木质纤维素由纤维素、木质素和半纤维素等组成,木质纤维素的降解是碳循环必不可少的过程之一。木质纤维素的最主要成分是纤维素,约占木质纤维素干质量的45%,半纤维素占木质纤维素干质量的25%~30%,其余成分主要为木质素^[1]。纤维素和半纤维素通过降解生成葡萄糖、半乳糖和木聚糖等,进而被转化成乙醇、甲烷等生物燃料,具有广阔的应用前景^[2-3]。细菌、真菌、放线菌甚至动物都能够降解木质纤维素^[4]。真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)和康氏木霉(Trichoderma koningii)因其产酶能力强,被广泛应用于纤维素酶的工业生产中。细菌具有生长速度快,适应环境能力强,产酶种类多以及更易发挥协调作用等优势,因此,细菌降解木质纤维素具有重要的研究价值和开发前景。随着基因组学的发展,高通量测序技术成为批量筛选木质纤维素降解菌的有效手段之一。应用测序和生物信息学技术,比对木质纤维素的降解菌群,筛选或改造获得高效纤维素降解菌成为木质纤维素降解研究的发展趋势^[5]。

假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)在分类地位上属于变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)。Finkmann等^[6]在废气处理厂的生物过滤器中首次分离得到1株细菌,并将其划分假黄单胞菌属。Lee等^[7]从汽油污染沉淀物中分离得到Pseudoxanthomonas spadix BD-a59,并证实其能够降解6种苯系物。Weon等^[8]从棉花废弃物中分离得到1株P.suwonensis。Kumar等^[9]从半沙漠土壤中分离到木质纤维素降解菌群,其中的菌株Pseudoxanthomonas sp.R-28在培养5 d后,能100%降解滤纸。Du等^[10]研究发现P.tanwanensis在降解纤维素的复合菌群中可以起到极大地提高乙醇产量的作用。假黄单胞菌属细菌在木质纤维素降解方面存在很高的研究价值。截至2015年9月,假黄单胞菌属仅有P.suwonensis 11-1(CP002446)和P.spadix BD-a59(CP003093)的全基因组序列公开发表在NCBI数据库中。

本研究筛选出1株能够降解木质纤维素的假黄单胞菌Pseudoxanthomonas sp.J1(CP011144)^[11],通过分析菌株J1的基因组,并比对同属2株细菌的基因组,找出菌株J1降解木质纤维素的关键酶基因,同时预测出菌株J1生成乙醇的代谢通路。

新鲜土壤混合物采集于江苏省南京市钟山植物风景区,包含约5~10 cm腐朽的树根处的新鲜土壤和腐烂树叶。

国药集团的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)等化学试剂;TaKaRa公司载体克隆试剂盒(pMD^TM 19-T Vector Cloning Kit);Omega公司细菌DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Kit);Thermo Fisher公司的核酸定量试剂盒(PicoGreen^® dsDNA Quantitation Reagent);北京全式金公司的PCR体系(2×EasyTaq PCR SuperMix)和感受态细胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)等。

富集培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5.0 g,NH₄H₂PO₄ 0.5 g,KH₂PO₄ 2.0 g,MgSO₄ 2.0 g,NaCl 0.3 g,MnSO₄·H₂O 0.425 g,FeSO₄·7H₂O 0.008 g,加水定容至1 L,调pH值至7.0^[12]。

初筛培养基:CMC-Na 10 g,K₂HPO₄ 2 g,MgSO₄ 0.3 g,蛋白胨10 g,(NH₄)₂SO₄ 2.5 g,放线菌酮(Sigma公司,终浓度为25 mg·mL^-1,用于抑制真菌生长^[13]),琼脂 10 g,加水定容至1 L,pH自然^[14]。

复筛培养基(纤维素刚果红培养基):刚果红0.2 g,纤维素粉0.8 g,NaNO₄ 1.0 g,Na₂HPO₄ 1.2 g,KH₂PO₄ 0.9 g,MgSO₄ 0.5 g,KCl 0.5 g,酸水解酪蛋白 0.5 g,琼脂15 g,加水定容至1 L,加热溶解后,121 ℃灭菌15 min。

产酶发酵培养基:CMC-Na 10 g,KH₂PO₄ 1.5 g,Na₂HPO₄ 2.5 g,(NH₄)₂SO₄ 1.5 g,MgSO₄ 0.3 g,CaCl₂ 0.1 g,FeSO₄·7H₂O 0.005 g,MnSO₄·H₂O 0.002 g,ZnCl₂ 0.002 g,CoCl₂ 0.002 g,加水定容至1 L,调pH值至7.0^[15]。

