有机肥替代部分化肥对稻麦轮作系统产量及土壤微生物区系的影响

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603016

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赵军, 李勇, 冉炜, 张瑞福, 沈标, 沈其荣

ZHAO Jun, LI Yong, RAN Wei, ZHANG Ruifu, SHEN Biao, SHEN Qirong

Effects of organic manure partial substitution for chemical fertilizer on crop yield and soil microbiome in a rice-wheat cropping system

南京农业大学学报, 2016, 39(4): 594-602

Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(4): 594-602.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603016

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收稿日期：2016-03-09

引用本文

赵军, 李勇, 冉炜, 张瑞福, 沈标, 沈其荣. 有机肥替代部分化肥对稻麦轮作系统产量及土壤微生物区系的影响[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(4): 594-602. 复制到剪切板

ZHAO Jun, LI Yong, RAN Wei, ZHANG Ruifu, SHEN Biao, SHEN Qirong. Effects of organic manure partial substitution for chemical fertilizer on crop yield and soil microbiome in a rice-wheat cropping system[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(4): 594-602. DOI: 10.7685/jnau.201603016. 复制到剪切板

有机肥替代部分化肥对稻麦轮作系统产量及土壤微生物区系的影响

赵军¹, 李勇², 冉炜¹, 张瑞福¹, 沈标¹, 沈其荣¹

1. 南京农业大学资源与环境科学学院/国家有机类肥料工程技术研究中心/江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心, 江苏南京 210095;
2. 江苏省金坛市土肥站, 江苏金坛 213200

收稿日期：2016-03-09

基金项目：国家重点基础研究规划项目(2015CB150502);江苏省研究生科研创新计划项目(CXZZ13_0301)

作者简介：赵军,博士研究生。

通信作者：沈标,教授,研究方向为微生物生态与土壤肥料,E-mail:shenbiao@njau.edu.cn。

摘要：[目的] 本文旨在研究不同有机肥替代部分化肥对稻麦轮作系统产量及其构成因素、土壤微生物区系的影响,为找到合适的施肥措施来提高作物产量,培育高产土壤微生物区系提供理论依据。[方法] 以江苏省金坛市的长期肥料试验点为研究对象,设置6个施肥处理:不施肥(CK),常规氮、磷、钾化肥(NPK),3000 kg·hm^-2猪粪有机肥替代30%常规化肥施用量(NPKM1),6000 kg·hm^-2猪粪有机肥替代50%常规化肥施用量(NPKM2),1800 kg·hm^-2猪粪有机无机复合肥替代50%常规化肥施用量(NPKMOI1),3600 kg·hm^-2猪粪有机无机复合肥替代70%常规化肥施用量(NPKMOI2)。测定水稻、小麦的有效穗数、每穗粒数、千粒质量、理论产量和实际产量;并利用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法和高通量测序测定土壤微生物生物量及微生物群落结构。[结果] 与NPK处理相比,猪粪有机肥(NPKM1、NPKM2)和猪粪有机无机复合肥(NPKMOI1、NPKMOI2)替代部分化肥对水稻和小麦的产量构成因素、理论产量和实际产量无显著降低,且均能提高土壤微生物生物量碳、氮。NPKMOI1和NPKMOI2处理能够增加土壤细菌丰富度、多样性和均匀度指数,显著改变土壤细菌区系,且这种改变随着化肥替代量的增加而变大。[结论] 3600 kg·hm^-2猪粪有机无机复合肥替代70%常规化肥施用量处理能够提高作物产量,是一种具有培育高产土壤微生物区系潜力的施肥措施。

关键词：稻麦轮作猪粪有机肥猪粪有机无机复合肥微生物量土壤微生物区系

Effects of organic manure partial substitution for chemical fertilizer on crop yield and soil microbiome in a rice-wheat cropping system

ZHAO Jun¹, LI Yong², RAN Wei¹, ZHANG Ruifu¹, SHEN Biao¹ , SHEN Qirong¹

1. College of Resources and Environmental Sciences/National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers/Jiangsu Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Jintan Soil and Fertilizer Technical Guidance Station, Jintan 213200, China

