茶树因其含有茶多酚、儿茶素、咖啡碱等物质,而具有抗氧化、防癌等有益于人体健康的功能^[1]。然而,茶叶是一种超富集氟(F)的植物,过量饮茶会引起人体的氟斑牙和氟骨病的发生^{[2, 3]}。因此,减少茶树中F的富集对保障人体健康具有重要意义。近年来,有报道称外源添加竹炭与木炭,可以显著降低F在茶树体内的积累^[4]。 研究表明氯离子(Cl^-)通道对阴离子通道抑制剂DIDS(4,4-diisothiocyanatostilbene-2,2-disulfonic acid)非常敏感^[5],而F^-和Cl^-同属单价阴离子且具有相同的理化性质和离子半径,我们之前的研究也发现DIDS显著降低茶树对氟的吸收富集^[6],揭示了阴离子通道可能是茶树吸收F^-的重要途径之一。

阴离子通道是以一种允许阴离子跨膜运输的蛋白通道,在植物生长发育过程中扮演着重要角色,例如信号传导,维持膜电位的稳定及促进大量及微量元素吸收等^[7]。它主要分布在植物细胞膜上,如玉米根部的质膜^[8],野豌豆的叶绿体膜^[9],甜菜与拟南芥的叶肉细胞的液泡膜上^[10]。而Ca²⁺信号能够调控高等植物细胞膜上的离子通道的活性^[11],并在植物生长发育过程中起重要作用,例如花粉管的生长^[12]和不定根的生长^[13]。Kudla 等^[14] 报道脱落酸(ABA)和冷胁迫通过Ca²⁺信号的调控,激活拟南芥根部保卫细胞的阴离子通道。Mg²⁺提高了细胞质中Ca²⁺浓度而激活蚕豆保卫细胞液泡上的离子通道^[15],此外,非选择阳离子通道活性也受到胞内Ca²⁺浓度的提高而被抑制^[16]。然而Ca²⁺信号是否参与茶树根部阴离子通道调控吸收F的过程,目前仍不清楚。本研究拟采用激光共聚焦和非损伤微测技术阐述Ca²⁺信号在DIDS抑制茶树吸收F过程中的角色,为阐明茶树吸收F的途径和调控机制提供理论基础。

‘福鼎’大白茶(Camellia sinesis L.‘Fuding’)茶籽取自安徽农业大学农业示范园内。精选颗粒饱满的茶籽在自来水中浸泡2 d后,选取健康茶籽定植于洗净的石英砂中(直径约0.3 cm),待种子发芽后,转移至人工气候室内培养。每天光照时间12 h,室温(22±1) ℃,光照强度约30 μmol · m^-2 · s^-1,空气湿度45%~50%。选长势一致(株高约20 cm,4~5叶)的茶树,用去离子水将根部清洗干净,转移到盛有1/4浓度营养液的塑料盆(50 cm×30 cm)中培养,改进的茶树水培标准营养液配方为:硝酸铵114 mg · L^-1,磷酸二氢钾13.6 mg · L^-1,氯化钾38.69 mg · L^-1,营养液的pH值调节至5.0~5.5之间,定时供气。待茶树根部长出大量白色不定根后,再继续水培1周进行试验处理。

选取长势基本一致的茶树(4~5叶),洗净根表营养液和附着物,用滤纸吸干根表水分后定植于250 mL营养液中,每瓶3~4株。每组处理如下:1)茶树置于蒸馏水处理1 d;2)茶树置于50 μmol · L^-1 DIDS 和 10.5 mmol · L^-1 NaF 处理1 d;3)茶树分别置于50 μmol · L^-1 DIDS中0(DIDS与F同时置于溶液中)、6、12、24和48 h,然后再置于10.5 mmol · L^-1 F 溶液中1 d。

以上每个处理设置4次重复。瓶口用脱脂棉封口,瓶体用黑色胶带裹住,以利于根系生长。茶树置于光照培养箱内,每天光照时间12 h,室温(22±1) ℃,光照强度约30 μmol · m^-2 · s^-1,空气湿度45%~50%。