称取新鲜土壤混合物5 g,放入已灭菌的250 mL锥形瓶中,加入45 mL ddH₂O,制成稀释度为10^-1的土壤混合液,120 r·min^-1振荡40 min后,5 000 r·min^-1离心10 min。取5 mL离心后的上清液,加入到100 mL富集培养基中,28 ℃、160 r·min^-1培养48 h。取出100 μL富集培养基液,加900 μL ddH₂O制成稀释度为10^-2的稀释液,依此类推,分别配制稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的混合液并各取出100 μL,涂布到初筛培养基上,28 ℃倒置培养7 d。将长出的菌落接种到复筛培养基上,挑选出能够利用纤维素粉作碳源的菌株。用刚果红染色法挑选生长较快、透明圈直径较大的菌落,测定纤维素相关酶活力。挑选出的优势菌株采用平板划线法纯化培养^{[14, 15]}。

取100 μL保存的细菌菌种,涂布到LB平板上,28 ℃复苏培养24 h。将单菌落接种到10 mL LB肉汤培养基中,160 r·min^-1培养24 h,制成接种液。在250 mL已灭菌的锥形瓶中倒入50 mL产酶发酵培养基,取1 mL接种液(接种量2%)加入培养基中,每个反应设3个重复。28 ℃、160 r·min^-1摇床培养4 d,每隔12 h取出1次培养液。10 000 r·min^-1离心10 min后,取上清液即为粗酶液。

粗酶液先与终止剂作用为空白对照。每个反应测定3个平行试验。

滤纸酶(FPase):以Whatman 1号滤纸作为反应底物。取1 cm×6 cm(50 mg±0.5 mg)滤纸条,加1 mL醋酸钠缓冲液(浓度为50 mmol·L^-1,pH₅.5),使滤纸浸没在缓冲液中,50 ℃预热5 min。加入0.5 mL粗酶液,50 ℃准确反应60 min,立即加入3 mL DNS终止反应。将液体混匀后沸水浴5 min,待冷却至室温后,取200 μL至96孔酶标板中,用酶标仪测定540 nm处吸光值(D₅₄₀)。

内切葡聚糖苷酶(CMCase):以含20 g·L^-1 CMC-Na的醋酸钠缓冲液(浓度为50 mmol·L^-1,pH₅.5)作为反应底物。取400 μL CMC-Na溶液,加入100 μL粗酶液,50 ℃准确反应30 min后立即加入1 mL DNS终止反应。混匀后沸水浴5 min,待冷却至室温后,取200 μL至96孔酶标板中,用酶标仪测定540 nm处吸光值(D₅₄₀)。

β-葡萄糖苷酶(BG)^[18]:以10 mmol·L^-1的p-NPG溶液为反应底物。取50 μL粗酶液,加入50 μL p-NPG溶液和100 μL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(pH₅.5),45 ℃水浴10 min后加800 μL的Na₂CO₃溶液(浓度为1 mol·L^-1)终止反应,反应混合液于4 ℃下10 000 r·min^-1离心15 min,取200 μL上清液至96孔酶标板中,用酶标仪测定410 nm处吸光值(D₄₁₀)。

参考国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法^[17]和国家标准^[19]:FPase和CMCase以反应条件下每mL粗酶液每分钟产生1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个国际单位;β-葡萄糖苷酶活力单位定义为:反应条件下每mL粗酶液每分钟产生1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量。酶活力计算公式为:X=(A×V_T×1 000)/(M×V×T)。式中:X为试样中纤维素酶活力(IU·mL^-1);A为根据标准曲线计算的葡萄糖或对硝基苯酚含量(mg·mL^-1);V_T为反应液总体积(mL);M为葡萄糖摩尔质量(180.2 g·mol^-1)或对硝基苯酚摩尔质量(139.1 g·mol^-1);V为反应中加入的粗酶液体积(mL);T为反应时间(min)。

取CMC-Na液体培养基中生长到对数期的培养液,10 000 r·min^-1离心20 min,倒去上清液,加入1 mL已灭菌的1×TE缓冲液清洗掉残余的CMC-Na,离心后倒去上清液,重复3次,收集细菌菌体沉淀,采用细菌DNA提取试剂盒提取gDNA。

