配合饲料中营养物质不平衡,尤其是3大能量物质供能比例失衡,例如高脂肪饲料^[1]、高蛋白饲料^[2]、高碳水化合物饲料^[3],以及低抗脂因子饲料^[4],饲料原料如脂肪源^{[5, 6]}、蛋白源^[7]等选择不当等,均可导致脂质在鱼体内脏中过度蓄积,引起肝脏脂肪过量蓄积,并损害鱼类健康。

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是中国的大宗淡水养殖鱼类,2013年中国草鱼年产量已达到506.99万t^[8]。草鱼在配合饲料养殖模式下,由于饲料营养素水平设计不合理以及饲料原料选择不当等,容易导致脂肪肝^{[9, 10, 11]}。目前,有关草鱼肝脂过量蓄积的营养因素研究得比较多,但有关草鱼肝脂过量蓄积评价指标的研究较少,可供参考的资料还比较欠缺。构建可供参考的草鱼肝脂过量蓄积评价指标是草鱼肝脂过量蓄积发生的生理生化机制、分子机制、诊断与预防等系列研究的基础,也是草鱼健康养殖和可持续发展等的需要。

2013年5月至2014年5月于湖南省常德市东江乡、安乡县安宏乡、汉寿县三和乡、西洞庭县祝丰乡等地(表 1)采集草料养殖草鱼75尾,配合饲料养殖草鱼170尾;2013年5至7月、2013年8至10月、2013年11月至2014年1月、2014年2至5月分别采集草鱼56、62、68和59尾。试验草鱼均为可上市成鱼,且体表正常、完整,游动正常,平均体质量(1 317.60±331.26)g,平均体长(41.16±3.46)cm。

5417R型高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;日立7180型全自动生化分析仪,日立(中国)有限公司;LGJ-10型真空冷冻干燥机,河南兄弟仪器设备有限公司;YD-335型半自动石蜡切片机,上海之信仪器有限公司;2XC2 XSP-2C摄影生物显微镜,上海光学仪器六厂;索氏脂肪提取器、恒温水浴锅、DW-86L386型超低温冰箱,上海天放实验仪器有限公司;Gel Doc XR+型凝胶成像系统、SmartSpec Plus型核酸蛋白测定仪、Miniopticon型荧光实时定量PCR仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;ABI-9700型普通PCR仪,北京百金泰生物科技有限公司。

试验草鱼先用丁香酚(50 mg·L^-1)麻醉,再称取体质量,测量体长。尾静脉采血后,解剖草鱼,依次分离内脏、肝胰脏和肠系膜脂肪,并分别称质量。根据以下公式计算各项形体指标:肥满度(CF)(g·cm^-3)=体质量(g)/体长(cm³);脏体指数(VSI)=内脏质量(g)/体质量(g)×100%;肝体指数(HSI)=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%;肠系膜脂肪指数(MFI)=肠系膜脂肪质量(g)/体质量(g)×100%。

用5 mL一次性无菌注射器尾静脉采集血液于真空采血管中,室温放置45 min,4 ℃、3 500 r·min^-1离心10 min以分离血清,所得血清立即送往常德市力源医学检测中心,参照刘猛等^[12]及人体肝脏功能相关医学指标,用全自动生化分析仪测定以下23项生化指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、转氨酶比(AST/ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(GLU)、血清前白蛋白(PAB)。胆碱酯酶(CHE)活性则采用干化学法测定。为减少检测误差,每尾鱼各血液指标均重复测定3次,结果以平均值表示。

从距离草鱼肝脏大叶边缘1 cm处采集1 cm³大小肝脏组织,立即置于Bouins′液中,固定48 h。参照袁广明等^[13]的方法,采用苏木精-伊红(HE)染色法制作草鱼肝胰脏组织切片,于显微镜下观察并拍照。

