏死及纤维化,从而延缓疾病进展。

大量研究证明,硒和乳酸菌都具有抗氧化、抗炎症和抗纤维化的作用^{[4, 5]},而且具有药理作用明确、生物利用度高、毒性小等特点^{[6, 7]}。富硒乳酸菌中的硒主要以硒蛋氨酸形式存在,这样就克服了无机硒难吸收且治疗剂量与中毒剂量相近的弊端。

迄今为止,很少见到有关富硒乳酸菌对大鼠肝损伤保护作用与机制的研究报道。长期注射四氯化碳可诱发大鼠的慢性肝损伤,是一个目前普遍使用的诱导肝纤维化模型的方法。本研究主要是探究富硒乳酸菌对四氯化碳诱导的肝纤维化的作用,并对其相关机制进行探讨,为动物和人肝病的防治提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试剂

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),总蛋白测定试剂盒(南京碧云天公司),α-SMA单克隆抗体(英国剑桥Abcam公司),CCl₄(南京寿德研究所)。

1.2 富硒乳酸菌的制备

用YPD培养基活化菌种48 h后制备发酵种子液体,18 h后转入20 L发酵罐进行扩大生产。于发酵12 h后补加亚硒酸钠10 mg·L^-1,共发酵48 h,获得富硒乳酸菌产物。富硒乳酸菌产物中乳酸菌菌落数约为10¹¹ mL^-1,其中硒含量为10.0 μg·mL^-1,且90%以上以有机硒形式存在。

1.3 动物饲养

从扬州大学实验动物中心购买40只雄性Wistar大鼠,质量(200±20)g。将大鼠圈养在受控条件下,温度在(25±2)℃,12 h/12 h的光/暗循环。将大鼠适应环境1周以上后使用。在基础日粮中的硒含量为0.05 mg·kg^-1。将基础日粮磨成粉,分别将亚硒酸钠(SS)、乳酸菌(L)和富硒乳酸菌(SL)加入基础日粮混合使日粮中总硒含量为0.3 mg·g^-1,得到3种不同的日粮(L、SS和SL日粮),在SL和L日粮中存活的微生物细胞数为10⁹ CFU·g^-1。

1.4 试验方法

40只雄性Wistar大鼠随机分为5组,每组8只。分组如下:对照组、CCl₄组、CCl₄+L组、CCl₄+SS组和CCl₄+SL组。对照组:饲喂基础日粮,腹腔注射(2 mL·kg^-1)橄榄油,每周2次,连续8周;其余4组:分别饲喂基础日粮、L日粮、SS日粮、SL日粮,同时腹腔注射1 mL·kg^-1 CCl₄+1 mL·kg^-1橄榄油,每周2次,连续8周。

试验期间,未见老鼠死亡。8周后取血液和肝脏样品,一部分保存于10%(体积分数)福尔马林中用于制备病理切片,另一部分存储于-70 ℃备用。

1.5 血清中酶活性分析

将血液在4 ℃、5 000 g下离心5 min,分离血清,用自动生化分析仪测定血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性。

1.6 肝组织中GSH-Px、SOD活性和GSH、MDA含量的测定

肝脏样品称质量后加入9倍体积冷的缓冲液(1 mmol·L^-1 EDTA,0.32 mol·L^-1蔗糖和10 mL·L^-1 Tris-HCl,pH7.4)制成匀浆。将匀浆在5 000 g离心5 min。用试剂盒分别测定GSH-Px、SOD活性和GSH、MDA含量。

1.7 组织病理学检查

将在10%福尔马林中固定的大鼠肝脏样品进行切片后分别用苏木精-伊红(HE)和天狼星红染色、制片,显微镜下观察肝细胞的变性、炎症浸润、胶原纤维沉积程度等组织形态变化。

1.8 RNA提取和Real-time PCR分析

肝脏组织的RNA提取和cDNA的合成参照文献^[8]进行。用Primer Premier 5.0设计引物(表 1),用β-actin作内参,应用ABI 7300荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)进行Real-time PCR反应,测定相关基因表达。