培养结束后,用自来水和蒸馏水冲洗茶树各部位,然后置于80 ℃烘箱中烘干至恒质量。将根、茎、叶分离,充分研磨粉碎,分别称取茶树根部、茎部和叶片样品置于50 mL离心管中,加30 mL超纯水,在100 ℃沸水浴中静置提取30 min。冷却后准确取15 mL提取液置于50 mL聚四氟乙烯烧杯中,加入15 mL pH5.0的离子调节缓冲液。离子调节缓冲液由NaCl 58 g、C₆H₉Na₃O₉ · H₂O(二水合柠檬酸钠)68 g 和CH₃COOH 57 mL溶于700 mL ddH₂O,用5 mol · L^-1 NaOH调节pH值,用纯水定容至1 000 mL配制而成。待提取液与离子调节缓冲液混合后,充分搅拌,采用奥立龙台式F离子测量仪(配置9609BNWPF离子选择电极)测定提取液中F离子浓度^[17]。

Ca²⁺荧光染料Fluo-3/AM(美国分子探针公司)50 μg溶于无水新鲜的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),配制染料浓度为1 mmol · L^-1,置于-20 ℃避光保存。取30 d苗龄的茶苗根尖,徒手切片取根尖成熟区1~3 cm置于含0.2 mmol · L^-1 CaC1₂和50 mmol · L^-1山梨醇的溶液中,加入1 mmol · L^-1 Fluo-3/AM 至终浓度为40 μmol · L^-1,DMSO的终浓度为1%(体积分数)。混匀后在4 ℃避光条件下孵育2 h;取出后用0.2 mmol · L^-1 CaC1₂溶液冲洗2次,于室温(20~25 ℃)下避光再放置2 h,制片,于激光共聚焦扫描显微镜下观察。

取装载好 Fluo-3/AM 的根尖成熟区装于激光共聚焦培养皿(直径2 cm,中间底部附有直径1 cm盖玻片,此区域为激光共聚焦扫描区域),将其放在激光共聚焦扫描显微镜(NIKON TE 2000)的载物台上,以氩激光为激发光源,激发光波长为488 nm,发射波长为 515 nm,调节微调到合适层面区域进行观察,2 min后加入50 μmol · L^-1 DIDS。每60 s记录1次荧光强度。此外,另取茶苗根尖分别进行以下处理:1)茶苗根尖分别用去离子水、50 μmol · L^-1 DIDS和 1 mmol · L^-1 EGTA处理 0.5 h;2)茶苗根尖先于1 mmol · L^-1 EGTA中处理0.25 h,再置于50 μmol · L^-1 DIDS 处理 0.5 h。

通过计算机控制扫描和数据采集系统(Time course),XY-T(three dimensional)三维扫描(取10层细胞),采集图像三维合成荧光图(640×640像素)。荧光值根据所选区域值的平均值计算得到^{[18, 19]}。

茶树根部成熟区Ca²⁺动态跨膜测定在美国扬格(北京旭月科技公司)非损伤技术中心利用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)完成。Ca²⁺选择电极在试验前制备以确保其精确性和离子选择准确性。电极制备方法如下:硅烷化玻璃微电极(直径(5±1)μm,XY-DJ-01,Younger,USA)首先装填100 mmol · L^-1 CaCl₂,再于前端灌充Ca²⁺ 液体离子交换剂(Ca²⁺ LIX,Y-SJ-Ca,Younger,USA)作为Ca²⁺选择电极。Ag/AgCl电极夹(XY-DJGD,Younger,USA)被插入电极后端作为对照电极。Ca²⁺微电极被垂直定位于茶树根表 400 μm 3~5 min以记录空白信号。待信号稳定后,将电极定位于茶树根尖成熟区细胞膜 2 μm上方记录流速。选择性微电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量(dx在 5~35 μm之间,在本试验中选择30 μm)获得两点的电压V1和V2,两点间的浓度差dc,通过V1和V2及已知的该电极的电压/浓度校正曲线计算获得,将它们代入Fick′s 第一扩散定律J₀=-D · dc/dx获得该离子的净流速和运动方向。D是离子扩散常数,在25 ℃条件下Ca²⁺的D是 0.79×10^-5 cm² · s^-1。在测定过程中首先将茶树根尖置于含0.02 mmol · L^-1 CaCl₂、50 mmol · L^-1 Sorbitol、0.3 mmol · L^-1 MES,pH6.0的缓冲溶液体系中,2 min后立刻加入50 μmol · L^-1 DIDS,每组6个平行^[20]。