Abstract: [Objectives] The objective of this study was to investigate the effects of different organic fertilizers partial substitution for chemical fertilizer on crop yield and its components,and soil microbiome in a rice-wheat cropping system,and find out the suitable fertilizer regime to increase crop yield and provide the theoretical basis for establishing high-productivity associated soil microbiome.[Methods] With the long-term fertilizer experimental site located in Jintan,Jiangsu as the research site,six fertilizer regimes were included in this study:no fertilizer(CK),conventional dosage of chemical fertilizer (NPK),3 000 kg·hm^-2 pig manure organic fertilizer substituted 30% of chemical fertilizer (NPKM1),6 000 kg·hm^-2 pig manure organic fertilizer substituted 50% of chemical fertilizer (NPKM2),1 800 kg·hm^-2 pig manure organic-inorganic compound fertilizer substituted 50% of chemical fertilizer(NPKMOI1),and 3 600 kg·hm^-2 pig manure organic-inorganic compound fertilizer substituted 70% of chemical fertilizer (NPKMOI2). The number of productive spikes,number of grains per spike,thousand grains weight,theoretical yield,and actual yield of rice and wheat were measured,respectively. Soil microbial biomass and soil microbiome were determined by chloroform fumigation-K₂SO₄ extraction method and high-throughput sequencing.[Results] Compared to the NPK treatment,pig manure organic fertilizer (NPKM1,NPKM2) and pig manure organic-inorganic compound fertilizer(NPKMOI1,NPKMOI2)substituted partial chemical fertilizer had no significant decline in rice and wheat yield and their components,and enhanced soil microbial biomass carbon and nitrogen. NPKMOI1 and NPKMOI2 treatments increased soil bacterial richness,diversity and evenness,and markedly shaped the soil bacterial community,and such shifts were increased with the increase of substitution amount of chemical fertilizer.[Conclusions] The treatment that 3 600 kg·hm^-2 pig manure organic-inorganic compound fertilizer substituted 70% of chemical fertilizer was a potential fertilization regime to enhance crop yield and establish high-productivity associated soil microbial community.

Keywords: rice-wheat rotation pig manure organic fertilizer pig manure organic-inorganic compound fertilizer microbial biomass soil microbiome

水稻和小麦是世界上最重要的粮食作物,也是我国种植面积最广的农作物,维持水稻-小麦轮作系统的稳产和高产关系到我国乃至世界的粮食安全^{[1, 2]}。施肥是作物增产最有效的途径,长期定位试验表明化肥对我国粮食产量的贡献率在40%左右^[3]。近20年来,我国的化肥用量持续高速增长,肥料利用率却始终不高,粮食产量也始终增加缓慢^[4]。因此,这种过度依赖于“大药大水大肥”的生产方式很难再进一步提高粮食单产,而且长期过量使用化肥导致土壤有机质含量下降、土壤结构退化、土壤微生物多样性和生物活性降低,进而引起土壤肥力下降^{[5, 6]},不利于农业可持续发展。施用有机肥可以有效改良土壤结构,提高土壤有机质含量,调节土壤养分的释放强度和速率,使作物在生长过程中得到均衡稳定持续的养分供给,从而促进农作物增产^[7]。然而,有机肥对产量的影响往往是一个缓慢且长期的过程^[8]。因此,有机肥替代部分化肥是我国今后肥料施用的必然趋势。

土壤微生物是土壤环境的重要组成部分,直接参与土壤中养分的循环转化、土壤结构的维持和农用化学品的降解,在保持土壤健康和农业可持续生产上起着重要的作用^[9-10]。而施肥作为重要的农业生产措施,通过向土壤中输入养分和有机物,刺激微生物的生长繁殖,从而影响土壤微生物的丰度、活性、微生物生物量和微生物群落结构^[11-12]。许多长期定位试验的研究表明:有机肥或有机无机复合肥替代部分化肥能够显著提高作物产量^[13-14]。Xun等^[15]研究发现长期施用有机肥或有机无机配施能够维持土壤细菌的多样性,而长期施用无机肥能够显著降低土壤细菌多样性。另外,猪粪或牛粪有机肥替代部分化肥能够增加土壤微生物生物量和提高土壤养分有效性,并能显著改变细菌群落结构^{[13, 16]}。本研究以江苏省金坛市的长期肥料试验点为研究对象,研究不同的有机肥替代部分化肥措施对稻麦轮作系统产量及其构成因素、土壤微生物生物量、细菌群落结构及其多样性的影响,旨在找到能够提高产量和培育高产土壤微生物区系潜力的施肥措施,并为通过有机肥替代部分化肥来培育高产微生物区系提供初步的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

田间试验位于江苏省金坛市指前镇建春村(31°39′N,119°28′E),属亚热带季风气候,年平均气温15.3 ℃,年平均降雨量1 063.6 mm,无霜期为228 d。试验前该区域的种植模式是典型的冬小麦-夏玉米轮作。供试土壤属乌栅土,试验前土壤0~20 cm 土层基本理化性质为:有机质含量19.7 g·kg^-1,全氮1.61 g·kg^-1,总碳13.46 g·kg^-1,速效钾56.43 mg·kg^-1,速效磷18.02 mg·kg^-1,pH₇.31^[9]。

