假单胞菌是鲜肉中的常见腐败菌之一,是冷鲜肉流通过程中腐败的重要原因,由此造成肉品重大的经济损失。在畜禽肉的屠宰、加工、运输、销售和消费过程中,如果没有合适、成熟的加工方法以及良好的环境,鲜肉极易因为假单胞菌的感染而变质^{[1, 2]}。因此,对肉品中假单胞菌的生长状况进行监测和控制十分重要^[3]。

目前,对于冷鲜肉中假单胞菌的预测一般是利用数学模型定性或定量描述,研究肉品流通过程中的环境因素(如温度、湿度、包装等),以及一些肉品的相关特性(如pH值、感官得分等)对假单胞菌生长状况的影响,预测其菌落数和货架寿命,最终建立其生长动力学模型^{[4, 5, 6]}。国内对于这类假单胞菌的预测模型已有相关报道。傅鹏等^[7]利用Gompertz模型拟合不同温度条件下假单胞菌的生长状况,得到假单胞菌生长的二级模型;邱静等^[8]运用Logistic方程构建不同气调CO₂比例下假单胞菌的生长概率模型,研究气调保鲜冷却猪肉中假单胞菌的生长概率。这些假单胞菌的生长模型都可以用来描述假单胞菌菌落数与时间的数学关系^[9],但是这些模型的建立都要基于传统的微生物活菌数、代谢产物等的检测,需要对样品进行破坏性检测,步骤繁琐,费时费力,不能及时快速地得到结果。因此,开发一种无损、快速、准确的方法对肉品中假单胞菌的生长状况进行监控显得非常重要。

高光谱图像兴于20世纪80年代,同时具有光谱检测和图像检测的优点^[10]。光谱技术可以用来检测样品内部的物理结构和化学成分,图像技术可以用来较为全面地反映样品的外部信息,这二者结合能够对样品获得全面的综合信息^[11]。目前,利用高光谱图像技术对微生物进行非破坏性地、快速简单地检测已有少量的报道。Yoon等^[12]用高光谱图像对弯曲杆菌的纯培养物进行检测,在微生物的培养过程中,菌落的生长、代谢产物的产生、培养基的消耗以及营养物质的降解导致的颜色和成分的变化,均会引起高光谱图像和光谱特征的变化。目前还未有高光谱图像技术模拟假单胞菌生长状况的研究,因此本文使用高光谱建立假单胞菌的生长模型,并对其不同的培养阶段进行区分,为进一步对冷鲜肉的研究提供理论和技术支撑。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),分离自牛奶中,在4 ℃条件下保藏于南京农业大学食品科技学院实验室。

营养琼脂培养基配方:蛋白胨10.0 g,牛肉浸膏3.0 g,氯化钠5.0 g,琼脂20.0 g,水1 000 mL,pH值为7.3±0.1。

高光谱图像检测系统主要包括成像光谱仪(ImSpector V10E型,芬兰SPECIM公司),CCD摄像机(Bobcat ICL-1620型,Imperx,USA),可调节的卤钨灯(0~150 W,EKE-ER型,Illumination Technologies Inc.),水平机动化平台,配有图像采集软件的计算机(台湾五铃光学股份有限公司)。

保藏菌种接种到营养琼脂培养基上,在30 ℃、相对湿度85%条件下活化3 d后,再次接种进行二次活化。将活化好的菌种用无菌生理盐水反复冲刷,制成细菌悬浮液,配制成一定浓度的菌悬液,10倍系列稀释,接种,使平板的初始菌落数分别为10²和10⁴ CFU · mL^-1,记为A组和B组。为考虑样本的一致性,在制备样本时,每个培养皿倾倒的培养基量为(15±2)mL,培养基厚度为(2.0±0.5)mm,待培养基冷却凝固后,取100 μL菌悬液均匀涂布在培养基上。共制备250个样品,其中50个为对照组,200个为处理组(A组和B组的假单胞菌样本各100个),在37 ℃、相对湿度85%的条件下培养2 d,每12 h进行高光谱检测和菌落单位数计算。