以本研究中菌株的gDNA作模板进行16S rRNA的PCR扩增,其PCR产物电泳后切胶回收纯化。参照TaKaRa公司pMD^TM 19-T载体克隆试剂盒进行连接、转化和M13 PCR扩增,将PCR产物纯化后送至上海英骏公司测序分析。PCR引物序列:27F:TACGGYTACCTTGTTACGACTT,1492R:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT,
M13R:CAGGAAACAGCTATGACC。测序结果采用BLASTn数据库进行比对分析,利用贝叶斯算法^[20](MrBayes version 3.2.1)并结合GTR+G+I模型绘制16S rRNA系统发育树。为提高可信度,抽取全基因组的核心基因(core gene),自展值(Bootstrap)设置为1 000 000,绘制菌株的核心基因系统发育树。

采用NCBI Glimmer(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi)预测开放阅读框(ORF)和编码序列(CDS);通过NCBI的PGAAP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/)获得全基因组序列的注释;通过蛋白相邻类的聚簇(COGs)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)全面预测假黄单胞菌的基因组功能信息^[21];使用碳水化合物活性酶(CAZy)数据库(http://www.cazy.org/)中的注释,找出与纤维素和半纤维素降解相关的糖苷水解酶(GHs)及相关的碳水化合物结合域(CBMs)^[22];采用KEGG数据库(http://www.kegg.jp/)分析纤维素降解通路^[23];下载NCBI中漆酶(Lac)、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)等木质素降解酶序列预测木质素降解酶基因,构建本地蛋白数据库,与本研究中菌株的蛋白序列进行BLASTp比对,其中对齐长度(alignment length)大于等于90%,一致性(identity)大于等于50%。

经过平板初筛和复筛,共筛选出27株能利用2种纤维素作为唯一碳源的细菌,对其中12株进行全基因组测序。培养7 d后通过刚果红染色法对比其透明圈大小,结果(表 1)显示:菌株J1生长速度快,纤维素酶活力较高,因此,挑选出菌株J1作为优势菌株。

菌株J1生长情况以600 nm处吸光值(D₆₀₀)表示。由图 1可见:菌株J1从36 h开始进入生长稳定期。滤纸酶活力(FPase)变化趋势与菌株J1的生长周期基本吻合。在48 h左右,FPase达到最大值0.18 IU·mL^-1,72 h开始缓慢下降。FPase可以反映内切葡聚糖苷酶(内切纤维素酶,CMCase)、外切葡聚糖苷酶(外切纤维素酶,CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)对底物的协同作用。相同培养条件下的β-葡萄糖苷酶活性峰值为0.11 IU·mL^-1。菌株产CMCase速度较快,在24~48 h时酶活力较高,峰值为0.39 IU·mL^-1,48 h之后酶活力变化不明显。

	图 1 菌株J1的生长曲线和FPase、CMCase、BG活力 Fig. 1 The growth curve and FPase,CMCase, BG activities of strain J1
图选项

将菌株J1的16S rRNA基因在NCBI数据库(2016年1月)中进行BLASTn分析比对。由系统发育树(图 2-A)分析可知,菌株J1与菌株Pseudoxanthomonas daejeonensis TR6-08相似度最高(91%)。抽取与菌株J1相似度较高的细菌全基因组核心基因序列,使用贝叶斯算法绘制系统发育树,结果表明菌株J1与Pseudoxanthomonas suwonensis 11-1亲缘关系最近(图 2-B),初步鉴定菌株J1为Pseudoxanthomonas sp.。

	图 2 依据菌株J1的16S rRNA(A)和全基因组核心基因序列(B)构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain J1 based on 16S rRNA(A)and genome core gene sequences(B)
图选项

由3株假黄单胞菌基因组信息及PGAAP(NCBI)注释结果(表 2)可知:菌株J1的GC含量和基因数略高于其他2株同属细菌,基因数目和注释比例与P.suwonensis 11-1相当。

3株假黄单胞菌基因组经COG数据库BLASTp比对,预测可能与木质纤维素降解过程有关的功能基因(图 3),如参与氨基酸转运和代谢、细胞壁/膜生物合成、能量产生和转化以及糖类代谢和转化等。菌株J1的这些功能基因数目均高于同属的P.suwonensis 11-1和P.spadix BD-a59,说明菌株J1与这2株假黄单胞菌相比,可能对木质纤维素降解更具有优势。