详细记录草鱼肝胰脏颜色。参照GB 5009.3—2010,采用减压干燥法测定草鱼肝胰脏水分含量。参照GB/T 9695.7—2008,采用索氏抽取法测定草鱼肝胰脏中粗脂肪,即肝脂含量。

每尾草鱼各取肝胰脏组织约50 mg,用锡铂纸包好,立即置于液氮中速冻,再于-70 ℃超低温冰箱中保存。根据肝脂测定结果及“3σ”法则所确定的肝脂正常值以及肝脂轻度、中度和重度蓄积参考范围值,依次选择正常肝脂和肝脂轻度、中度、重度蓄积样品各12份用于总RNA提取。采用北京索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂提取草鱼肝胰脏总RNA,用普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。由生工生物工程(上海)股份有限公司设计与合成β-actin、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、14 载脂蛋白(14 kDa apolipoprotein,APO-14)以及激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL)基因引物(表 2)。用天根生化科技有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)(With gDNase)合成cDNA第一链。以β-actin基因为内参基因,按伯乐生命医学产品(上海)有限公司的荧光定量试剂盒(iTaq^TM Universal SYBR® Green Supermix)操作说明进行荧光定量PCR,以检测脂质分解相关酶基因的mRNA相对表达量。

参照Lin等^[9]的标准,以肝脂含量低于5%的草鱼为正常肝脂草鱼。肝脂含量高于5%的草鱼为肝胰脏脂肪过量蓄积草鱼。根据正常肝脂草鱼各项指标实测值,采用SPSS 19.0软件制作各项指标的频率分布图,并采用Kolmogorov-Smirnov Z(K-S)检验法对各项指标的正态分布进行检验,当P值大于0.05,表示被检指标呈显著正态分布。参照刘猛等^[12]的方法,结合“3σ”法则^[14],取不同指标在68.26%置信区间范围值作为草鱼各指标正常参考值范围。从肝胰脏脂肪过量蓄积草鱼各项指标中初步筛选出高于参考值上限的指标作为草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积评价指标。采用SPSS 19.0软件制作各项评价指标的频率分布图,并采用K-S检验法对各项评价指标的正态分布进行检验,当P值大于0.05,表示被检指标呈显著正态分布。根据“3σ”法则^[14],依次选取各指标参考值上限至68.27% 置信区间下限值、68.27% 置信区间值,以及高于68.27%置信区间上限值作为评价草鱼肝胰脏脂肪轻度、中度以及重度蓄积参考值范围。

245尾草鱼中,共有70尾草鱼肝脂含量低于5%。肝脂含量低于5%的草鱼体形相对细长,腹部一般不膨大,体表富有光泽。K-S检验结果表明,肝脂低于5%的草鱼其肥满度、脏体指数、肝体指数、肠系脂肪指数均呈显著正态分布(P>0.05)。各形体指标正常范围值见表 3。肝脂含量大于5%的肝脂过量蓄积草鱼一般腹部比较膨大,体形大多肥胖。肝脂过量蓄积草鱼CF、VSI、HSI及MFI平均值均明显高于参考值上限(表 3),可初步确定为草鱼肝脂过量蓄积评价指标。

肝脂含量低于5%的草鱼血清10项肝功能指标中,除A/G不呈显著正态分布(P<0.05)以外,草鱼ALT、AST、AST/ALT、TP、ALB、GLO、TBIL、DBIL、IBIL 9项指标均显著呈正态分布(P>0.05);血清肾功能指标(BUN、CREA、UA)、血脂四项指标(CHOL、TG、HDL、LDL)、血糖(GLU),血清GGT、ALP、TBA、CHE,以及PAB均呈显著正态分布(P>0.05);根据肝脂含量低于5%的草鱼各血清生化指标所确定的正常参考值见表 4。肝脂含量高于5%的肝脂过量蓄积草鱼血清23项生化指标中除ALT、AST、AST/ALT、TBIL、IBIL、ALP、CHOL、LPL、GLU等几项指标的平均值高于相应参考值以外,其余血清生化指标的平均值均在参考值范围内(表 4)。初步确定草鱼血清ALT、AST、TBIL、IBIL、ALP、CHOL、LPL、GLU等为草鱼肝脂过量蓄积间接评价指标。

