南京农业大学学报  2016, Vol. 39 Issue (3): 479-482   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601020
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刘勇, 吴晓庆, 王子玉, 宋浩洋, 张领, 乔凌燕, 李文雍, 谭景和. 2016.
LIU Yong, WU Xiaoqing, WANG Ziyu, SONG Haoyang, ZHANG Ling, QIAO Lingyan, LI Wenyong, TAN Jinghe. 2016.
獭兔体外成熟卵母细胞孤雌激活及体细胞核移植
Parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer with in vitro matured Rex rabbit oocytes
南京农业大学学报, 39(3): 479-482
Journal of Nanjing Agricultural University, 39(3): 479-482.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601020

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收稿日期：2016-01-25
引用本文
刘勇, 吴晓庆, 王子玉, 等. 2016. 獭兔体外成熟卵母细胞孤雌激活及体细胞核移植[J]. 南京农业大学学报, 39(3): 479-482.
LIU Yong, WU Xiaoqing, WANG Ziyu, SONG Haoyang, ZHANG Ling, QIAO Lingyan, LI Wenyong, TAN Jinghe. Parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer with in vitro matured Rex rabbit oocytes[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 39(3): 479-482.  DOI: 10.7685/jnau.201601020
獭兔体外成熟卵母细胞孤雌激活及体细胞核移植
刘勇1, 吴晓庆1, 王子玉2, 宋浩洋1, 张领1, 乔凌燕1, 李文雍1, 谭景和3     
1. 阜阳师范学院胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室, 安徽 阜阳 236041;
2. 南京农业大学动物科技学院, 江苏 南京 210095;
3. 山东农业大学动物科技学院, 山东 泰安 271018
收稿日期：2016-01-25
基金项目：国家自然科学基金项目(31201789);安徽省自然科学基金项目(1508085QC59);安徽省高校领军人才引进与培育计划项目(gwfxZD2016171);国家公益性行业(农业)科研专项(201303143-06)
作者简介：刘勇,副教授,主要从事胚胎工程研究,E-mail:drliuyong@gmail.com。
通信作者：谭景和,教授,E-mail:1246372916@qq.com。
摘要：[目的] 建立利用獭兔体外成熟卵母细胞进行孤雌激活及体细胞核移植的技术体系,促进獭兔现代育种技术的发展。[方法] 以獭兔屠宰场废弃卵巢为试验材料,利用体外成熟、孤雌激活、体细胞核移植等方法,研究了獭兔体外成熟卵母细胞支持胚胎发育的能力。[结果] 1)直径大于1 mm卵泡内的卵母细胞孤雌激活后的发育能力显著强于0.7~1.0 mm卵泡内的卵母细胞。2)卵母细胞体外培养(IVC)15~21 h后孤雌激活,卵裂率显著高于IVC 12 h组。3)2.5 μmol·L-1 Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-1 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)与5 μg·mL-1亚胺环己酮(CHX)联合处理1 h,孤雌激活效果最好。4)IVC 14 h后,78%的卵母细胞极体与核偏移角度小于10°;IVC 18 h后,34.6%的极体偏离核的角度大于45°。5)体外成熟的獭兔卵母细胞可以较好支持体细胞核移植的重构胚,核质作用期间采用MG132处理,降低了重构胚的囊胚率。[结论] 从大于1 mm卵泡内回收卵母细胞并IVC 18 h后,采用2.5 μmol·L-1 Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-1 6-DMAP与5 μg·mL-1 CHX联合处理1 h,是獭兔孤雌激活和体细胞核移植的最佳方案。
关键词： 孤雌激活     体细胞核移植     体外成熟     獭兔    
Parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer with in vitro matured Rex rabbit oocytes
LIU Yong1, WU Xiaoqing1, WANG Ziyu2, SONG Haoyang1, ZHANG Ling1, QIAO Lingyan1, LI Wenyong1, TAN Jinghe3     
1. Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation of Anhui Province, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, China;
2. College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
Abstract: [Objectives] The aim of this paper was to establish the methods of parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer used in Rex rabbit mature oocytes in vitro, and to promote the development of modern breeding techniques in Rex rabbit.[Methods] Wasting ovaries obtained from the rabbit slaughterhouse were used as experimental materials. We made use of several methods in this research, such as in vitro maturation, parthenogenetic activation, somatic cell nuclear transfer, etc. We studied the ability of embryonic development in detail.[Results] 1)The growth ability of parthenogenetic activation oocytes which were greater than 1 mm follicle group was stronger than the 0.7-1.0 mm follicle group. 2)The cleavage rate was significantly higher in the in vitro cultured(IVC)15-21 h group than in the IVC 12 h group. 3)The best parthenogenetic activation method was using 2.5 μmol·L-1 Ionomycin to treat it for 5 min, and then using 2 mmol·L-1 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP)and 5 μg·mL-1 cycloheximide(CHX)to incubate for 1 h. 4)The angle between polar body and nuclear was smaller than 10° in 78% oocytes which were IVC for 14 hours. But only 34.6% polar body moved more than 45° from nuclear when the oocytes were IVC for 18 hours. 5)Incubating the reconstructed embryo with MG132 during nucleus-cytoplasmic interaction reduced the blastocyst rate.[Conclusions] The best method of parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer was that obtaining the oocyte from greater than 1 mm follicle and applying IVC to it for 18 h, then using 2.5 μmol·L-1 Ionomycin to treat it for 5 min, and then using 2 mmol·L-1 6-DMAP and 5 μg·mL-1 CHX to incubate for 1 h.
Keywords: parthenogenetic activation     somatic cell nuclear transfer     in vitro maturation     Rex rabbit    