1.2 田间试验设计

肥料试验开始于2010年10月,共设置6个处理:1)不施肥对照(CK);2)常规氮、磷、钾肥(NPK);3)70% NPK和3 000 kg·hm^-2猪粪有机肥(NPKM1);4)50% NPK和6 000 kg·hm^-2猪粪有机肥(NPKM2);5)50% NPK和1 800 kg·hm^-2猪粪有机无机复合肥(NPKMOI1);6)30% NPK和3 600 kg·hm^-2猪粪有机无机复合肥(NPKMOI2)。各处理重复4次,按随机排列分布。每个小区面积40 m²(5 m×8 m),各小区之间用100 cm深、30 cm宽的水泥埂隔开,且试验区外设置保护行。各施肥处理在水稻季和小麦季的施肥量见表 1。其中:氮肥为尿素(N 46%);磷肥为过磷酸钙(P₂O₅ 12%);钾肥为氯化钾(K₂O 60%);猪粪有机肥(N 2%,P₂O₅ 1.6%,K₂O 1.1%,有机质含量≥30%)和猪粪有机无机复合肥(N 12%,P₂O₅ 4%,K₂O 4%,有机质含量≥20%)分别由江苏田娘农业科技有限公司和南京明珠肥料有限公司提供。试验区采用冬小麦‘扬辐麦4’-夏水稻‘武运粳5’一年两熟的轮作制度,磷肥、钾肥、猪粪有机肥和猪粪有机无机复合肥作为基肥播种前一次施入,而氮肥以基肥和追肥的形式施入,在水稻季以基肥、分蘖肥、穗肥的质量比为4∶3∶3施入,在小麦季以基肥、返青肥、拔节肥的质量比为4∶3∶3施入。

表 1 不同处理的施肥量 Table 1 The application rate of fertilizer in different treatmentskg·hm^-2

作物Crop	处理Treatment	N	P₂O₅	K₂O	猪粪有机肥Pig manure organic fertilizer	猪粪有机无机复合肥Pig manure organic-inorganic compound fertilizer
稻季Rice season	CK	0	0	0	0	0
	NPK	300	120	100	0	0
	NPKM1	210	84	70	3000	0
	NPKM2	150	60	50	6000	0
	NPKMOI1	150	60	50	0	1800
	NPKMOI2	90	36	30	0	3600
麦季Wheat season	CK	0	0	0	0	0
	NPK	240	120	100	0	0
	NPKM1	168	84	70	3000	0
	NPKM2	120	60	50	6000	0
	NPKMOI1	120	60	50	0	1800
	NPKMOI2	72	36	30	0	3600
注:CK:不施肥对照;NPK:化肥(当地常规用量);NPKM1:70%的化肥和3 000 kg·hm^-2的猪粪有机肥;NPKM2:50%的化肥和6 000 kg·hm^-2的猪粪有机肥;NPKMOI1:50%的化肥和1 800 kg·hm^-2的猪粪有机无机复合肥;NPKMOI2:30%的化肥和3 600 kg·hm^-2的猪粪有机无机复合肥。
Note:CK:Control without chemical fertilizer;NPK:Chemical fertilizer(conventional dosage at this region);NPKM1:70% NPK plus 3 000 kg·hm^-2 pig manure;NPKM2:50% NPK plus 6 000 kg·hm^-2 pig manure;NPKMOI1:50% NPK plus 1 800 kg·hm^-2 pig manure organic-inorganic compound fertilizer;NPKMOI2:30% NPK plus 3 600 kg·hm^-2 pig manure organic-inorganic compound fertilizer. The same as follows.

表选项

1.3 产量及其构成因素的测定

各小区分别在水稻和小麦成熟期随机取20穴(茎)进行考种,测定有效穗数,每穗粒数。千粒质量为1 000粒小麦或水稻籽粒自然风干后的质量。实际产量为各小区分别随机选取20 m²水稻或小麦进行收割,晒干,脱粒后称水稻或小麦籽粒质量,并且按收获面积和小区总面积之比计算而得。

1.4 土壤样品采集与处理

土壤样品分别于2012年6月(小麦收获后)和2012年12月(水稻收获后)采集。去除表面浮土后,各小区按“S”形采样路线,用采样器(直径为2.5 cm)随机采取10个0~20 cm的耕作层土芯,混合均匀后剔除石砾和植物残根等杂质,过2 mm筛。过筛后的新鲜土壤样品分成两部分:一部分土壤保存于4 ℃冰箱用于土壤微生物生物量碳、氮的测定;一部分土壤保存于-80 ℃用于土壤基因组DNA的提取。

1.5 土壤微生物生物量碳、氮的测定

土壤微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-硫酸钾提取法^[17]测定。每个土壤样品设置4个熏蒸重复和3个不熏蒸重复,浸提液过滤后用LiquiTOC(Hanau,Germany)测定。生物量碳、氮的转换系数分别为0.45和0.54。

1.6 土壤DNA提取及454焦磷酸测序

称取0.5 g置于-80 ℃冰箱中的土壤,用PowerSoil^® DNA提取试剂盒(MoBio Laboratories,Inc.,Carlsbad,CA,USA)按说明书的步骤进行土壤总DNA的提取。所有DNA样品用NanoDrop(ND-2000,ThermoScientic,USA)测定浓度并稀释至10 ng·μL^-1,保存于-20 ℃冰箱待用。

用于焦磷酸测序的细菌16S rRNA基因 V1-V3区域采用通用引物27F(5′-454-adapter-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-454-adapter-MID-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)进行扩增。其中:adapter是加在MID和引物之前的接头;MID是用于测序时区分样品的10 bp的特异序列。每个DNA样品设置9个PCR重复,且包括2个无DNA模板的阴性对照。PCR反应体系和反应程序根据Zhao等^[18]的方法。所得PCR产物经切胶纯化后用PicoGreen^® (Promega,USA)测定浓度,等摩尔混合后送到上海美吉生物医药科技有限公司(Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd)用罗氏454测序仪测定。