图 3 3株假黄单胞菌属细菌的基因组功能分类 Fig. 3 COG class of three Pseudoxanthomonas strains genomes [S]:未知功能;[R]:一般功能预测;[E]:氨基酸转运和代谢;[J]:翻译、核糖体结构和生物起源说;[M]:细胞壁/膜生物起源;[C]:能量产生和转化;[P]:无机离子转运和代谢;[O]:翻译后修饰、蛋白转换和分子伴侣;[T]:信号转导机制;[L]:复制、重组和修复;[G]:糖类转运和代谢;[H]:辅酶转运和代谢;[K]:转录;[I]:油脂转运和代谢;[F]:核酸转运和代谢;[V]:防御机制;[U]:胞内运输、分泌和液泡运输;[D]:细胞周期调控、细胞分裂和染色体分区;[Q]:次生代谢产物合成、转运和异化;[N]:细胞运动 [S]:Function unknown;[R]:General function prediction only;[E]:Amino acid transport and metabolism;[J]:Translation,ribosomal structure and biogenesis;[M]:Cell wall/membrane envelope biogenesis;[C]:Energy production and conversion;[P]:Inorganic ion transport and metabolism;[O]:Posttranslational modification,protein turnover,chaperones;[T]:Signal transduction mechanisms;[L]:Replication,recombination and repair;[G]:Carbohydrate transport and metabolism;[H]:Coenzyme transport and metabolism;[K]:Transcription;[I]:Lipid transport and metabolism;[F]:Nucleotide transport and metabolism;[V]:Defense mechanisms;[U]:Intracellular trafficking,secretion and vesicular transport;[D]:Cell cycle control,cell division and chromosome partitioning;[Q]:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism;[N]:Cell motility

图选项

经CAZy数据库注释,预测Pseudoxanthomonas sp.J1和P.suwonensis 11-1分别含有来自26个糖苷水解酶家族(GH Family)的44和47种水解酶,P.spadix BD-a59仅有来自10个GH家族的26种相关酶。菌株J1、P.suwonensis 11-1和P.spadix BD-a59碳水化合物结合域(CBMs)的数量分别为8、6和9个,其主要作用是帮助纤维素酶绑定在纤维素分子表面,促使酶的催化域接近纤维素分子,从而有效地水解纤维素;且CBM在外切葡聚糖的启动以及持续水解中均起到非常重要的作用^[24]。

3株假黄单胞菌菌株都含有的GH家族(表 3)为:降解纤维素的β-葡萄糖苷酶(GH₃)和内切葡聚糖酶(GH₅);降解半纤维素的甘露聚糖酶(GH₅)、α-淀粉酶(GH₁₃)及附着于GH₁₃上并起糖原结合作用的CBM48。其他与纤维素降解酶(GH₈、GH₉和GH₁₆)以及半纤维素降解酶(GH₂、GH₁₀、GH₁₅和GH₃₁)相关的蛋白仅存在于菌株J1和P.suwonensis 11-1中^[25];而编码β-葡萄糖苷酶(GH₁)、内切-β-1,4-木聚糖酶(GH₃₀)和具有纤维素结合功能的CBM6,仅存在于菌株J1的基因组中。除此之外,预测菌株J1还具有编码几丁质酶(GH₁₈)和β-葡糖醛酸酶(GH₁₀₅)等基因的功能。

经过与木质素酶的BLASTp比对分析结果可知:菌株J1具有多个Lac和LiP蛋白编码基因。基因位点WQ53_04320所编码的蛋白与同属细菌P.suwonensis的Lac(WP_052633915)编码基因相似度最高(99.60%),WQ53_13190与Burkholderia sp.的LiP(KDB09622)编码基因相似度为99%。除此之外,菌株J1还具有多铜氧化酶(基因位点WQ53_09035,蛋白登录号CCE66430,相似度98%)和过氧化氢-过氧化物酶(基因位点WQ53_13190,蛋白登录号ACI65560,相似度99%)等木质素辅助酶编码基因^[26],说明菌株J1也具有降解木质素的能力。

菌株J1中89.56%的基因能够在KEGG得到注释,并预测出481种代谢通路。分析预测结果绘制出菌株J1降解纤维素生成乙醇的代谢通路(图 4)。菌株J1可以利用纤维素为底物,降解纤维素为六碳糖并参与磷酸戊糖途径。生成的乙酰辅酶A可以经丙酮酸脱氢酶(EC₂.3.3.1,WQ53_03580)催化进入三羧酸循环;也可经过乙酰辅酶A合酶催化生成乙醛,并最终生成乙醇。

