禾本科植物内生真菌研究19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201511036

文章信息

王志伟, 张晨炜, 詹漓晖, 亢燕, 纪燕玲. 2016.

WANG Zhiwei, ZHANG Chenwei, ZHAN Lihui, KANG Yan, JI Yanling. 2016.

Grass endophyte researches 19: phylogenetic properties of endophytic fungi obtained from Elymus cylindricus

南京农业大学学报, 39(3): 408-416

Journal of Nanjing Agricultural University, 39(3): 408-416.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201511036

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收稿日期：2015-11-20

引用本文

王志伟, 张晨炜, 詹漓晖, 等. 2016. 禾本科植物内生真菌研究19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究[J]. 南京农业大学学报, 39(3): 408-416. 复制到剪切板

WANG Zhiwei, ZHANG Chenwei, ZHAN Lihui, et al. Grass endophyte researches 19: phylogenetic properties of endophytic fungi obtained from Elymus cylindricus[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 39(3): 408-416. DOI: 10.7685/jnau.201511036 复制到剪切板

禾本科植物内生真菌研究19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究

王志伟^1,2, 张晨炜¹, 詹漓晖¹, 亢燕¹, 纪燕玲¹

1. 南京农业大学生命科学学院, 江苏南京 210095;
2. 海南丰源无公害农业技术研究所, 海南海口 570207

收稿日期：2015-11-20

基金项目：国家自然科学基金项目(30670008,31372365)

作者简介：王志伟,教授。

通迅作者：纪燕玲,讲师,研究方向为植物微生物学,E-mail:yanlingji@njau.edu.cn。

摘要：[目的]本文旨在确定圆柱披碱草(Elymus cylindricus)内生真菌的分类地位。[方法]选择5株分离自新疆、青海的圆柱披碱草内生真菌菌株,采用SDS法提取基因组DNA,利用选择性引物对其tubB和tefA基因片段进行扩增和克隆测序,下载NCBI中的相似序列并进行比对分析,用MEGA 6.0软件构建系统发育树。[结果] 成功获得差异极小的各菌株序列,且tubB序列确认为仅1个拷贝,而2个菌株的tefA序列则有2个拷贝。在最大简约树上披碱草菌株的tefA和tubB第1拷贝均在EBY(Epichloë bromicola/E. yangzii)大支上,与E. sinica比较接近;tefA的第2拷贝与ETC(E. typhina complex)中的成员聚类。[结论] Epichloë sp.-Elymus cylindricus是一个新的共生体组合。圆柱披碱草分离菌株为杂交起源的Epichloë属真菌,可能起源于E. bromicola(syn.E. yangzii)和E. sylvatica间的杂交。

关键词：圆柱披碱草 Epichloë 属真菌 tubB tefA 系统发育分析

Grass endophyte researches 19: phylogenetic properties of endophytic fungi obtained from Elymus cylindricus

WANG Zhiwei^1,2, ZHANG Chenwei¹, ZHAN Lihui¹, KANG Yan¹, JI Yanling¹

1. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Fengyuan Institute of Frontier Technologies for Agriculture(FIFTA), Haikou 570207, China

Abstract: [Objectives] To identify the endophyic strains obtained from Elymus cylindricus, phylogenetic analysis were conducted.[Methods] Five fungal strains were incubated. Then their genomic DNA samples were extracted by SDS extraction method. Fragments of β-tubulin(tubB)and translation elongation factor 1-α(tefA)genes were amplified by specific PCR primers for isolated strains. Related sequences of tubB and tefA were downloaded from NCBI, then were aligned and analyzed by DNAssist and BioEdit. The phylogenetic characteristics of these strains were analyzed through the Maximum Parsimony tree performed by MEGA 6.0.[Results] All the sequence were nearly similar. Five strains were confirmed to possess single alleles of tubB, while 2 of them had 2 alleles of tefA. In the tree based on tubB fragment, they clustered together with Epichloë sinica within EBY(Epichloë bromicola/E. yangzii)clade. In the tree based on tefA fragment, allele-1 were grouped with E. sinica, while allele-2 within the ETC(E. typhina complex)clade.[Conclusions] They might be a new association of hybrid Epichloë sp.-Elymus cylindricus symbiosis.Strains obtained from Elymus cylindricus could origin from hybridization of E. bromicola (syn. E. yangzii)and E. sylvatica.