解剖发现肝脂含量低于5%的草鱼肝胰脏颜色绝大多数呈暗红色,颜色分布均匀;极少数肝胰脏呈现绿色;肝胰脏富有弹性,表面光滑,边缘较薄且轮廓清晰。肠系膜脂肪较少,肠管清晰可见。草鱼肝胰脏水分及肝脂含量均呈显著正态分布(P>0.05,表 5),其正常范围值分别为77.07%~79.97% 和3.02%~4.60%,即肝脂肪含量高于4.60%的草鱼可初步确定为肝脂过量蓄积草鱼。245尾草鱼中,肝脂含量小于3.02%、3.02%~4.60%、大于4.60% 的草鱼分别为11、48和186尾。其中,75尾草料养殖草鱼中,肝脂含量小于 3.02%、3.02%~4.60%、大于 4.60% 的草鱼分别为11、48和16尾,分别占草料养殖草鱼总数的14.67%、64%和21.33%。肝胰脏组织学观察发现肝脂含量低于5%的草鱼其肝细胞呈肝细胞索排列,轮廓清晰,细胞大小比较均匀,细胞核大多位于细胞中央,无明显脂肪空泡(图 1-A、B、C、D)。肝脂含量高于5%的肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏呈现暗红、苍白、花色及绿色4种颜色,其中以苍白肝所占比例最大,暗红肝其次,花肝及绿肝比例较低。肝胰脏表面光滑,边缘较厚,质地偏软且易碎,肠系膜脂肪多,肠管完全被肠系膜脂肪覆盖(图 2)。肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏水分明显低于参考值,而脂质含量则明显高于参考值(表 5),表明肝胰脏脂质蓄积比较严重。经肝胰脏组织学观察,发现不同肝脂蓄积程度草鱼肝细胞大小不均匀,细胞核大多位于细胞的一侧,部分细胞的细胞核溶解消失,脂肪空泡随肝脂蓄积程度增加而增加(图 1-E、F、G、H)。

图 1 正常肝脂草鱼与肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏组织切片(×400) Fig. 1 Histologh of normal lipid and excessive lipid accumulation hepatopancreas of grass carp A、B、C、D为正常肝脂含量(3.02%~4.06%)草鱼肝胰脏切片,无明显脂肪空泡;E、F、G、H为肝脂含量分别为6%、8%、12%、15%的肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏切片,图中箭头所指为脂肪空泡,随着肝脂含量增加,组织切片中脂肪空泡数量增加。 A,B,C,D are normal lipid(3.02%-4.06%)hepatopancreas of grass carp,and there is no obvious fat vacuole in these hepatopancreas tissues. E,F,G,H are excessive lipid accumulation hepatopancreas of grass carp,with hepatopancreas lipid 6%,8%,12% and 15%,respectively. Arrows in the figure refer to fat vacuoles;Fat vacuoles increased with the increase of hepatopancreas lipid content.

图选项

	图 2 肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏(↑) Fig. 2 Different hepatopancreas colors of grass carp with excessive lipid in the hepatopancreas(↑) A.暗红肝Normal red hepatopancreas;B.苍白肝Yellow and white hepatopancreas;C.绿肝Green hepatopancreas;D.花肝White spots hepatopancreas
图选项