茶树根部、茎部和叶片样品中F含量为4次重复的平均数;Ca²⁺跨膜为6次重复的平均数;细胞质中Ca²⁺浓度为所选区域的荧光平均值。试验数据用Origin pro 8.5和SPSS 2003进行统计分析,采用SPSS 2003统计软件中单因素方差分析(ANOVA),组间差异用Tukey′s法进行比较。

将茶树置于F浓度为10.5 mmol · L^-1的水培营养液中1 d,茶树植株体内F的富集量达1 090.19 mg · kg^-1(图 1-A)。当外源同时添加阴离子通道抑制剂DIDS和F(0 h)后,茶树植株和根部F的吸收富集量分别比单独加F对照减少了11.98%和30.35%(图 1-A和B)。为进一步研究DIDS对茶树吸收F的抑制作用,分别设置了不同DIDS前处理时间,结果表明随着DIDS前处理时间的延长,F在茶树植株和根部的富集量逐渐减少(图 1)。当DIDS前处理时间为6 h,茶树植株和根部F的富集量分别为627.66和452.62 mg · kg^-1,与只加F处理相比分别降低了42.43% 和30.26%,均达到极显著差异(P<0.01)。然而,当DIDS前处理时间延长为12、24和48 h时,F富集量与前处理6 h相比无显著差异。因此阴离子通道抑制剂DIDS前处理6 h后,可显著抑制茶树对F的吸收富集。

	图 1 DIDS在不同时间处理下对茶树植株(A)和根部(B)吸收富集F的影响 Fig. 1 Effect of different treatment time on F accumulation in tea plants(A)and roots(B)under the DIDS stress * 和* *代表与F处理在5%和1%水平差异显著。* and * * indicate significant difference compared with F treatments at 0.05 and 0.01 levels.
图选项

在装载完好的根尖成熟区加入50 μmol · L^-1 DIDS,于激光共聚焦显微镜下观察12 min,荧光染料Fluo-3 与茶树根部细胞质中Ca²⁺结合产生的荧光强度在不同区域(A和B)产生了相反的变化趋势(图 2)。

图 2 DIDS处理12 min内的茶树根尖成熟区细胞内3D钙离子荧光伪彩图 Fig. 2 The distribution of cytosolic calcium in the mature zone of tea root cells after DIDS treatment in 12 min 1)1~6分别表示茶树根尖细胞经DIDS处理后在2、4、6、8、10和12 min的3D钙离子荧光伪彩图;2)红色框表示区域A,紫色框表示区域B,黄色箭头表示Ca2+传导方向。 1)1 to 6 mean 3D pseudocolor images of tea roots cells at 2,4,6,8,10 and 12 min after DIDS treatment;2)Red box represents region A,purple box represents region B,yellow arrows represent Ca2+ direction of transmission.

图选项

在区域A中,未加入阴离子通道抑制剂DIDS时,茶树根尖成熟区细胞质Ca²⁺的相对荧光强度为858.42 AU。加入50 μmol · L^-1 DIDS后,茶树根尖成熟区细胞质中的Ca²⁺的相对荧光强度逐渐减弱,荧光变化主要分为2个阶段:在 0~9 min,茶树根尖成熟区细胞质Ca²⁺荧光强度迅速降低,从858.42 AU递减至565.42 AU,下降了34.13%;9 min后,荧光强度相对稳定,其荧光值保持在499.28~570.42 AU之间。而在区域B中,根尖成熟区细胞质中的 Ca²⁺的相对荧光强度变化则呈现出相反趋势。当加入50 μmol · L^-1 DIDS刺激茶树根尖时,根尖成熟区细胞质中的Ca²⁺的相对荧光强度逐渐增强。在0~8 min,从672.5 AU递增至871.5 AU,增加了22.83%;8 min后,其荧光值保持相对稳定,在871.5~866.0 AU之间(图 3)。