Keywords: Elymus cylindricus Epichloë tubB tefA phylogenetic analysis

禾本科植物内生真菌,因其独特的生态类型和丰富的代谢产物,受到越来越多的关注。其中最受关注的冷季型禾草epichloae真菌包括Epichloë属及其无性型Neotyphodium属^[1]。Glenn等^[2]利用18S rDNA的序列信息将其从Acremonium属中独立出来,建立了Neotyphodium Glenn,Bacon et Hanlin属。目前,Neotyphodium属已被合并入Epichloë属。然而,与其他真菌相比,Epichloë属真菌的种间形态学特征一般差别不大^[1]。

目前,Epichloë属真菌的种的鉴定主要根据经典分类学特征和系统发育学特征^[3]进行,用于系统发育学研究的主要基因片段有tubB、tefA和actG等^{[4, 5]}。随着研究的深入,同工酶图谱、微卫星序列等,结合tubB、tefA等基因片段的系统发育学信息相继被应用于该属真菌的分类学当中,新种不断被发现。由于多数原Neotyphodium属成员中具有2~3个拷贝的tubB、tefA等基因片段,它们被认为是不同有性Epichloë属成员的杂交后代^[6]。至今,已有报道的原Neotyphodium属真菌共有24个种和4个变种^{[1, 7]}。

披碱草(Elymus spp.)是分布于北半球寒温带地区的优良牧草^[8]。我国披碱草主要分布于东北、内蒙古、四川北部一线以北的西北和东北地区,从20世纪70年代开始披碱草被推广栽培。由于其对环境要求不严,且适应性强,具有抗旱、抗盐、抗寒及产草量高等特点,因此能在种植后第2年迅速建植。披碱草已成为北方退化草原重要的补播草种,能够增加草地的覆盖率,是目前我国西北和华北牧区重要的牧草之一,目前栽培面积呈扩大趋势。

对披碱草属植物内生真菌的研究工作起始于美洲地区,White^{[9, 10]}报道披碱草中含有内生真菌。加拿大披碱草(El.canadensis)、El.hystrix、El.villosus、El.virginicus等披碱草均被报道含有Epichloë elymi^[11]。Charlton等^[12]从El.canadensis分离到具有杂交起源的E.canadensis。我国研究人员已经完成披碱草属植物内生真菌的资源调查和分离工作^{[13, 14]},并对其分离菌株的act、tubB、tefA基因进行了研究^{[15, 16]}。但目前还没有对圆柱披碱草中内生真菌系统发育学特征及其杂交起源的详细探讨。本文利用tefA和tubB基因的片段,对来自我国西北地区圆柱披碱草内生真菌的代表菌株进行系统发育学特征分析,确定其基因拷贝数,并探讨其起源。

1 材料与方法 1.1 供试菌株的培养和基因组DNA的提取

选取5个圆柱披碱草样品分离菌株:Exn8101和Exn8102来自于青海省西宁市开发区;Exn8201来自于青海省西宁市植物园;Exj8101和Exj8102来自于新疆阜康市天池风景区。从保存菌种的斜面挑取菌丝转接到PDA平板上,室温培养10~15 d,直到菌落直径达3~4 cm时收集菌丝,转接到GY液体培养基上,25 ℃、150 r · min^-1培养20~25 d。

采用SDS法提取内生真菌的基因组DNA^[17],提取到的基因组DNA于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 PCR扩增

PCR扩增片段为tubB基因的1~3内含子(上游tubB-4u,下游tubB-1d)和tefA基因的1~4内含子。PCR扩增反应所用试剂购自宝生物(大连)工程有限公司。反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 75 s,共35个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物立即电泳检测或者4 ℃保存备用。PCR扩增所用引物见表 1。

表 1 PCR扩增tubB和tefA基因片段的引物及选择性扩增引物 Table 1 PCR primers and selcetive amplification primers used for tubB and tefA amplification