除肝脂含量以外,另外筛选出草鱼肝脂过量蓄积评价指标12项,包括CF、VSI、HSI、MFI等4项形体指标,ALT、AST、ALP、TBIL、IBIL、CHOL、LDL、GLU等8项血清生化指标。经K-S检验,除MFI呈近似对数正态分布(P=0.047≈0.05)以外,CF、VSI、HSI、ALP、CHOL、LDL等均呈显著正态分布(P>0.05)。依次选取低于各指标参考值上限至68.27%置信区间下限,68.27%置信区间范围值,以及高于68.27%置信区间上限值,初步确定为草鱼肝脂轻度、中度以及重度蓄积评价参考值。

分别取肝脂含量参考值上限4.60%至68.26%置信区间下限7.56%,68.26%置信区间范围内值7.56%~12.74%,以及大于68.26%置信区间上限值12.74%分别为草鱼肝脂轻度、中度和重度蓄积评价参考值。75尾草料养殖草鱼中,有16尾草鱼的肝脂含量为4.60%~7.56%,即肝脂轻度蓄积比率占草料养殖草鱼总数的21.33%;170尾配合饲料养殖草鱼中,肝脂含量为4.60%~7.56%,7.56%~12.74%,以及大于12.74% 的草鱼分别为25、121、24尾,即肝脂轻度、中度、重度蓄积草鱼分别占配合饲料养殖草鱼总数的14.71%、71.18%和14.11%。草鱼肝脂不同蓄积程度评价指标及参考值见表 6。

LPL、APO-14以及HSL均为催化脂质分解的重要酶。根据2.3与2.4节,分别选择脂肪含量为3%~4%(正常肝脂)、7%~8%(肝脂轻度蓄积)、11%~12%(肝脂中度蓄积)和15%~16%(肝脂重度蓄积)的草鱼肝胰脏样品各12份,检测上述3个酶基因的mRNA相对表达量。结果发现LPL基因mRNA相对表达量随着草鱼肝脂蓄积程度加重而增加(图 3),且正常肝脂组、肝脂轻度蓄积组、肝脂中度蓄积组、肝脂重度蓄积组草鱼之间均存在显著差异(P<0.05)。APO-14以及HSL的mRNA相对表达量则随草鱼肝胰脏脂肪含量的增加而下降,其中轻度蓄积组与中度蓄积组草鱼之间APO-14 mRNA相对表达量的差异不显著(P>0.05),正常肝脂组与肝脂轻度蓄积组,以及轻度蓄积组与中度蓄积组这两组草鱼之间的HSL mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05)。

	图 3 草鱼不同脂肪蓄积程度肝胰脏LPL,APO-14以及HSL mRNA相对表达量 Fig. 3 Relative expression levels of LPL,APO-14 and HSLgene in Ctenopharyngodon idella hepatopancreasewith different degree of lipid accumulation 具有不同字母的组间差异显著(P<0.05)。 The difference was significant between groups with different lowercase letters(P<0.05).
图选项

鱼类肥满度、脏体指数、肝体指数、肠系膜脂肪指数等形体指标是判断鱼类营养状况和生长情况的初级指标,这些指标过低和过高均可能意味着鱼体营养状况或物质代谢异常。因此,这些指标现已成为水产动物营养研究中的常规检测项目^{[15, 16]}。由于体型短胖,肝胰脏肿大,肝胰脏表面有白色脂肪沉着,肠管表面脂肪覆盖明显等被认为是鱼类脂肪肝的症状^{[17, 18]},因此有学者对鱼类的部分形体指标与肝脂沉积间的关系进行了研究。Catacutan等^[19]认为尖吻鲈(Lates calcarifer)肝体比上升到2.12%就意味着肝脏脂肪沉积过量。Lin等^[9]认为草鱼肝体比高于3% 是营养性脂肪肝的特征之一。我们发现,肝脂含量高于5%草鱼肥满度、脏体指数、肝体指数以及肠系膜脂肪指数平均值均明显高于相应指标正常参考值上限,故推测草鱼肥满度、脏体指数、肝体指数、肠系膜脂肪指数明显上升意味着肝胰脏脂肪过量沉积。