表 1 Real-time PCR的引物对序列 Table 1 Primer pairs sequences for Real-time PCR

目的基因 Target gene	引物对序列(5′→3′) Primer pairs sequence
Collagen Ⅰ	TGCCGTGACCTCAAGATGTGCC/CATCCACAAGCGTGCTGTAGGTG
α-SMA	CTGGAGAAGAGCTACGAACTGC/CTGATCCACATCTGCTGGAAGG
TGF-β1	CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC/CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC
TNF-α	ATGAGCACAGAAAGCATGATC/TACAGGCTTGTCACTCGAATT
IL-6	CTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG/TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCC
MCP-1	GTCACGCTTCTGGGCCTGT/GTGCTTGAGGTGGTTGTGGA
TIMP1	GCATCTGGCATCCTCTTGTT/AAGAAGCTGCAGGCATTGAT
β-actin	CTATCGGCAATGAGCGGTTCC/TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG

表选项

1.9 统计分析

应用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。试验结果均表示为平均值±标准差(x±SD)。用Duncan′s法进行单因素方差分析(ANOVA)和多重比较。

2 结果与分析 2.1 SL对大鼠生长及肝功能的影响

由表 2中可见:在体质量上,与对照组相比,CCl₄组体质量显著减少(P<0.05);L、SS或SL组与CCl₄组相比体质量显著增加(P<0.05),但SS和L组间大鼠体质量差异不显著;SL与SS或L组相比体质量显著增加(P<0.05)。在肝质量上:与对照组相比,CCl₄组的肝质量显著增加(P<0.05);L、SS或SL组与CCl₄组相比肝质量显著减少(P<0.05),但L、SS和SL组间肝质量无显著差异。在肝指数上:与对照组相比,CCl₄组的肝指数显著升高;L、SS或SL组与CCl₄组相比,肝指数显著降低(P<0.05),但SS和L组间肝指数差异不显著;SL组与SS或L组相比,肝指数显著下降(P<0.05)。此外,与对照组相比,CCl₄组中血清ALT和AST活性显著增加(P<0.05);L、SS或SL组与CCl₄组相比,血清ALT和AST活性显著下降(P<0.05),但SS和L组间血清ALT和AST活性差异不显著;SL组与SS或L组相比,血清ALT和AST活性显著下降(P<0.05)。

表 2 富硒乳酸菌(SL)对大鼠体质量、肝质量、肝指数以及生化指标的影响(n=8) Table 2 Effects of selenium-enriched lactobacillus(SL)on the body weight,liver weight,liver index and biochemical parameters of rat

项目Item	试验分组 Test group
项目Item	Control	CCl₄	CCl₄+L	CCl₄+SS	CCl₄+SL
体质量/g Body weight	335±2.31^a	305±9.54^d	322±4.19^c	323±3.07^c	325±3.69^b
肝质量/g Liver weight	13.8±0.53^c	16.7±1.08^a	15.9±0.31^b	15.8±0.87^b	15.2±0.63^b
肝指数/% Liver index	4.12±0.23^d	5.48±0.11^a	4.94±0.07^b	4.89±0.28^b	4.68±0.17^c
ALT活性/(U·L^-1) ALT activity	45.6±2.53^d	166.0±5.25^a	108.0±3.31^b	111.0±4.29^b	87.3±1.56^c
AST活性/(U·L^-1) AST activity	73.3±1.18^d	136±5.26^a	115±4.32^b	112±4.01^b	98±3.03^c
注:1)ALT:丙氨酸氨基转移酶Alamine aminotransferase;AST:天冬氨酸氨基转移酶Aspartate aminotransferase。2)同行数据上标不同小写字母表示各组间差异显著(P<0.05)。Different letters above the values within each test parameter indicate significant differences between groups(P<0.05).