试验采用高光谱图像检测系统的反射模式对铜绿假单胞菌的生长状况进行检测。该系统的成像光谱仪有效波长范围为400~1 000 nm,共420个波段^[13]。高光谱图像检测系统如图 1所示,通过预试验设定试验参数为:相机镜头和光源拍摄物的距离分别为30和20.5 cm,光照强度为67.5 W且以45°对准样本,曝光时间为4 ms,输送速度为2.5 mm · s^-1[14]。试验分别于0、12、24、36和48 h 进行高光谱检测,每次测定取10个对照和40个处理样品(A组和B组的铜绿假单胞菌样本各20个),测完后将样本舍弃不用,试验结束后共获得250个样本的高光谱图像数据。

	图 1 高光谱图像系统示意图 Fig. 1 The schematic diagram of hyperspectral imaging system
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为消除图像噪声,对获取的高光谱图像进行黑白校正。在铜绿假单胞菌图像采集同样的条件下,覆盖相机镜头得到全黑的反射图像,再扫描聚四氟乙烯白板(反射率为99%)得到全白的反射图像,然后通过式(1)得到校正后的图像^[15]。

每次对样本的高光谱图像及光谱信息获取后,参照国标(GB 4789.2—2010)^[16]对每个平板进行菌落计数,取平均值。

将获取的高光谱图像信息利用ENVI 4.8系统软件、MATLAB 7.1统计工具箱和SPSS 18.0软件处理,选择合适的波段,采用3种方法提取有效的光谱和图像信息,来模拟铜绿假单胞菌的生长状况。

利用ENVI软件创建感兴趣区域(ROI),ENVI软件是采用交互式数据语言IDL(interactive data language)开发的遥感图像处理软件,功能强大,能够从高光谱图像中快速准确地提取信息^[17]。在处理过程中,选择培养基中铜绿假单胞菌菌落生长区域的500个像素点作为ROI区域,0 h时和对照组未产生菌落,则选取培养基的中间部位作为ROI区域,然后计算ROI区域光谱值。提取不同培养时间光谱值差异较大的光谱区间(A组为920~960 nm,B组为910~960 nm)的光谱均值作为特征参数(方法1)。同时利用ENVI 4.8软件进行掩模图形处理,将选取的ROI区域进行正向主成分分析,选择第1主成分图像进行掩模,将掩模得到的图形与样本高光谱图像比较,根据光谱值改变,调整掩模得到的图形,以确保准确性,然后使用MATLAB 7.1软件计算ROI区域菌落所占培养皿比例(方法2)。利用SPSS 18.0软件进行光谱值的主成分分析(PCA),提取光谱值第1主成分得分(方法3)。

将铜绿假单胞菌5个检测点的20个样本随机选取15个作为训练集,求取平均值,剩下5个作为验证集,通过MATLAB统计工具箱中Curve Fitting Tool软件进行拟合,建立生长模型。MATLAB工具箱提供多种拟合函数,由于微生物生长模型一般通过S型曲线来描述,在S型曲线模型中,大多数研究认为Logistic模型是拟合较佳的一个模型^{[18, 19]},因此使用MATLAB拟合工具箱中自定义函数定义Logistic模型来拟合铜绿假单胞菌的生长,采用的方程式如下:

模型的拟合性能通过模型决定系数(R²)、平方误差和(SSE),以及与实际铜绿假单胞菌菌落数的相关系数(r)来综合评价。相关性确定两种属性之间的关系,决定系数(R²)和SSE公式如下:

从图 2可以看出:铜绿假单胞菌的生长速度较快,在12 h时,平板上已经有铜绿假单胞菌菌落出现;到24 h,培养基上有大量菌落出现并且菌落生长的区域呈现浅绿色,因为铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上会产生带荧光的水溶性青脓素与绿脓素,24 h之后由于色素的进一步积累,培养基大部分区域呈现绿色;48 h时,菌落遍布培养基,并且有新的红色色素产生,A组绿色加深,菌落边缘带有淡红色,而B组大量菌落聚集处呈现墨绿色,边缘带有紫红色。