引物 Primer	引物方向 Primer direction	序列 Sequence(5′→3′)	来源 Origin	用途 Application
tubB-4u	上游 Up	TGGTCAACCAGCTCAGCACC	文献[18] Reference[18]	A
tubB-1d	下游 Down	GAGAAAATGCGTGAGATTGT	文献[18] Reference[18]	A
tefA-6u	上游 Up	CGGCAGCGATAATCAGGATAG	文献[18] Reference [18]	A
tefA-1d	下游 Down	GGGTAAGGACGAAAAGACTCA	文献[18] Reference [18]	A
KF-6U	上游 Up	GTTCGAGAAGGTGAGATATATC	文献[19] Reference [19]	SA
KF-4D	下游 Down	TCGAGAAGGTGAGATATATCTC	文献[19] Reference [19]	SA
注:A为简并引物Degenerate primer;SA为选择性扩增引物Selcetive amplification primer

表选项

1.3 相关序列的克隆与测序

PCR产物经电泳检测,切胶回收到清晰和单一的目的片段。通过目的DNA片段和pMD19-T载体的连接,将载体质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞,送交华大基因公司测序。

1.4 序列的分析

用于系统发育分析的其他菌株序列及相关资料均来自NCBI。首先把其中供试菌株测序的结果在GenBank中进行BLAST,得到数据库中epichloae真菌的tubB和tefA序列,每个种选择2~3个不同宿主植物、不同地理位置的代表性菌株,下载后整理成FASTA格式的文件。

采用3种生物学软件对测得的序列进行分析:1)DNAssist version 2.2^[20]用于序列碱基的对比。将测序得到的2条序列,通过比对整理获得完整的序列,找出不同序列间的差别碱基。2)采用BioEdit 7.0.5.3^[21]进行序列的多重比对,并调整序列长度,使进行系统发育分析的序列长度基本一致。3)采用MEGA 6.0^[22]构建系统发育树,运算1 000次,绘制出所选供试菌株的最大简约系统发育树(MP),并对系统发育树进行标注及分析。

2 结果与分析 2.1 目的基因片段的PCR扩增产物的回收和克隆

采用SDS法提取足够的真菌总DNA,琼脂糖电泳检测条带清晰,获得约23 kb的菌株总DNA。合成相关引物(表 1)进行PCR扩增,各菌株都获得了tefA基因的第1拷贝,扩增片段约850 bp(图 1-A)。利用选择性引物对菌株的tefA基因第2拷贝进行PCR扩增,得到Exn8101、Exn8102、Exn8201、Exj8101菌株tefA基因第2拷贝的条带,约600 bp(图 1-B)。

	图 1 tefA第1拷贝(A)和第2拷贝(B)扩增图谱 Fig. 1 PCR production of tefA gene allele-1(A)and allele-2(B) A:M.Marker;1.Rjl7101;2.Rjl7104;3.Exn8101;4.Exn8102;5.Exn8201;6.Exj8101;B:M.Marker;1.Rjl7101;2.Rjl7104;3.Exn8101;4.Exj8101
图选项

PCR扩增没有得到tubB基因片段的第2拷贝,通过PCR直接测序能够获得tubB第1拷贝清晰的峰图,扩增片断约750 bp;但确认供试菌株tubB基因没有多拷贝(图 2)。

	图 2 tubB第1拷贝扩增图谱 Fig. 2 PCR production of tubB allele-1 M.Marker;1.Rjl7101;2.Rjl7104;3.Exn8101;4. Exn8102;5. Exn8201;6. Exj8101;7. Exj8101;8. Exj8102
图选项

经测序获得全部5个菌株的tefA及tubB基因第1拷贝、2个菌株(Exn8101、Exj8101)的tefA基因第2拷贝序列。

2.2 获得目的基因片段序列的分析

对测得的菌株序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索,结果表明测得的序列与Epichloë属内生真菌相关序列的相似度最高(表 2)。同时对菌株序列之间的差异进行了比对:用于系统发育分析的tefA和tubB基因序列相似度非常高,圆柱披碱草植物分离菌株之间tefA序列第1拷贝之间也只存在8个碱基的差异,tubB序列第1拷贝则更为保守,只相差4个碱基。