獭兔学名力克斯兔(Rex rabbit),是一种典型的皮用兔。其毛皮酷似珍贵的毛皮兽水獭,具有很高的经济价值。现代育种技术,如体外受精、转基因克隆动物[1]等需要大量优质成熟卵母细胞。如果采用超数排卵技术获得獭兔成熟卵母细胞,则成本较高,并且刺激性排卵,操作难度较大[2]。因此,从獭兔屠宰场回收废弃卵巢,利用卵母细胞体外成熟技术获得大量成熟卵母细胞是一种经济便利的方案。但体外成熟獭兔卵母细胞的质量究竟如何,目前还没有相关研究报道。

孤雌激活是一种检验成熟卵母细胞支持胚胎发育潜能的简便方法,也是体细胞核移植技术不可缺少的环节之一。最近在猪[3]、牛[4]、山羊[5]等物种中均有相关研究报道。兔孤雌激活[6]和体细胞核移植[7]的研究主要以新西兰白兔为试验材料,目前尚未见到采用獭兔进行孤雌激活和体细胞核移植进行研究的报道。本试验拟对体外成熟的獭兔卵母细胞采用化学试剂Ionomycin进行孤雌激活,并用于体细胞核移植,为獭兔良种繁育提供新的技术。

1 材料与方法 1.1 试验动物及试剂

獭兔卵巢取自山东泰安友谊兔场的屠宰场,1 h内保温运到实验室。除了特殊标明以外,本试验所用试剂均购自Sigma公司。

1.2 试验方法
1.2.1 卵母细胞获取

利用体视显微镜目镜上的测微尺,测量卵巢上的卵泡直径,并分为以下3组:0.7~1.0 mm组、1.0~1.5 mm组和大于1.5 mm组。每组分别刺破卵泡后回收胞质均匀、无黑斑的健康卵母细胞。操作液使用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)。

1.2.2 卵母细胞体外培养

体外成熟培养液使用TCM199(GIBCO,12350-039),添加10%胎牛血清(FBS,GIBCO,10099-141)+24.2 mg · L-1丙酮酸钠+1 μg · mL-1 17β-雌二醇+10 ng · mL-1表皮生长因子(EGF)+0.05 IU · mL-1促卵泡素(FSH)+0.05 IU · mL-1促黄体素(LH)。每20枚卵放入100 μL预平衡2 h的体外成熟培养液中,在38.5 ℃、5% CO2、相对湿度100%的培养箱中培养。

1.2.3 极体偏移角度计算

将体外成熟的卵母细胞用含0.6 μg · mL-1 Demecolcine的成熟培养液培养1 h诱导胞质突起,然后测量胞质突起与极体的夹角,记录极体偏移角度。测量角度后的卵母细胞,去核后用于体细胞核移植。

1.2.4 孤雌激活及胚胎体外培养

体外成熟的卵母细胞采用2.5 μmol · L-1的Ionomycin处理5 min,再用2 mmol · L-1 6-DMAP+5 μg · mL-1 CHX联合处理1 h后,放入TCM199+10% FBS的胚胎培养液中,在38.5 ℃、 5% CO2、相对湿度100%的培养箱内培养。胚胎体外培养(IVC)12 h后记录卵裂率。IVC 6 d后记录囊胚率和孵化率。