1.7 高通量数据分析

高通量产生的原始序列用mothur^[19](v.1.35.1)处理并分析。具体步骤如下:1)序列筛选,即去除测序过程中产生的低质量序列。包括:前端引物中含有2个碱基不匹配;MID中含有1个碱基不匹配;连续相同碱基大于等于 8;长度小于 200或者含有模糊碱基的序列。2)序列分析,即将得到的高质量序列首先根据MID分配到不同样品中,分成多路处理(demultiplexing)。随后将所有不同(unique sequence)的序列与Silva数据库^[20]进行比对,并且基于序列相似度(97%)的方法将序列分成不同的可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)。然后将每一个OTU中丰度最高的序列作为代表性序列,通过RDP提供的参考序列和分类系统^[21]进行分类(cutoff=80)。3)生态学分析,首先将不同样品的序列随机抽样并均一化到相同的序列数(3542),随后进行alpha(丰富度、多样性和均匀度指数)和beta(主成分分析和聚类)多样性的分析。

1.8 统计分析

用SPSS 20.0进行统计分析,单因素方差分析(One-way ANOVA)配合Tukey′s HSD检验多处理间均值差异的显著性。

2 结果与分析 2.1 不同化肥替代措施对产量及其构成因素的影响

从表 2可知:在水稻季,施肥显著增加了有效穗数、理论产量和实际产量,而对每穗粒数和千粒质量无显著影响。与NPK处理相比,所有化肥替代措施对理论产量及其构成因素和实际产量均无显著影响。在小麦季,施肥显著增加了有效穗数、每穗粒数、理论产量和实际产量。与NPK处理相比,所有化肥替代措施对有效穗数、每穗粒数和理论产量无显著影响;而NPKMOI1处理的千粒质量显著高于NPK处理,NPKMOI2处理的实际产量显著高于NPK处理。结果表明:猪粪有机肥和猪粪有机无机复合肥替代部分化肥能够满足水稻、小麦的生长和稳定产量的需求。另外,NPKMOI1和NPKMOI2处理的水稻和小麦的理论产量和实际产量略高于NPKM1和NPKM2处理,这可能与NPKMOI1和NPKMOI2处理的总养分投入量高于NPKM1和NPKM2处理有关。

表 2 不同化肥替代措施对产量及其构成因素的影响 Table 2 Effects of different chemical fertilizer alternative treatments on grain yield and its components

作物Crop	处理Treatment	有效穗数/(10⁴ hm^-2)No.of productivespikes	每穗粒数No.of grainsper spike	千粒质量/gThousand grainsweight	理论产量/(t·hm^-2)Theoretical yield	实际产量/(t·hm^-2)Actual yield
水稻Rice	CK	224.78±28.35^b	90.17±9.24^a	30.03±0.77^a	6.11±1.19^b	5.43±0.60^b
	NPK	314.21±24.01^a	110.54±10.74^a	29.85±1.36^a	10.36±1.32^a	9.18±0.47^a
	NPKM1	312.53±8.57^a	102.07±10.64^a	29.77±1.25^a	9.52±1.39^a	8.96±0.57^a
	NPKM2	278.78±25.91^ab	98.10±9.49^a	29.93±1.85^a	8.22±1.57^ab	8.72±0.47^a
	NPKMOI1	307.13±44.18^a	103.86±12.05^a	29.77±0.73^a	9.44±1.34^ab	9.03±0.92^a
	NPKMOI2	310.50±53.47^a	110.98±12.56^a	28.87±0.84^a	9.95±2.03^a	9.08±0.54^a
小麦Wheat	CK	300.38±48.27^b	27.20±2.39^b	36.06±0.37^a	2.93±0.41^b	2.15±0.15^c
	NPK	469.13±38.82^a	42.85±2.45^a	30.99±1.92^b	6.25±0.94^a	5.15±0.33^b
	NPKM1	480.94±59.14^a	38.03±3.21^a	31.38±1.72^b	5.80±1.29^a	4.81±0.05^b
	NPKM2	484.88±48.52^a	35.82±3.33^a	32.14±0.63^b	5.61±1.07^a	4.66±0.11^b
	NPKMOI1	477.56±58.02^a	37.99±3.07^a	35.98±1.96^a	6.59±1.45^a	4.85±0.31^b
	NPKMOI2	514.13±75.58^a	39.86±4.34^a	34.24±1.41^ab	7.03±1.48^a	5.89±3.76^a
注:各列中数据(平均值±标准差,n=4)后不同字母表示处理间差异显著(Tukey′s post-hoc test,P<0.05)。
Note:Values(mean±SD,n=4)within the same column followed by different letters are significantly different at P<0.05 according to Tukey′s post-hoc test. The same as follows.