	图 3 DIDS对茶树根尖成熟区区域A和B的细胞质Ca2+动力学的影响 Fig. 3 The kinetics of cytosol Ca2+ in the mature zone cells of tea roots during DIDS treatment in the regions of A and B
图选项

利用激光共聚焦技术观察茶树根尖成熟区Ca²⁺的荧光强度,并对不同时间点连续拍照,结果表明DIDS调控了茶树根尖成熟区细胞质中Ca²⁺的含量。由于细胞质Ca²⁺相对荧光值仅能表征细胞质中静态Ca²⁺的含量,不能表征Ca²⁺在细胞间的动态传递过程。而非损伤微测技术可以实现对样品离子信息的内外兼测,获得茶树根部Ca²⁺动态跨膜运输的信息。因此采用非损伤技术监测Ca²⁺的动态跨膜运输。

在静息状态下,茶树根尖成熟区Ca²⁺跨膜运输相对稳定,Ca²⁺内流速率为0.2~31.06 pmol · cm^-2 · s^-1。在DIDS刺激下,Ca²⁺跨膜运输由内流转换成外排,在160~233.5 s之间,外排速率急剧增加,均值达350.35 pmol · cm^-2 · s^-1,比静息状态下外排速率提高了近40倍。随着DIDS处理时间的延长,在238.5~632.5 s之 间,Ca²⁺外排速率逐渐减少,从230.78 pmol · cm^-2 · s^-1降至1.06 pmol · cm^-2 · s^-1,均值仅为 97.64 pmol · cm^-2 · s^-1,与峰值相比降低了72.13%。研究结果表明:DIDS刺激茶树根尖,Ca²⁺跨膜外排趋势与细胞质中Ca²⁺荧光强度变化趋势一致(图 4)。

	图 4 DIDS对茶树根尖成熟区细胞的Ca2+流的影响 Fig. 4 Effect of DIDS on Ca2+ flux on the mature zone of tea roots
图选项

上述结果表明,DIDS调控了茶树根尖成熟区Ca²⁺信号的变化。为进一步明确Ca²⁺信号与DIDS抑制茶树吸收F的关系,选择Ca²⁺螯合剂EGTA进一步验证。结果表明:EGTA的前处理分别削弱了DIDS对茶树侧根Ca²⁺信号的刺激和对茶树吸收F的抑制能力(图 5)。

图 5 Ca2+螯合剂EGTA前处理后DIDS对茶树侧根的Ca2+ 信号和F吸收的影响 Fig. 5 Effect of Ca2+ chelator EGTA pre-treatment on Ca2+ fluorescence intensity in tea lateral roots and F accumulation in tea plants under DIDS treatment A:Control、DIDS 和 EGTA 表示用去离子水、50 μmol · L-1 DIDS和 1 mmol · L-1 EGTA 分别处理茶籽苗根部0.5 h;EGTA+DIDS 表示茶籽苗先于1 mmol · L-1 EGTA中处理0.25 h,再置于50 μmol · L-1 DIDS 处理 0.5 h;*代表与对照相比在0.05水平差异显著。 B:F表示茶树于10.5 mmol · L-1 F处理1 d;EGTA+F 和DIDS+F 表示茶树先于50 μmol · L-1 DIDS和1 mmol · L-1 EGTA 处理6 h,再置于10.5 mmol · L-1 F处理1 d;EGTA+DIDS+F 表示EGTA先置于1 mmol · L-1 EGTA处理 6 h,再于DIDS+F 处理 1 d;*代表与F处理相比在0.05水平差异显著。 A:Control,DIDS and EGTA indicate that tea roots were treated with distill water,50 μmol · L-1 DIDS and 1 mmol · L-1 EGTA for 0.5 h respectively;EGTA+DIDS indicates that the tea roots were placed in 1 mmol · L-1 EGTA for 0.25 h,then subjected to a direct 50 μmol · L-1 DIDS for 0.5 h;* indicates the significant difference compared with control at 0.05 level. B:F indicates that tea roots were treated with 10.5 mmol · L-1 F for 1 d;EGTA+F and DIDS+F indicate that tea roots were applied to 1 mmol · L-1 EGTA and 50 μmol · L-1 DIDS for 6 h and then followed with 10.5 mmol · L-1 F for 1 d;EGTA+DIDS+F indicates that 6 h pretreament with 1 mmol · L-1 EGTA was applied to the tea roots under DIDS+F treatment for 1 d. * indicates the significant difference compared with F treatment at 0.05 level.