1.2.5 体细胞核移植

供核细胞采用自制胎儿皮肤成纤维细胞,使用前用血清饥饿3~5 d将细胞周期同步化在G0/G1期。用Demecolcine辅助去卵母细胞的细胞核后,将体细胞注入卵周隙,采用电压1.5 kV · cm-1、持续时间40 μs的参数融合。15 min后检查融合率,没有融合的细胞进行二次融合。融合后的胚胎采用TCM199添加10%血清培养,并于12 h以后记录卵裂率。体外培养6 d后,记录囊胚率和孵化率。囊胚率采用囊胚数除以卵裂率,孵化率采用孵化囊胚数除以囊胚数计算。

2 结果与分析 2.1 卵泡直径对卵泡内卵母细胞孤雌激活及胚胎发育能力的影响

结果如表 1所示:0.7~1.0 mm组卵泡内卵母细胞的卵裂率显著低于1.0~1.5 mm组和大于1.5 mm组(P<0.05),并且0.7~1.0 mm组的囊胚率也显著低于1.0~1.5 mm组和大于1.5 mm组(P<0.05)。大于1.5 mm组囊胚率虽然与1.0~1.5 mm组差异不显著,但数值上明显偏低。

表 1 不同直径卵泡来源的獭兔卵母细胞体外成熟后孤雌激活胚胎发育情况 Table 1 Parthenogenetic developments of in vitro matured Rex rabbit oocytes from different diameter of follicles
卵泡直径/mm Follicular diameter使用卵数Oocytes used卵裂率/% Cleavages囊胚率/% Blastocysts
0.7~1.04463.1±4.7a14.2±2.4a
1.0~1.56185.1±0.9b62.8±4.8b
>1.55379.1±1.0b50.1±3.7b
注: 同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Values within a column without a common letter in superscripts mean significant difference(P<0.05). The same as follows.
表选项
2.2 体外培养时间对卵母细胞孤雌激活及胚胎发育能力的影响

我们研究发现,大于1 mm(包含1.0~1.5 mm组和大于1.5 mm组)卵泡内的卵母细胞已经具备完全的胚胎发育能力。所以我们以这部分卵母细胞为试验材料,进一步研究了IVC时间对卵母细胞孤雌后,胚胎发育能力的影响。结果如表 2所示:刚刚体外成熟的卵母细胞(IVC 12 h)很难被激活,卵裂率仅有15.5%,但激活后的胚胎发育能力较强,囊胚率可达61.1%。如果卵母细胞成熟后继续体外培养一段时间(IVC 15~21 h)再进行孤雌激活,卵裂率大幅提高,可达80%~90%,但囊胚率显著降低,仅有30%~40%。

表 2 獭兔卵母细胞经体外培养不同时间后孤雌激活胚胎发育情况 Table 2 Parthenogenetic developments of Rex rabbit oocytes in vitro cultured(IVC)for different time
体外培养时间/h
In vitro cultured time		使用卵数
Oocytes used		卵裂率/%
Cleavages		囊胚率/%
Blastocysts
125215.5±2.3a61.1±5.6a
1513781.9±3.4b41.4±4.0b
1813184.2±3.4b37.7±2.8b
215991.5±1.8b33.2±2.2b
表选项
2.3 体外成熟过程中极体偏移情况

采用盲吸法去核时,必须了解第一极体与纺锤体的相对角度。本试验研究了大于1 mm卵泡内未成熟卵母细胞成熟后极体偏移的角度,结果如表 3所示:IVC 14 h后,78.1%的卵母细胞偏移角度小于10°,可以采用盲吸的方法去核。但IVC 18 h后,34.6%的极体偏离核的角度大于45°,这种情况下无法盲吸去核,必须使用辅助手段。

表 3 体外培养不同时间极体与纺锤体偏移情况 Table 3 Skewing angle of polar body and the spindle in oocytes IVC for different time
体外培养时间/h
In vitro cultured
time		培养卵数
Oocytes
cultured		成熟比例/%
Matured
ratio		使用成熟卵数
Oocytes
used		极体与纺锤体偏移不同角度卵母细胞比例/%
Proportion of oocytes with different angle between the spindle and polar bady
<10°30°45~90°>90°
1413692.712378.1a1.6a16.3a4.1a
1814097.17864.1b1.3a29.5b5.1a
表选项
2.4 体外成熟卵母细胞支持体细胞核移植胚胎发育的研究

如表 4所示:从大于1 mm卵泡内回收的卵母细胞,经18 h体外培养后,可以较好地支持重构胚胎发育,囊胚率可达26.6%,并且具有66.7%的囊胚孵化率。但是,重构胚胎核质互作期间,如果在激活培养液中添加5 μmol · L-1 MG132,不仅没有促进囊胚率的形成,反而降低了囊胚率(26.6% vs 9.2%),并且不再有孵化囊胚出现。但MG132对重构胚胎卵裂的影响有限,虽然数值上稍有降低,但差异并不显著。