表选项

2.2 不同化肥替代措施对土壤微生物生物量碳、氮的影响

如表 3所示:水稻和小麦收获后的土壤中,施肥均能够提高土壤微生物生物量碳、氮,且与NPK处理相比,所有化肥替代措施均提高了土壤微生物生物量碳、氮,NPKM1和NPKM2处理对土壤微生物生物量碳、氮的增幅分别为5.7%~13.6%和5.6%~27.4%,NPKMOI1和NPKMOI2处理对土壤微生物生物量碳、氮的增幅分别为4.8%~21.6%和12.9%~31.4%。这表明外界养分的投入均能刺激土壤微生物的增殖,而有机类肥料的投入能够刺激并满足更多土壤微生物生长繁殖的需求。在一定程度上,土壤微生物生物量碳、氮随着化肥替代量的增加而增加(NPKM2>NPKM1;NPKMOI2>NPKMOI1),这表明施用更多的有机类肥料能够支持更多的土壤微生物生长繁殖。NPKMOI2处理的土壤微生物生物量碳(除小麦收获后的土壤)、氮高于NPKM1和NPKM2处理,这可能与该处理的总养分投入量高于NPKM1和NPKM2有关。另外,小麦收获后土壤中的微生物生物量碳、氮均高于水稻收获后的土壤,这可能由于水稻在生长过程中的厌氧环境抑制了好氧微生物的生长和繁殖,从而导致微生物生物量下降。

表 3 不同化肥替代措施对土壤微生物生物量碳、氮的影响 Table 3 Effects of different chemical fertilizer alternative treatments on soil microbial biomass carbon and nitrogen

采样时间Sampling time	处理Treatment	微生物生物量碳/(mg·kg^-1)Microbial biomass carbon	微生物生物量氮/(mg·kg^-1)Microbial biomass nitrogen
水稻收获后After rice harvest	CK	237.85±47.76^b	19.19±6.91^b
	NPK	314.87±49.54^ab	28.12±2.90^ab
	NPKM1	334.04±86.91^ab	29.80±5.06^ab
	NPKM2	343.17±61.06^ab	30.43±8.88^ab
	NPKMOI1	330.79±74.21^ab	31.33±2.25^ab
	NPKMOI2	401.54±48.10^a	36.03±3.94^a
小麦收获后After wheat harvest	CK	358.67±93.32^b	21.39±6.78^c
	NPK	470.96±96.25^ab	28.60±2.43^bc
	NPKM1	528.81±67.50^a	36.98±3.84^ab
	NPKM2	544.95±71.06^a	39.37±3.67^a
	NPKMOI1	514.30±13.66^ab	38.85±4.52^a
	NPKMOI2	540.85±50.40^a	41.67±4.46^a

表选项

2.3 不同化肥替代措施对细菌群落组成的影响

由图 1可知:变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是所有土壤样品中相对丰度较高的门,在每个样品中占62.3%~66.5%的序列。在水稻收获后的土壤中,与CK和NPK处理相比,NPKM1处理增加了变形菌门、酸杆菌门的相对丰度,降低了绿弯菌门和拟杆菌门的相对丰度,NPKM2、NPKMOI1和NPKMOI2处理对细菌门水平上的分布影响不大。在小麦收获后的土壤中,与CK和NPK处理相比,NPKM1和NPKM2处理增加了变形菌门、拟杆菌门的相对丰度,降低了绿弯菌门的相对丰度;NPKMOI1和NPKMOI2处理增加了变形菌门和放线菌门的相对丰度(P<0.05),降低了酸杆菌门和绿弯菌门的相对丰度。放线菌能够参与有机质的转化利用,并分泌大量的抗菌物质,因此,猪粪有机无机复合肥替代部分化肥能够在一定程度上增加土壤健康程度。

	图 1 水稻和小麦收获后土壤样品中细菌门类水平的分布 Fig. 1 Bacterial distribution at phylum level of samples after rice and wheat harvest
图选项

变形菌门的某些类群在土壤中担负着重要的生态功能。由图 2可知:在水稻收获后的土壤中,相对于CK和NPK处理,不同化肥替代措施对α-变形菌纲、β-变形菌纲和δ-变形菌纲丰度的影响无显著差异,而NPKMOI2处理显著增加了γ-变形菌纲的丰度(P<0.05)。在小麦收获后的土壤中,与CK和NPK处理相比,NPKMOI1和NPKMOI2处理增加了α-变形菌纲的丰度,而NPKM1和NPKM2处理增加了β-变形菌纲的丰度。δ-变形菌纲的丰度在所有施肥处理和CK处理之间无显著差异。与CK和NPK处理相比,NPKMOI2处理显著增加了γ-变形菌纲的丰度(P<0.05)。α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲的某些类群能够参与土壤硝化反应,因此猪粪有机肥和猪粪有机无机复合肥可能在一定程度上能够提高土壤生态功能。

	图 2 水稻和小麦收获后土壤样品中变形菌纲的分布 Fig. 2 Distribution of Proteobacteria at class level of samples after rice and wheat harvest
图选项