图选项

不同类型的阴离子通道抑制剂可削弱高等植物根系阴离子通道的活性^[7]。前人研究发现DIDS、NA(尼氟灭酸)、A-9-C(蒽-9-甲酸)和 CCCP(羰酰氰间氯苯腙)可显著抑制茶树根部阴离子通道活性,减少F的吸收^{[6, 21]}。然而关于其内部的Ca²⁺信号研究鲜有报道。本研究初步探究了茶树根部Ca²⁺信号与F吸收的可能性关系。

植物对外界环境刺激作出的反应主要是通过胞质中自由Ca²⁺浓度变化来调控^[22]。如:NaCl刺激水稻根尖细胞和胡杨的悬浮细胞,诱使Ca²⁺外排^{[23, 24]}。类似的研究也发现CdCl₂刺激拟南芥根尖细胞,增强了Ca²⁺外排且调控了Ca²⁺荧光强度^[25]。此外,白扦花粉管应激于四氟丙醇,管内Ca²⁺内流增强了Ca²⁺荧光强度^[12]。

植物体内Ca²⁺信号的传递可调控离子通道活性而影响对离子的选择吸收。Roberts^[7]报道,DIDS刺激大麦根部木质部薄壁组织Ca²⁺信号,抑制了阴离子通道对NO₃^-、Cl^-和 Mal^2-(苹果酸)的选择吸收。Laanemets 等^[26]研究发现Ca²⁺信号的增强显著抑制了拟南芥保卫细胞K⁺通道活性而减少了K⁺的吸收。

在本研究中,阴离子通道抑制剂DIDS促进了茶树根部成熟区Ca²⁺外排且诱导了Ca²⁺信号的传递。此外Ca²⁺螯合剂EGTA前处理削弱了DIDS对茶树侧根Ca²⁺信号的增强,同时也减少了对F抑制吸收的能力。上述结果表明Ca²⁺信号可能参与了DIDS关闭阴离子通道减少F吸收的过程,这与前人研究结果一致。

本研究中采用激光共聚焦、非损伤微测技术和F^-选择电极证明了茶树根部Ca²⁺信号参与了DIDS抑制茶树吸收F的过程,但是Ca²⁺信号如何参与调控茶树根部阴离子通道的启闭目前鲜有报道。

很多研究发现Ca²⁺信号可调控膜电位的极化。Buchanan等^[27]研究表明Ca²⁺信号响应电位极化并增强糊粉层液泡膜上通道活性。Allen 等^[28]发现蚕豆保卫细胞上的快速或慢速液泡膜上通道也有类似报道,Ca²⁺信号的传递极化了膜电位而调控了通道活性。多数阴离子通道具有电压依懒性,通过改变膜电位的驱动势而调控离子通道的启闭^[29]。NA通过去极化玉米根部细胞膜电位而抑制阴离子通道的活性,进而调控NO₃^-和Cl^-外排^[8],除阴离子通道外,膜电势的极化也可调控阳离子通道的启闭,如Ca²⁺通道^[30]和K⁺通道^[31]。此外,还有研究报道,Ca²⁺信号通过激活下游受体蛋白CaM作用于K⁺通道蛋白结构,调控K⁺通道启闭和K⁺吸收^[32]。

本研究发现Ca²⁺信号参与了DIDS抑制茶树吸收F的过程。因此我们推测DIDS可能通过刺激茶树根部成熟区的Ca²⁺信号极化膜电位,进而调控离子通道的开闭;或者Ca²⁺信号与Ca²⁺受体蛋白应激于DIDS,并作用于通道启闭而影响对F的选择吸收。因此,后期我们将立足于Ca²⁺信号下游受体蛋白与膜电位的研究,为深入揭示DIDS抑制茶树吸收F的研究提供理论基础。