表 4 核质互作期间添加MG132对重构胚发育的影响 Table 4 The influence of MG132 on development of reconstruction embryo during nucleus-cytoplasmic interaction
处理
Treatment		重构胚胎数
Reconstructed embryos		卵裂率/%
Cleavages		囊胚率/%
Blastocysts		囊胚孵化率/%
Hatched blastocysts
不添加MG132 Without MG1325179.2±3.3a26.6±1.0a66.7±16.7a
添加MG132 Added MG1325270.1±5.0a9.2±2.5b0.0±0.0b
表选项
3 讨论

卵泡直径是反映内在卵母细胞恢复减数分裂能力、成熟能力和后期支持胚胎发育能力的重要指标之一。我们研究发现,獭兔0.7~1.0 mm卵泡内的卵母细胞卵裂率为63.1%,囊胚率为14.2%;而1.0~1.5 mm组卵裂率提高到85.1%,囊胚率可达62.8%。说明随着卵泡直径的增加,卵母细胞支持胚胎发育的能力在增强,这与在其他动物中观察到的情况相类似。在对牛的研究中,大于2 mm卵泡内卵母细胞的发育潜能较差,3~8 mm卵泡中的卵母细胞发育能力较强[8]。大卵泡中收集卵母细胞的囊胚率要显著高于小卵泡[9]。在山羊的相关研究中,直径2~3 mm卵泡内卵母细胞约有一半能够正常受精,但受精胚胎大多不能发育超过8~16细胞期。而直径大于3 mm卵泡内的卵母细胞具有较强的胚胎发育潜能[10]。上述这些研究表明:从较大卵泡内获得的卵母细胞,其各方面能力都要显著强于小卵泡[11],原因可能是由于在卵泡生长过程中,卵母细胞逐渐积累了大量的mRNA和蛋白质,这些关键物质具有支持胚胎发育的功能。但是,大于1.5 mm组卵母细胞的卵裂率和囊胚率虽然与1.0~1.5 mm组差异不显著,但数值上偏低,并没有像其他物种中研究的那样,卵泡直径越大,卵母细胞发育能力越强,这可能与兔比较特殊的生理特点有关。兔是交配刺激排卵的物种,发情期如果没有交配刺激,大卵泡将发生闭锁。兔发情期占整个发情周期的25%左右,因此随机取得的卵巢应有25%处于发情期,这部分发情期的大卵泡会有很大比例的闭锁卵泡。这可能是大于1.5 mm组发育潜能不如1.0~1.5 mm组的主要原因。

传统的体细胞核移植,都是采用盲吸去核法或荧光辅助去核法。但荧光辅助去核法毒性较大,我们首先研究了盲吸去核法能否用于体外成熟的獭兔卵母细胞。本研究首次利用Demecolcine诱导胞质突起后测量极体偏移角度,以判断极体能否作为盲吸去核的标志。结果发现IVC 18 h后,34.6%的獭兔卵母细胞极体偏离纺锤体角度大于45°,无法采用盲吸去核法去核。已有研究表明:卵母细胞成熟后排出第一极体,此时卵周隙增大,并且随着成熟卵母细胞老化,第一极体逐渐退化碎裂,导致第一极体远离刚刚排出的位置[12],无法再作为纺锤体所在位置的标志,进而影响盲吸去核效率。我们采用的发育率较高的体外成熟(IVM)18 h组卵母细胞已经在体外老化了6~8 h,这可能是极体偏移角度较大的主要原因。

在对小鼠[13]、牛[14]、猪[15]等动物的研究中发现,MG132可以促进重构胚胎的染色质超前凝集(premature chromosome condensation,PCC),进而提高重构胚的发育能力。尤其是在融合后的核质互作期间采用MG132处理[16]。我们也期望通过使用MG132促进PCC,提高克隆效率。但是,我们在重构胚胎核质互作期间采用MG132处理,却发现重构胚胎发育能力反而显著下降。Le Bourhis等[17]研究表明,虽然使用MG132处理能够有效提高PCC比例,但是重构胚的囊胚率却没有任何提高[17]。也有研究表明,PCC对于牛体细胞核移植胚胎的核重编程也并非必不可少[18]。因此,我们认为,PCC对于獭兔体细胞核移植胚胎的发育也不是必需的。

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