2.4 不同化肥替代措施对细菌alpha多样性指数的影响

如表 4所示:在水稻收获后的土壤样品中,与CK处理相比,仅NPKM1处理的细菌丰富度、多样性和均匀度指数有所降低,其他处理均有所增加;与NPK处理相比,NPKMOI1和NPKMOI2处理均增加了细菌的丰富度、多样性和均匀度指数,而NPKM1和NPKM2处理的丰富度、NPKM1处理的多样性和均匀度指数有所下降。在小麦收获后的土壤中,所有的施肥处理均增加了细菌的alpha多样性指数;与NPK处理相比,所有化肥替代措施均增加了细菌的丰富度、多样性和均匀度指数,且NPKMOI1和NPKMOI2处理显著增加(P<0.05)。这表明,在一定程度上,施用有机类肥料替代部分化肥能够增加细菌的丰富度、多样性和均匀度指数,且在小麦收获后的土壤样品中更明显,这可能由于水稻在生长过程中的厌氧环境抵消了肥料处理对细菌多样性指数的差异。另外,NPKMOI1和NPKMOI2处理的细菌alpha多样性指数较NPKM1和NPKM2处理增加明显,这可能与NPKMOI1和NPKMOI2处理的总养分投入量较高有关。水稻和小麦收获后的土壤中,NPKM1和NPKM2处理的alpha多样性指数随着化肥替代量(NPKM2>NPKM1)的增加而增加,而NPKMOI1和NPKMOI2处理的alpha多样性指数随着化肥替代量的增加而减少,这可能与不同肥料类型有关。

表 4 不同化肥替代措施对细菌alpha多样性指数的影响 Table 4 Effects of different chemical fertilizer alternatives treatments on bacterial alpha diversity indices

采样时间 Sampling time	处理 Treatment	丰富度指数 Richness index	多样性指数 Diversity index	均匀度指数 Evenness index
水稻收获后After rice harvest	CK	1413±34^ab	6.62±0.06^ab	0.912±0.007^a
	NPK	1462±18^ab	6.64±0.06^ab	0.912±0.007^a
	NPKM1	1393±54^b	6.59±0.06^b	0.910±0.003^a
	NPKM2	1443±36^ab	6.65±0.04^ab	0.914±0.004^a
	NPKMOI1	1509±40^a	6.73±0.03^a	0.919±0.001^a
	NPKMOI2	1495±33^ab	6.69±0.04^a	0.915±0.003^a
小麦收获后After wheat harvest	CK	1285±11^b	6.55±0.02^b	0.916±0.001^b
	NPK	1291±44^b	6.56±0.01^b	0.916±0.003^b
	NPKM1	1300±48^b	6.57±0.04^b	0.916±0.005^b
	NPKM2	1316±27^b	6.60±0.02^b	0.919±0.000^ab
	NPKMOI1	1506±14^a	6.80±0.01^a	0.929±0.002^a
	NPKMOI2	1477±61^a	6.76±0.08^a	0.927±0.006^a

表选项

2.5 不同化肥替代措施对细菌beta多样性的影响

PCA分析结果(图 3)表明:水稻和小麦季不同施肥处理间土壤细菌区系的差异显著(PERMANOVA,Pseudo-F=6.52,P<0.001)。PCA的第1、2轴分别能解释细菌群落结构11.54%和9.06%的变异度。在PCA的第1轴,所有样品按采样时间分成2组,且不同施肥处理对水稻和小麦季细菌区系影响的趋势一致。与CK和NPK处理相比,NPKM1和NPKM2处理对细菌区系的影响不显著;而NPKMOI1和NPKMOI2处理对细菌区系的影响显著,且驱动区系形成的差异随着化肥替代量的增加而变大。结果表明:猪粪有机无机复合肥对土壤细菌区系的影响比猪粪有机肥大,这可能与肥料的不同类型有关,也可能与NPKMOI1和NPKMOI2处理的总养分投入量较高有关。

	图 3 各处理细菌群落基于Bray-Curtis距离的主成分分析 Fig. 3 Principal component analysis of bacterial communities based on the Bray-Curtis distance
图选项

聚类分析结果(图 4)显示:土壤细菌区系首先按采样时间分成2组。在水稻收获后的土壤中,NPKMOI1和NPKMOI2处理的细菌群落结构聚在一起,与CK、NPK、NPKM1和NPKM2处理分开,且NPK、NPKM1和NPKM2处理聚在一起,与CK分开。在小麦收获后的土壤中,NPKMOI2处理的细菌群落结构聚在一起,与其他处理分开;而NPKMOI1处理的细菌群落结构聚在一起,与CK、NPK、NPKM1和NPKM2分开。虽然CK、NPK、NPKM1和NPKM2处理的群落结构聚在一起,但CK处理与其他3个处理的细菌群落结构有差异。结果表明:施肥能够改变细菌群落结构,但是NPK、NPKM1和NPKM2处理在短时间内对土壤细菌区系的改变较小,而NPKMOI1和NPKMOI2处理对土壤细菌区系的改变较大,这可能与NPKMOI1和NPKMOI2的总养分投入量较大有关。

	图 4 各处理细菌群落的层次聚类分析 Fig. 4 Hierarchical cluster dendrogram of bacterial communities
图选项