表选项

2.2 SL对肝组织中组织病理学变化的影响

HE染色下,对照组的肝脏切片显示正常肝小叶结构和细胞结构(图 1-A);CCl₄组有许多纤维隔开的微结节,表现肝脏的炎症和肝细胞的坏死(图 1-B);L和SS组表现为中等程度的炎症和坏死(图 1-C,D);SL组显著降低由CCl₄诱导的肝脏炎症和肝细胞的坏死(图 1-E)。

	图 1 HE染色的大鼠肝细胞 Fig. 1 Liver cell of rat sections stained with HE A:对照组Control group;B:CCl₄ 组CCl₄ group;C:CCl₄+L组CCl₄+L group;D:CCl₄+SS组CCl₄+SS group;E:CCl₄+SL组CCl₄+SL group
图选项

2.3 SL对胶原积累的肝组织的影响

用天狼星红染色检测肝脏样品中胶原的沉积量。与对照组(图 2-A)相比,CCl₄组(图 2-B)的肝组织表现出明显的红染色的纤维间隔;L和SS组(图 2-C,D)肝纤维化程度较CCl₄组减轻;SL组(图 2-E)肝纤维化程度较CCl₄组明显减轻。

	图 2 天狼星红染色大鼠肝细胞 Fig. 2 Liver cells of rat sections stained with Sirius red A:对照组Control group;B:CCl₄组CCl₄ group;C:CCl₄+L组CCl₄+L group;D:CCl₄+SS组CCl₄+SS group;E:CCl₄+SL组CCl₄+SL group
图选项

2.4 SL对大鼠肝组织的GSH和MDA含量及GSH-Px和SOD活性的影响

如图 3所示:与对照组相比,CCl₄组谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05)。与CCl₄组相比,L、SS和SL组GSH-Px活性均显著升高(P<0.05)。而SS组与L组相比,GSH-Px活性差异不显著。SL组与SS和L组相比,GSH-Px活性显著增加(P<0.05)。CCl₄组SOD活性显著低于对照组(P<0.05)。与CCl₄组相比,L、SS或SL组SOD活性显著升高(P<0.05)。SS和L组间SOD活性差异不显著。与L或SS组相比,SL组SOD活性显著增加(P<0.05)。与对照组相比,CCl₄组GSH含量显著降低(P<0.05)。与CCl₄组相比,L、SS或SL组中的GSH含量显著升高(P<0.05),但L和SS组间的GSH含量差异不显著。与L或SS组比较,SL组的GSH含量表现进一步增加(P<0.05)。与对照组相比,CCl₄组的MDA含量显著升高(P<0.05)。与CCl₄组相比,MDA在L组、SS组或SL组中的含量明显下降(P<0.05)。然而,SS和L组之间MDA含量差异不显著。与SS或L组相比,SL组的MDA含量显著下降(P<0.05)。

	图 3 SL对大鼠肝细胞GSH-Px和SOD活性及GSH和MDA含量的影响 Fig. 3 Effects of SL on GSH-Px,SOD activities,and GSH,MDA contents in liver of rat 标注不同字母者表示差异显著(P<0.05,n=8)。Columns with different letters differ significantly(P<0.05,n=8).
图选项

2.5 SL对大鼠肝组织中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和TIMP-1基因表达的影响

由图 4可见:与对照组相比较,CCl₄组中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和TIMP-1的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。与CCl₄组相比,L、SS或SL组的这些基因mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),但在SS和L组之间这些基因的mRNA表达水平差异不显著。SL组与SS或L组相比,这些基因的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。

	图 4 Real-time PCR分析大鼠肝脏中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达水平 Fig. 4 The mRNA expression levels of α-SMA,CollagenⅠ,TGF-β1 and TIMP-1 in liver of rat detected by Real-time PCR
图选项

2.6 SL对大鼠肝组织炎症反应相关基因表达的影响

为了确定SL是否能抑制由CCl₄诱导的炎症,本试验检测了肝组织中TNF-α、IL-6和MCP-1基因的表达。如图 5所示:与对照组相比,CCl₄组TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著度升高(P<0.05),但是与CCl₄组相比较,这些炎症相关基因在L、SS或SL组的mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。在SS和L组之间的TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平没有差异。与SS或L组相比,SL组这些炎症相关基因的表达水平进一步下降(P<0.05)。