	图 2 铜绿假单胞菌的样品图(a)和高光谱RGB图像(b) Fig. 2 The samples pictures(a)and typical reflectance hyperspectral images(b)of Pseudomonas aeruginosa A组和B组表示初始菌落数分别为102和104 CFU · mL-1。A group and B group indicate that the initial number of colony are 102 and 104 CFU · mL-1,respectively. The same as follows.
图选项

由图 3可见:在铜绿假单胞菌5个培养阶段的反射光谱曲线中,400~900 nm波段范围内铜绿假单胞菌的光谱值在各个培养阶段重叠交织,没有明显的变化趋势,这一波长范围的光谱值变化并不能很好地体现铜绿假单胞菌的生长状况。而在900~1 000 nm波段范围,各个时间段的光谱值变化有一定的规律性,随着培养时间延长,光谱值呈上升趋势,而且最大反射光谱值出现在波长为915 nm处的波峰,最小反射光谱值出现在波长为963 nm处的波谷。这是因为在915 nm处的光谱值主要与代谢产物中的C—H、N—H键的伸缩有关,在接近970 nm处的光谱值主要与水分子中的O—H键伸缩有关,而铜绿假单胞菌在营养琼脂平板上培养时产生大量湿润的菌落^[20]。这一波段范围的光谱值变化可以较大程度地体现铜绿假单胞菌的生长状况^{[21, 22, 23]}。

	图 3 铜绿假单胞菌的平均光谱值 Fig. 3 Average original spectra of P.aeruginosa
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由图 4可见:A处理组第1、第2主成分贡献率分别为74.01%和24.28%,B处理组第1、第2主成分贡献率分别为90.99%和6.66%,2个处理组前2个主成分之和均超过90%,所以对高光谱图像进行主成分变换过程中,图像原有的一些特性发生了改变,但仍可以反映原数据所提供的绝大部分信息,并且简化了数据。各个培养阶段的样品点各自聚集,只有个别样品点有重叠,说明假单胞菌的光谱值在不同的培养阶段是有区别的,其生长状况可以通过光学方法来区分。在主成分分析中,0 h与48 h的样品点距离最大,而生长阶段越接近,样品点分布越接近。因为铜绿假单胞菌培养时间越长,菌落越多,颜色越深,培养基的营养物质降解得越多,光谱值变化越大,所以样品点分布离得也越远。

	图 4 铜绿假单胞菌的主成分分析 Fig. 4 Results of principal component analysis of P.aeruginosa
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由图 5可见:在0、12、24、36和48 h这5个培养阶段,A组的菌落数分别为1.0×10²、3.6×10⁵、3.2×10⁶、6.0×10⁶和5.4×10⁷CFU·mL^-1,B组分别为1.0×10⁴、2.0×10⁶、7.2×10⁶、3.2×10⁷和6.0×10⁷ CFU·mL^-1。通过MATLAB拟合得到的A、B两处理组的生长曲线和方程如图 5所示,R²分别为0.977 7和0.985 6,SSE分别为0.437 9和0.130 3。一般而言,模型的R²越接近1,SSE越接近于0,其拟合程度越高,基于菌落计数法对2个处理的铜绿假单胞菌建立的生长模型R²在0.95以上,SSE较小,所以模型与数据的拟合程度较好。

	图 5 基于菌落计数法建立的生长模型 Fig. 5 Fitting the growth curve by colony counting method
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从图 3可知:A处理组在400~480 nm波段范围内噪声对光谱值影响较大,不能用于数据分析;在480~900 nm波段范围内不同时间段的铜绿假单胞菌的光谱值有重叠,其生长阶段不能明显区分,也不适宜用于光谱分析;而在曲线最高波峰到拐点处,铜绿假单胞菌在不同时间段的光谱值变化最大,可以最大程度体现其生长规律差异,所以A组选取920~960 nm波段内的平均反射光谱值用于模型拟合。同理,B组选取910~960 nm波段内的平均反射光谱值用于模型拟合。