图 4 菌株J1降解纤维素生成乙醇代谢通路 Fig. 4 Metabolic pathway from cellulose to ethanol of strain J1 箭头上标注的是菌株J1的基因位点标签和酶编号。G-3P:3-磷酸甘油醛;G-1,3P2:1,3-二磷酸甘油酸;PEP:磷酸烯醇式丙酮酸;2-H-ThPP:2-羟乙基二磷酸硫胺;S-A-E:二氢硫辛酰基乙酰基转基酶;Li-E:硫辛酰胺酶;Di-E:二氢硫辛酰胺酶 Labels on the arrows are enzyme commission number and locus_tag. of strain J1. G-3P:Glyceraldehyde-3P;G-1,3P2:Glycerate-1,3P2;PEP:Phosphoenolpyruvate;2-H-ThPP:2-hydroxyethyl-ThPP;S-A-E:S-acetyldihydrolipoamide-E;Li-E:Lipoamide-E;Di-E:Dihydrolipoamide-E

图选项

本试验采用初筛和复筛的方法,结合高通量测序技术和生物信息学分析方法,筛选出了1株降解木质纤维素的假黄单胞菌菌株J1,并进行全基因组测序。菌株J1的纤维素酶活力与Rastogi等^[27]筛选的2株芽孢杆菌相比(培养9 d,内切纤维素酶和滤纸酶活力分别为0.12和0.03 IU·mL^-1)有明显优势,与Gupta等^[28]筛选的8株纤维素降解菌(培养3 d,内切纤维素酶和滤纸酶活力最高值分别为0.40和0.20 IU·mL^-1)酶活力相当。数据库对比结果显示:菌株J1的基因组中含有多个木质素降解酶基因,进一步验证了假黄单胞菌属对木质纤维素的降解能力^{[9, 10]}。分析假黄单胞菌属的3株细菌的基因组发现:2种糖苷水解酶家族(GH₁和GH₃₀)基因和1种碳水化合物结合域(CBM6)仅在菌株J1的基因组中可以预测到,说明该菌株在纤维素降解方面可能更具潜力。通过KEGG数据库预测出菌株J1将纤维素转化为乙醇的代谢通路,为研究生物乙醇发酵的调控过程提供依据,菌株J1同时也可作为发酵乙醇的目标菌种。

纤维素是木质纤维素的主要成分,利用纤维素发酵生产生物乙醇等燃料具有极大的研究和实用价值。在农业和工业应用中,许多国家把作物秸秆、硬木和城市生活垃圾中的纤维素变废为宝,但传统化学处理方法成本高、污染大^[1]。在科研方面,对传统木质纤维素降解的研究大多停留在蛋白表达水平。大多数好氧纤维素降解菌,如芽孢杆菌属(Bacillus)、木霉属(Trichoderma)和链霉菌属(Streptomyces)等,通过分泌游离的纤维素酶来协同降解纤维素^[29]。厌氧肠道菌等通过产生纤维小体分泌到胞外,纤维小体是包含多种纤维素酶和半纤维素酶的多酶复合体^[30]。基因组学、宏基因组学、转录组学和蛋白组学中的生物信息分析方法,对全面了解木质纤维素降解机制具有很大帮助。从近些年基因水平的分析来看,木质纤维素的降解很可能存在新的酶系和降解途径。例如:产琥珀酸杆菌(Fibrobacter succinogenes)和哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)能高效降解纤维素^[31-32],但不产生游离的纤维素酶或纤维小体。其基因组序列中只含有编码内切纤维素酶的基因,缺失外切纤维素酶和碳水化合物结合模块的编码基因,可能存在细胞结合型非复合体纤维素酶系^[33-34]。大多数好氧和厌氧微生物只能产生同一家族的纤维素酶,且只有1种厌氧真菌能产生GH₇的纤维素酶^[35];一些嗜热菌,例如热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)能高效降解未经预处理的纤维素,其降解机制可能不同于现有的纤维素降解微生物^[36]。

菌株J1可以在低温环境中生长,也可能产生低温木质纤维素酶。细菌的培养基成分和培养条件是影响菌株产酶活力的重要因素,通过优化产酶条件,可以提高菌株J1的纤维素酶活力。菌株J1基因组中特有的糖苷水解酶家族基因可能来自于其他细菌的水平转移。假黄单胞菌属细菌不仅能够降解木质纤维素,而且能有效降解苯系物^[7-10],因此,菌株J1也可能具有苯系物降解酶基因。以上假设还需要进一步研究和验证。