草鱼形体指标受饲料营养因素的影响较大,如有研究表明以鱼粉、豆粕和菜粕为蛋白源饲养草鱼时,草鱼单位体长的体质量比棉粕组和花生粕组更大、更肥^[20]。用棉粕代替鱼粉饲养草鱼幼鱼,发现不同比例替代鱼粉可显著影响草鱼脏体指数和肝体指数^[21]。用高纤维素配合饲料(粗纤维含量25.11%)饲养草鱼,不仅明显降低草鱼肝体指数,还可大大减少肝脂沉积^[22]。本研究中,配合饲料养殖草鱼的4项形体指标与肝脂含量均明显高于草料养殖草鱼,这可能与饲料生产中过于强调淀粉、蛋白质和脂肪水平及其作用,而忽视了粗纤维水平及其作用有关。目前,配合饲料中纤维素水平对草鱼生长影响已有少量报道。例如,黄忠志等^[22]研究发现草鱼配合饲料中适宜纤维含量范围为10%~20%,最适含量约为12%,且长期以精粗搭配饲养草鱼的生长速度一般要超过“全精”饲料饲养的草鱼。但是,饲料纤维素水平对不同生长阶段草鱼生长和健康的影响,尤其是对草鱼成鱼的影响则尚缺少系统研究报道。中国饲草资源丰富,李科云等^[23]对39种鱼用优质饲草的研究表明,不同饲草干物质中粗纤维含量为6.80%~41.60%,其中33种饲草粗纤维含量均高于20%。这为研究饲料粗纤维水平对草鱼肝脂蓄积的影响奠定了基础。

血清生化指标是评价动物生理状况的重要指标,例如,血清TG、HDL、GLU、ALP水平等是诊断非酒精性脂肪肝的重要依据^{[24, 25]};血清TG、CHOL、HDL、LDL、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)活力也广泛用于评价鱼体脂肪代谢状况^[26]。我们参照Lin等^[9]的标准,以肝胰脏脂质含量低于5%的草鱼为对照,发现肝胰脏脂肪过量蓄积草鱼的23项血清生化指标中,ALT、AST、TBIL、IBIL、ALP、CHOL、LDL和GLU等8项指标的平均值明显高于相应指标的参考范围值上限,即上述8项血清生化指标明显偏高,草鱼发生肝脂过量蓄积的概率可能提高。但是,不同研究者对于草鱼血清相同生化指标的检测结果存在不同程度的差异^{[24, 25]},这可能与草鱼的生长阶段,饲料组成及营养水平,养殖密度,季节以及水体环境等有关。系统研究和比较不同规格草鱼在不同季节和养殖环境中血清生化指标的变化情况,对于草鱼健康评价、肝胰脏脂肪过量蓄积及其他疾病的诊断具有参考价值。

肝活检是诊断动物肝脏功能正常与否的黄金标准。刘猛等^[12]将肝脏颜色、光泽、弹性、质地等肝活检指标纳入了团头鲂(Megalobrama amblycephala)的健康评价指标体系。田娟等^[27]按颜色将草鱼的肝脏分成正常肝、花肝、发白肝、发黄肝4种,研究发现除正常肝以外,其他3种颜色肝脏中脂肪沉积均较严重。陈科全等^[28]发现草鱼随着肝脂含量增加,肝胰脏细胞体积会增大。冯健等^[29]也采用肝脏组织切片等活检方法来研究红姑鱼(Sciaenops oceliatus)肝脏是否发生脂肪变性,并发现脂肪肝红姑鱼肝细胞内存在空泡化,细胞核被挤压至细胞边缘,部分肝细胞核消失等现象。本研究中肝脂过量蓄积草鱼肝胰脏组织切片观察结果与冯健等^[29]的结果相近。肝脂含量是评价动物脂肪沉积程度和诊断脂肪肝的直接依据。Lin等^[9]研究认为草鱼肝脂含量超过5% 可诊断为脂肪肝,同时根据肝脂含量为5%~10%、10%~15%、15%~20%将草鱼脂肪肝依次划分为肝脏脂质沉积、肝实质脂肪浸润、肝脏细胞核萎缩3个时期。在本研究中我们根据区间法初步确定草鱼肝脂正常、轻度、中度、重度蓄积的肝脂含量参考范围分别为小于4.60%、4.60%~7.56%、7.56%~12.74%、大于12.74%,其中轻度、中度、重度蓄积参考值均略低于Lin等^[9]的标准。