表 2 Epichloë属菌株的tubB和tefA基因序列 Table 2 tubB and tefA sequence of Epichloë strains

菌种 Species	菌株 Strain	宿主 Host species	族 Host tribe	起源 Geographic origins	NCBI序列号 NCBI accession No.
菌种 Species	菌株 Strain	宿主 Host species	族 Host tribe	起源 Geographic origins	tubB	tefA
E.amarillans	906	Agrostis perennans	Agrostideae		AF457467	AF457506
E.amarillans	ATCC200743	Sphenopholis obtusata	Agrostideae	美国USA	L06958	AF231191
E.baconii	ATCC200745	Calamagrostis villosa	Agrostideae	瑞士Switzerland	L78270	AF231196
E.baconii	ATCC76552	A. stolonifera	Agrostideae	英国Britain	L06961	AF231193
E.brachyelytri	ATCC200752	Brachyelytrum erectum	Brachypodieae	美国USA	L78271	AF231197
E.brachyelytri	ATCC201561	B. erectum	Brachypodieae	美国USA	AF062427	AF231200
E.bromicola	9630	Bromus erectus	Bromeae	瑞士Switzerland	AY033382	AY033356
E.bromicola	9633	Br.erectus	Bromeae	瑞士Switzerland	AY033385	AY033359
E.clarkii	ATCC200741	Holcus lanatus	Poeae		AF250738	AF231207
E.clarkii	ATCC200742	H.lanatus	Poeae	瑞士Switzerland	L78281	AF231206
E.elymi	ATCC200850	Elymus virginicus	Triticeae	美国USA	L78273	AF231208
E.elymi	ATCC201554	El.villosus	Triticeae	美国USA	AF250742	AF457503
E.festucae	ATCC201550	Festuca rubra	Poeae	欧洲Europe	L06957	AF231211
		subsp.commutata
E.festucae	ATCC90661	F. rubra var. rubra	Poeae		L06955	AF231210
E. glyceriae	ATCC200747	Glyceria striata	Meliceae	美国USA	L78275	AF231216
E. glyceriae	ATCC200755	G. striata	Meliceae	美国USA	L78276	AF231217
E.sylvatica	ATCC200748	Brachypodium sylvaticum	Brachypodieae	日本Japan	L78278	AF231218
E.sylvatica	ATCC200751	Bra. sylvaticum	Brachypodieae	瑞士Switzerland	L78291	AF231219
E.typhina	ATCC200738	Anthoxanthum odoratum	Aveneae	瑞士Switzerland	L78288	AF231222
E.typhina	ATCC200739	Bra. pinnatum	Brachypodieae	瑞士Switzerland	L78292	AF231223
E.typhina	ATCC200740	Dactylis glomerata	Poeae	瑞士Switzerland	L78274	AF231225
E.typhina	ATCC200851	Phleum pratense	Agrostideae	瑞士Switzerland	L78280	AF231226
E.typhina	ATCC201666	Poa silvicola	Poeae	瑞士Switzerland	L78285	AF231228
E.typhina	ATCC201667	P. nemoralis	Poeae	瑞士Switzerland	AF062429	AF231229
E.typhina	ATCC201669	P. pratense	Poeae	瑞士Switzerland	L78284	AF231231
E.typhina	E432	Lolium perenne	Poeae	法国France	AF250752	AF231221
E.yangzii	Rnj3302	Roegneria kamoji	Triticeae	中国China	DQ134036	DQ134030
E.yangzii	Rnj4201	R.kamoji	Triticeae	中国China	DQ134039	DQ134033
E.yangzii	Rnj4301	R.kamoji	Triticeae	中国China	DQ134040	DQ134034
Epichloë sp.	9924	Holcus mollis	Poeae	美国USA	AF457469	AF457507
E. aotearoae	CBS109344	Echinopogon ovatus	Aveneae	新西兰New Zealand澳大利亚Australia	AF323370	AF323391
				澳大利亚Australia
E. australiensis	CBS109346/937	Ec. ovatus	Aveneae	澳大利亚Australia	AF323379AF323381	AF323400AF323402
					AF323381	AF323402
E. chisosa	ATCC 64037/134	Stipa eminens(=Achnatherumeminens)	Stipeae	北美	AF457471	AF457509
				North America	AF457470	AF457508
					AF457472	AF457510
E. coenophiala	ATCC 90664/e19	L. arundinaceum	Poeae	日本Japan	L06964	AF457511
					L06951	AF457512
					X56847
E. gansuensis	E7082	Achnatherum inebrians	Stipeae	中国China	EF422757
E. gansuensis	E7080	A. inebrians	Stipeae	中国China	EF422756
E. inebrians	ATCC MYA-1187/817	A. inebrians	Stipeae	欧亚Eurasia	AF457494	AF457538
E. inebrians	ATCC MYA-1228/818	A. inebrians	Stipeae	欧亚Eurasia	AF457495	AF457539
E. guerinii	CBS 112036	Melica ciliata	Meliceae	法国France	EF422754
					EF422755
E. guerinii	ATCC MYA-1235	M. transsilvanica	Meliceae	瑞士Switzerland	EF422746
					EF422747
E.typhina subsp.	ATCC 64040	Festuca arizonia	Poeae	北美	AF457493	AF457537