A组5个培养阶段的平均光谱值分别为929.688、990.158、1 066.040、1 081.587和1 119.373,取以10为底的对数为2.96、2.99、3.02、3.03和3.04;B组5个培养阶段的平均光谱值分别为931.160、1 055.985、1 120.925、1 164.549和1 205.373,取以10为底的对数为2.96、3.02、3.04、3.06和3.08。通过MATLAB拟合得到的A、B两处理组的生长曲线和方程如图 6所示,其拟合模型的训练集R²分别为0.993 2和0.978 5,SSE分别为2.900×10^-5和1.825×10^-4,验证集R²分别为0.873 0和0.940 3,SSE分别为0.008 30和0.015 25。两处理组基于平均光谱值拟合的生长模型与基于传统菌落计数法拟合的生长模型间的相关系数(r)分别为0.99和0.95,说明基于平均光谱值建立的铜绿假单胞菌模型不仅拟合程度较好,而且具有较高的准确性,与铜绿假单胞菌的实际生长状况较为相符,其中B组建立的模型综合性能更好。

	图 6 基于平均光谱值建立的铜绿假单胞菌生长模型 Fig. 6 itting the growth curve of P.aeruginosa by average spectra
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从图 7可见:白色区域是菌落生长的区域,将对照组和0 h菌落未生长的样本记为0,其他以菌落未生长样本为基准得出对应值,然后计算A组和B组5个培养阶段的菌落所占培养皿比例,以此构建生长模型预测铜绿假单胞菌的生长趋势。经过计算,A组在5个培养阶段菌落所占培养皿比例分别为0、0.31、0.52、0.76和0.90,B组分别为0、0.56、0.77、0.89和0.98。

	图 7 铜绿假单胞菌的掩模图形 Fig. 7 Mask pattern of P.aeruginosa
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如图 8所示:2个处理组的拟合模型训练集R²分别为0.978 3和0.989 6,SSE分别为0.011 18和0.006 38,验证集R²分别为0.954 2和0.903 4,SSE分别为0.000 28和0.001 96。基于掩模图形拟合的生长模型与基于传统菌落计数法拟合的生长模型间的相关系数(r)分别为0.92和0.96,说明基于掩模图形建立的铜绿假单胞菌模型拟合程度较好,具有较高的准确性,能很好地模拟铜绿假单胞菌的生长。

	图 8 基于掩模图形建立的铜绿假单胞菌生长模型 Fig. 8 Fitting the growth curve of P.aeruginosa by mask pattern data
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对铜绿假单胞菌的光谱值进行PCA分析时,400~480 nm波段范围内噪音对光谱值影响较大,所以选择480~1 000 nm波段内铜绿假单胞菌的反射光谱值。A组在5个培养阶段的第1主成分得分分别为-1.286、-0.505、0.220、0.422和1.149,B组分别为-1.401、0.005、0.253、0.461和0.682,铜绿假单胞菌的拟合模型如图 9所示。2个处理组的拟合模型训练集R²分别为0.978 1和0.970 1,SSE分别为0.075 81和0.080 61,验证集R²分别为0.805 7和0.836 2,SSE分别为0.095 37和0.104 61。基于光谱值第1主成分得分拟合的生长模型与基于传统菌落计数法拟合的生长模型间的相关系数(r)分别为0.96和0.94,说明基于光谱值第1主成分得分建立的铜绿假单胞菌模型拟合程度较好,具有较高的准确性,可以较好地模拟铜绿假单胞菌的生长状况。