本研究中,肝脂轻度、中度和重度蓄积组草鱼均为配合饲料养殖草鱼,仅正常肝脂组为纯草料养殖草鱼,推测导致不同肝脂蓄积程度草鱼间LPL mRNA表达量差异显著的主要因素可能是食物类型或饲料营养水平。APO-14是鱼类特有的一种载脂蛋白,也是参与构成高密度脂蛋白的成分之一,在促进胆固醇代谢方面起重要作用。有研究表明,草鱼肠道损伤可降低血清高密度脂蛋白含量,并上调胆固醇合成酶相关基因和下调对胆汁酸合成进行负调控的相关基因表达量^[30]。草鱼肝胰脏Apo-14 mRNA表达量随着草鱼肝脂蓄积程度加重而逐渐下降,表明肝脂过量蓄积草鱼体内存在胆固醇代谢障碍。这可能与肝脂过量蓄积草鱼同时存在肠道损伤有关,但这方面目前尚缺少研究。激素敏感性脂肪酶受胰岛素与前列腺素等抗脂解激素,以及肾上腺素、胰高血糖素、甲状腺素和促肾上腺皮质激素等脂肪分解激素的调控^[31]。该基因在哺乳动物中的研究较多,在鱼类,尤其是淡水鱼类中的研究较少。肝脂轻度、中度、重度蓄积组草鱼肝胰脏中HSL mRNA表达量均低于正常肝脂组草鱼,且随着肝胰脏脂肪蓄积量增加,草鱼肝胰脏HSL mRNA表达量逐渐下降,脂质分解能力不断降低,这可能与肝脂蓄积草鱼体内血糖水平过高,抗脂解和脂解激素异常分泌或功能紊乱有关,具体情况还需进一步研究。

由于肝脂沉积过量是不同动物脂肪肝的典型特征,因此以肝脂含量为主导来评价草鱼肝脂沉积程度是科学合理的。另外,由于肝脂过量蓄积草鱼的CF、VSI、HSI、MFI等4项形体指标,以及ALT、AST、TBIL、IBIL、ALP、CHOL、LDL、GLU等8项血清生化指标的平均值均明显高于正常肝脂草鱼,且均呈显著正态分布,因此可以采用区间法确定上述各项指标评价草鱼肝脂蓄积程度的范围值。但是,由于鱼体之间的个体差异和样本数量均较大,难以在上述12项指标与肝胰脏脂肪含量之间建立有效的数学模型,因此,利用区间法确定的12项间接指标的范围值来评价草鱼成鱼肝胰脏脂肪轻度、中度、重度蓄积可能还存在一定的缺陷,如单独利用其中的1项或少数指标来评价草鱼肝脂过量蓄积及蓄积程度可能不够准确。因此,为了提高评价的准确性,在利用上述12项指标间接评价草鱼肝脂蓄积程度时,应该结合其中多项指标进行综合评定。由于肝胰脏组织切片及HSI受肝脂蓄积的直接影响,除肝脂以外,在肝活检时可重点考虑结合这2个指标来评价草鱼肝脂蓄积程度。值得一提的是,检测血液生化指标对鱼体伤害相对比较小,且方法简单、快速。简言之,基于脂肝含量建立的草鱼肝脂过量蓄积评价指标一定程度上可以用来评价市售草鱼品质和指导草鱼的科学养殖。