poae var.huerfana				North America	AF457493	AF457537
E.festucae var. lolii	135	L. perenne ssp. perenne	Poeae	欧洲Europe,新西兰New Zealand	AY865628	AF457540
	135			欧洲Europe,新西兰New Zealand
E.melicicola	CBS109342/827	M. decumbens	Meliceae	非洲Africa	AF323384	AF323406
					AF323386
E. occultans	992	L.perenne var. rigidum	Poeae	新西兰	AF176271	AF457542
				New Zealand	AF176275	AF457541
E. siegelii	ATCC 74483/e915	L. pratense	Poeae	欧洲Europe	AF308138	AF308132
					AF308139	AF308133
E. tembladerae	ATCC 200844/1169	P. huecu	Poeae	北美	AF323389	AF323407
				North America	AF323390	AF323408
E. tembladerae	4055	F. arizonica	Poeae	北美	AF457496	AF457545
				North America	AF457497	AF457544
E.typhina subsp.	989	L. edwardii	Poeae	西班牙Spain	AF176266	AF457543
poae var. canariense
E. uncinata	CBS102646	L. pratense	Poeae	欧洲Europe	L06946	AF308131
E. stromatolonga	Cnj6611(AS5.904)	C. epigeios	Agrostideae	中国China	EU526823	EU526818
E. stromatolonga	Cnj6617	C. epigeios	Agrostideae	中国China	EU526824	EU526820
E.liyangensis	Ply9201	P. pratensis ssp.	Poeae	中国China	HM475156	HM475168
		pratensis			HM475160	HM475164
E.liyangensis	Ply9202	P. pratensis ssp.	Poeae	中国China	HM475157	HM475169
		pratensis			HM475161	HM475165
E. sinofestucae	Fnj4602	F. parvigluma	Poeae	中国China	FJ211211	FJ211201
					FJ211212	FJ211202
E. sinofestucae	Fnj6606	F. parvigluma	Poeae	中国China	FJ211219	FJ211209
					FJ211220	FJ211210
E.sinica	Rxy6106	R.kamoji	Triticeae	中国China	EU409305	EU409303
					EU409308	FJ189478
E.sinica	Rts2102	R.kamoji	Triticeae	中国China	EU409307	EU409301
					FJ189479	FJ189476
E.sinica	Rjl7101	R.canina	Triticeae	中国China	GU447303	GU447305
E.sinica	Rjl7104	R.canina	Triticeae	中国China	GU447304	GU447306
						GU447307
E.canadensis	CWR 5	El.canadensis	Triticeae	北美	JN886778	JN886775
				North America	JN886777	JN886776
E.bromicola	NI_201201	El.excelsus	Triticeae	中国China	KJ585731	KJ585716
E.bromicola	NI_201203	El.excelsus	Triticeae	中国China	KJ585732	KJ585717
E.bromicola	NI_201206	El.tibeticus	Triticeae	中国China	KJ585733	KJ585718
E.bromicola	NI_201208	El.dahuricus	Triticeae	中国China	KJ585734	KJ585720
E.bromicola	NI_201209	El.tangutorum	Triticeae	中国China	KJ585735	ND
E.bromicola	NI_201210	El.tangutorum	Triticeae	中国China	KJ585736	KJ585721
E.bromicola	NI_201213	El.tangutorum	Triticeae	中国China	KJ585737	KJ585722
E.bromicola	NI_201214	El.excelsus	Triticeae	中国China	KJ585738	KJ585723
E.bromicola	NI_201216	El.tangutorum	Triticeae	中国China	KJ585739	KJ585724
E.bromicola	NI_201218	El.excelsus	Triticeae	中国China	KJ585740	KJ585725
E.bromicola	NI_201221	El.tangutorum	Triticeae	中国China	KJ585741	KJ585726
E.bromicola	NI_201222	El.cylindricus	Triticeae	中国China	KJ585742	KJ585727
E.bromicola	NI_201302	El.nutans	Triticeae	中国China	KJ585743	KJ585728
E.bromicola	NI_201306	El.dahuricus	Triticeae	中国China	KJ585744	KJ585729
E.bromicola	NI_201308	El.cylindricus	Triticeae	中国China	KJ585745	KJ585730
E.bromicola	NI_201207	El.tongutorum	Triticeae	中国China	ND	KJ585719
E.bromicola	AL0814/1	El.repens	Triticeae	亚洲Asia	GU325782	KC296739
Epichloë sp.^*	Exj8101	El.cylindricus	Triticeae	中国China	HM042855	HM042861
						KU379752
	Exj8102	El.cylindricus	Triticeae	中国China	HM042856	HM042862
	Exn8102	El.cylindricus	Triticeae	中国China	HM042858	HQ241821
	Exn8201	El.cylindricus	Triticeae	中国China	HM042859	HM042864
	Exn8101	El.cylindricus	Triticeae	中国China	HM042860	HM042866
	(CGMCC 3.13631)					HM042867
注:ND:未扩增到序列No sequence detected;*:本研究中菌株Strains in this study.