	图 9 基于光谱值第1主成分建立的铜绿假单胞菌生长模型 Fig. 9 Fitting the growth curve of P.aeruginosa by score of PC1
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基于3种方法提取的高光谱图像参数对铜绿假单胞菌建立的生长拟合曲线,与基于传统菌落计数法 对铜绿假单胞菌建立的生长拟合曲线较为相似,有较高的相关性,说明高光谱图像技术能较好地模拟铜绿假单胞菌的生长。A、B两种处理的铜绿假 单胞菌的生长模型训练集R²为0.970 1~0.993 2,SSE为0.000 03~0.080 61,验证集R²为0.805 7~0.954 2,SSE为0.000 28~0.104 61,说明这3种方法建立的模型对数据的拟合度较好,准确率较高。而且基于第1主成分建立的模型验证集R²明显降低,SSE变大,而基于平均光谱值和掩模图形建立的模型R²变化不大,掩模图形建立的模型SSE明显变小,说明基于掩模图形建立的模型具有更高的稳定性。

近年来,关于食品微生物的检测识别方面有了重大的发展,多种快速、无损的方法应用得越来越成熟^[24]。其中,高光谱图像技术与化学计量学、光学等技术联用,越来越多地应用于食品微生物检测中。

铜绿假单胞菌生长过程中样品成分和光学性质发生改变,即铜绿假单胞菌反射光谱值随着菌落的生长、菌落的形成、培养基的颜色和成分变化以及代谢产物的产生而发生改变^[21]。本试验测定了400~1 000 nm波长范围内铜绿假单胞菌的光谱值,其中,400~750 nm是可见光范围,750~1 000 nm是短波近红外范围。在可见光范围内,光谱值的变化主要受培养基颜色变化影响,而在近红外范围,光谱值的变化与成分的改变有比较紧密的联系^{[22, 23]}。在铜绿假单胞菌的反射光谱曲线中,可见光范围内各个波段反射光谱值随培养时间的延长先变大后变小,在650 nm处反射光谱值达到最小,部分培养阶段的光谱值相互重叠,无法区分,这与铜绿假单胞菌48 h的培养过程中先产生绿脓素后产生红脓素有关,尤其是后期两种色素同时存在,导致可见光范围不同生长阶段的光谱值变化不大。而且650 nm与红光的吸收有关,假单胞菌在培养过程中产生绿色色素,使培养基大部分区域呈现绿色,并且不断加深,绿色和红色是互补色,所以这一波长处的反射光谱值达到最小,而后期又产生红色色素,使菌落边缘微带红色,导致菌落光谱值有所下降^[22]。840~1 200 nm波段范围是检测微生物最重要的波段,一般认为,其光谱变化与O—H、C—H、C—O和N—H等化学键有关^[20]。本研究中,在900~1 000 nm短波近红外波长范围内,随着培养时间延长,反射光谱值变大,这与利用高光谱对食品中微生物侵染的有关研究结果并不相符。一般而言,随着微生物在食品上的生长繁殖,反射光谱值变小^[25]。这种现象可能是由于平板上纯培养的微生物与食品上微生物的生长状况不同,随着铜绿假单胞菌的生长繁殖,平板上有大量湿润的菌落产生,同时产生代谢产物,使光的反射率增加,所以反射光谱值呈上升趋势。

本试验基于高光谱图像参数对2种不同处理组的铜绿假单胞菌进行生长模拟,可以很好地拟合铜绿假单胞菌在培养基上的生长。3种拟合方法中基于平均光谱值和基于掩模图形的方法具有更好的拟合效果和较高的准确性,而基于第1主成分得分拟合的生长模型相对效果较差。这与前两种方法采用的分别是部分短波近红外波段的平均光谱值和高光谱图像进行拟合,而后种方法采用全波段的平均光谱值进行拟合有关。提取最佳波长进行生长模拟不仅可以减少数据,更可以提高模型的准确率。目前,很多研究采用全波段建立模型,然后根据一些算法,选择最佳波长^[26]。本研究中,3种方法建立的模型训练集R²范围为0.970 1~0.993 2,与基于菌落计数法建立的模型相关系数范围为0.92~0.99。而且,通过PCA分析可以将2种处理组的铜绿假单胞菌5个培养阶段较好地区分开来,所以高光谱图像技术在铜绿假单胞菌的生长拟合上具有很好的应用前景,为下一步利用高光谱对冷鲜肉中铜绿假单胞菌的生长拟合建立良好的基础。