	图 5 大鼠肝脏中TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA表达水平 Fig. 5 The mRNA expression levels of TNF-α,IL-6 and MCP-1 in liver of rat detected by Real-time PCR
图选项

3 讨论

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,由不同的机制诱导,包括病毒感染、外源物的损害及一些遗传性疾病^{[8, 9]}。目前,迫切需要寻找一些低毒高效的产品来防治肝纤维化^[10]。研究表明,在饲料中补充硒可以改善CCl₄诱导的肝纤维化^{[11, 12]},而最近的一项研究表明益生菌有利于治疗慢性肝病^[13]。富硒乳酸菌(SL)产品具有有机硒和乳酸菌的组合效应。本试验结果表明,SL比单独的硒或乳酸菌能更有效地降低CCl₄引起的大鼠肝损伤。该结果对防治动物和人的肝纤维化具有重要意义。

血清中ALT和AST活性是公认的肝损伤指标。试验结果表明,CCl₄诱导肝损伤的大鼠中,ALT和AST活性升高,表示有严重的肝细胞损伤;而补充SL能显著降低血清中ALT和AST活性,说明SL能减少CCl₄诱导的大鼠肝损伤。

组织学研究结果表明,CCl₄组大鼠肝的正常小叶结构被破坏,并形成假小叶。胶原蛋白的表达也在CCl₄组的大鼠上明显增加。肝纤维化是肝细胞外基质(ECM)在肝脏逐步沉积所导致^[14],表达胶原是纤维组织细胞外基质的主要成分。SL能有效减少胶原的含量,表明SL可以改善CCl₄诱导的肝纤维化。

氧化应激在肝纤维化过程中起主要作用^[15]。早期的研究显示,CCl₄诱导肝损伤的大鼠肝脏GSH-Px、SOD活性和GSH含量下降,而MDA含量升高^[16]。以前的研究表明,饮食中补充富硒益生菌后,小鼠、仔猪和奶牛的GSH-Px、SOD活性和GSH含量有所提高^{[17, 18, 19]}。本研究发现与CCl₄组大鼠相比,补充SL显著提高了GSH-Px和SOD活性和GSH含量,且显著降低肝脏中MDA含量。除此以外,氧化应激,尤其脂质过氧化应激,可诱导胶原合成加剧肝纤维化^[20]。因此,SL减少ECM含量的原因可能是它的抗氧化能力。

现已证明,肝星状细胞(HSC)在肝纤维化发展中发挥着关键作用^[21]。机体在氧化应激状态时产生的自由基可以使肝细胞损伤,通过一系列的反应激活HSC,使ECM大量沉积,导致肝纤维化发生。从本研究结果看,CCl₄的使用明显增加了CollagenⅠ、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达水平,SL的添加显著降低了这些基因的表达。本试验结果表明:添加SL抑制了HSC的活化,从而降低了ECM在大鼠肝脏中的沉积。

炎症反应在肝纤维化的发生和发展中起着至关重要的作用^[22]。枯否氏细胞和单核细胞受到刺激能产生炎性细胞因子,包括TNF-α和IL-6。此外,炎性细胞通过分泌细胞因子,尤其MCP-1和TGF-β1来调节HSC活化和ECM沉积^{[13, 23]}。在活化的肝星状细胞中,MCP-1的表达水平很高。MCP-1在激活炎性细胞中起关键作用,而TGF-β1已被视为介导肝纤维化的关键细胞因子^{[13, 24]}。本研究结果表明,与CCl₄组大鼠相比,SL可以降低血浆TNF-α水平,而补充SL可以显著降低肝脏炎性细胞因子相关基因的表达。因此,SL降低CCl₄诱导的肝纤维化的潜在机制也可能与抑制炎症反应有关。

综上,补充SL能有效地减轻CCl₄引起的肝损伤和纤维化,其机制可能是减少了肝内的氧化应激,抑制肝脏炎症发生以及抑制肝星状细胞的活化。因此,SL或可被开发成一种预防肝纤维化的食品或饲料添加剂。

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