3 讨论

施肥是农业生态系统中提高作物产量的重要措施,而过量施肥是导致我国肥料利用效率过低的主要原因^[4]。在本研究中,与常规化肥施用量相比,猪粪有机肥(3 000和6 000 kg·hm^-2)和猪粪有机无机复合肥(1 800和3 600 kg·hm^-2)分别替代30%、50%和50%、70%的常规化肥施用量后,水稻和小麦的产量构成因素、理论产量和实际产量无明显下降的趋势。有研究表明:有机肥或有机无机复合肥与无机肥配合施用往往能够提高土壤的速效养分含量,调控土壤与化肥养分的释放强度和速率,使作物在各生育阶段得到均衡稳定持续的养分供给,从而促进作物的生长,提高结实率和产量^[22]。陶磊等^[23]研究发现有机肥或生物有机肥(3 000和6 000 kg·hm^-2)替代20%、40%的常规化肥施用量后,棉花产量与常规化肥施用量处理相似。另外,Zhao等^[24]研究表明稻麦轮作条件下猪粪有机肥或猪粪有机无机复合肥替代部分化肥能够在一定程度上增加水稻和小麦的产量。

土壤微生物是土壤中最活跃和最易变化的部分,而土壤微生物生物量是土壤有效养分的储备库,代表土壤养分的活性部分,因此常被用于评价土壤质量的生物学性状^[11]。本研究发现,猪粪有机肥和猪粪有机无机复合肥替代部分化肥均能够增加土壤微生物生物量碳、氮,且随着化肥替代量的增加而增加。这是因为有机类肥料中含有大量易被微生物分解利用的物质,可以刺激微生物迅速生长增殖,从而增加土壤微生物生物量碳、氮^[25]。臧逸飞等^[26]研究了26年的肥料长期定位试验,发现有机肥配施氮、磷、钾肥与纯氮、磷、钾肥相比,显著增加了土壤微生物生物量氮。

土壤微生物多样性与土壤生态系统的功能息息相关^[10]。通常情况下,土壤微生物多样性越高,土壤功能越完整,生态系统越稳定^[27]。维持和恢复微生物多样性已成为可持续农业生态系统中面临的重要问题^[28]。在本研究中,猪粪有机无机复合肥替代部分化肥可以增加微生物的丰富度、多样性和均匀度指数,表明这种施肥方式能够提高和维持土壤微生物多样性,进而有利于稳定土壤功能,提高土壤生产力,从而形成稳定可持续的农业生态系统。Sun等^[13]研究发现猪粪或牛粪有机肥配施化肥能够恢复土壤细菌的多样性。另外,主成分分析和聚类分析表明,猪粪有机无机复合肥替代部分化肥对土壤细菌区系的影响较大。

综上所述,猪粪有机肥和猪粪有机无机复合肥替代部分化肥不会造成作物减产,且均能增加土壤微生物生物量碳、氮。另外,猪粪有机无机复合肥替代部分化肥能够提高土壤细菌多样性,显著改变细菌群落结构,是一种具有培育高产土壤微生物区系潜力的施肥措施。

参考文献(References)

[1]	Timsina J,Connor D J. Productivity and management of rice-wheat cropping systems:issues and challenges[J]. Field Crops Research,2001,69(2):93-132.

[2]	Ladha J K,Pathak H,Tirol-Padre A,et al. Productivity trends in intensive rice-wheat cropping systems in Asia[C]//ASA,CSSA and SSSA. Improving the Productivity and Sustainability of Rice-Wheat Systems:Issues and Impacts. Madison:ASA Special Publication No. 65,2003:45-76.

[3]	石元亮,王玲莉,刘世彬,等. 中国化学肥料发展及其对农业的作用[J]. 土壤学报,2008,45(5):852-864. Shi Y L,Wang L L,Liu S B,et al. Development of chemical fertilizer industry and its effect on agriculture of China[J]. Acta Pedologica Sinica,2008,45(5):852-864(in Chinese with English abstract).

[4]	张福锁,王激清,张卫峰,等. 中国主要粮食作物肥料利用率现状与提高途径[J]. 土壤学报,2008,45(5):915-924. Zhang F S,Wang J Q,Zhang W F,et al. Nutrient use efficiencies of major cereal crops in China and measures for improvement[J]. Acta Pedologica Sinica,2008,45(5):915-924(in Chinese with English abstract).

[5]	Zhong W H,Cai Z C. Long-term effects of inorganic fertilizers on microbial biomass and community functional diversity in a paddy soil derived from quaternary red clay[J]. Applied Soil Ecology,2007,36(2):84-91.

[6]	Guo J H,Liu X J,Zhang Y,et al. Significant acidification in major Chinese croplands[J]. Science,2010,327(5968):1008-1010.

[7]	许仁良,王建峰,张国良,等. 秸秆、有机肥及氮肥配合使用对水稻土微生物和有机质含量的影响[J]. 生态学报,2010,30(13):3584-3590. Xu R L,Wang J F,Zhang G L,et al. Changes of microbe and organic matter content in paddy soil applied with straw,manure and nitrogen fertilizer[J]. Acta Ecologica Sincia,2010,30(13):3584-3590(in Chinese with English abstract).

[8]	Khaliq A,Abbasi M K,Hussain T. Effects of integrated use of organic and inorganic nutrient sources with effective microorganisms(EM)on seed cotton yield in Pakistan[J]. Bioresource Technology,2006,97(8):967-972.

[9]	Zhao J,Zhang R F,Xue C,et al. Pyrosequencing reveals contrasting soil bacterial diversity and community structure of two main winter wheat cropping systems in China[J]. Microbial Ecology,2014,67(2):443-453.

[10]	Kennedy A C,Smith K L. Soil microbial diversity and the sustainability of agricultural soils[J]. Plant Soil,1995,170(1):75-86.

[11]	Chu H Y,Lin X G,Fujii T,et al. Soil microbial biomass,dehydrogenase activity,bacterial community structure in response to long-term fertilizer management[J]. Soil Biology and Biochemistry,2007,39(11):2971-2976.

[12]	Gu Y F,Zhang X P,Tu S H,et al. Soil microbial biomass,crop yields,and bacterial community structure as affected by long-term fertilizer treatments under wheat-rice cropping[J]. European Journal of Soil Biology,2009,45(3):239-246.

[13]	Sun R B,Zhang X X,Guo X S,et al. Bacterial diversity in soils subjected to long-term chemical fertilization can be more stably maintained with the addition of livestock manure than wheat straw[J]. Soil Biology and Biochemistry,2015,88:9-18.

[14]	Shen M X,Yang L Z,Yao Y M,et al. Long-term effects of fertilizer managements on crop yields and organic carbon storage of a typical rice-wheat agroecosystem of China[J]. Biology and Fertility of Soils,2007,44(1):187-200.

[15]	Xun W B,Zhao J,Xue C,et al. Significant alteration of soil bacterial communities and organic carbon decomposition by different long-term fertilization management conditions of extremely low-productivity arable soil in South China[J]. Environmental Microbiology,2015,DOI:10.1111/1462-2920.13098.

[16]	Liu M Q,Hu F,Chen X Y,et al. Organic amendments with reduced chemical fertilizer promote soil microbial development and nutrient availability in a subtropical paddy field:the influence of quantity,type and application time of organic amendments[J]. Applied Soil Ecology,2009,42(2):166-175.

[17]	Vance E D,Brookes P C,Jenkinson D S. An extraction method for measuring soil microbial biomass C[J]. Soil Biology and Biochemistry,1987,19(6):703-707.

[18]	Zhao J,Ni T,Li Y,et al. Responses of bacterial communities in arable soils in a rice-wheat cropping system to different fertilizer regimes and sampling times[J]. PLoS ONE,2014,9(1):e85301.

[19]	Schloss P D,Westcott S L,Ryabin T,et al. Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology,2009,75(23):7537-7541.

[20]	Elmar P,Christian Q,Katrin K,et al. SILVA:a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J]. Nucleic Acids Research,2007(21):7188-7196.

[21]	Wang Q,Carrity G M,Tiedje J M,et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(16):5261-5267.

[22]	高菊生,黄晶,董春华,等. 长期有机无机肥配施对水稻产量及土壤有效养分影响[J]. 土壤学报,2014,51(2):314-324. Gao J S,Huang J,Dong C H,et al. Effects of long-term combined application of organic and chemical fertilizers on rice yield and soil available nutrients[J]. Acta Pedologica Sinica,2014,51(2):314-324(in Chinese with English abstract).

[23]	陶磊,褚贵新,刘涛,等. 有机肥替代部分化肥对长期连作棉田产量、土壤微生物数量及酶活性的影响[J]. 生态学报,2014,34(21):6137-6146. Tao L,Chu G X,Liu T,et al. Impacts of organic manure partial substition for chemical fertilizer on cotton yield,soil microbial community and enzyme activities in mono-cropping system in drip irrigation condition[J]. Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6137-6146(in Chinese with English abstract).

[24]	Zhao J,Ni T,Li J,et al. Effects of organic-inorganic compound fertilizer with reduced chemical fertilizer application on crop yields,soil biological activity and bacterial community structure in a rice-wheat cropping system[J]. Applied Soil Ecology,2016,99:1-12.

[25]	Kandeler E,Stemmer M,Klimanek E M. Response of soil microbial biomass,urease and xylanase within particle size fractions to long-term soil management[J]. Soil Biology and Biochemistry,1999,31(2):261-273.

[26]	臧逸飞,郝明德,张丽琼,等. 26年长期施肥对土壤微生物量碳,氮及土壤呼吸的影响[J]. 生态学报,2015,35(5):1445-1451. Zang Y F,Hao M D,Zhang L Q,et al. Effects of wheat cultivation and fertilization on soil microbial biomass carbon,soil microbial biomass nitrogen and soil basal respiration in 26 years[J]. Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1445-1451(in Chinese with English abstract).

[27]	Cardinale B J,Srivastava D S,Duffy J E,et al. Effects of biodiversity on the functioning of trophic groups and ecosystems[J]. Nature,2006,443(7114):989-992.

[28]	Zhao J,Zhang R F,Xue C,et al. Pyrosequencing reveals contrasting soil bacterial diversity and community structure of two main winter wheat cropping systems in China[J]. Microbial Ecology,2014,67(2):443-453.