表选项

通过NCBI数据库进行序列比对,并选择序列相似度最高的各种代表性菌株的序列构建MP系统发育树。

2.3 菌株的分子系统发育学分析

根据tefA和tubB基因序列构建的最大简约(MP)树的拓扑结构相似,除ETC中的E.typhina外,基本上每一个物种都形成一个独立的分支,而且自展支持率较高(图 3和4)。

图 3 根据tubB基因序列构建的最大简约系统发育树 Fig. 3 Epichloae endophytes tubB phylograms based on maximum parsimony 1 000次重复,自展值>60%。●:本研究中El.cylindricus分离菌株;▲:亚洲披碱草分离菌株;◆:北美披碱草分离菌株。EBY:Epichloё bromicola/E.yangzii。
1 000 replicates,bootstrap value>60%. ●:Strains obtained from El.cylindricus in this study;▲:Asia strains obtained from Elymus spp.;◆:North American strains obtained from Elymus spp.. EBY:Epichloё bromicola/E.yangzii. The same as follows.

图选项

	图 4 根据tefA基因序列构建的最大简约系统发育树 Fig. 4 Epichloae endophytes tefA phylograms based on maximum parsimony ETC:E.typhina complex
图选项

在由tubB基因序列所构建的MP树上,圆柱披碱草的5个分离菌株第1拷贝与鹅观草分离菌株E.sinica的第1拷贝亲缘关系较近,聚为一支,自展值为71。tubB基因没有第2拷贝。

在由tefA基因序列所构建的MP树上,5个分离菌株第1拷贝与我国其他披碱草菌株聚为单独的一支,自展值为70;尤其来自新疆的2个菌株,以100的自展值单独成支。分离菌株的第1拷贝与我国其他披碱草菌株、鹅观草分离菌株E.sinica、草地早熟禾内生真菌E.liyangensis的第1拷贝亲缘关系较近,聚集为自展值为90的一大支。Exn8101和Exj8101的第2拷贝分散位于ETC内。

3 讨论

麦类作物是最重要的作物之一。世界各地都在探索小麦属植物内生真菌,但至今仅仅获得了一些非特异性菌株(即无严格宿主特异性的广义内生真菌),具有严格宿主特异性的epichloae内生真菌则一无所获^{[23, 24, 25]}。与小麦属(Triticum)近缘的植物类群有偃麦草属(Elytrigia)、山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agropyron)、赖草属(Leymus)、新麦草属(Psathyrostachys)、鹅观草属(Roegneria)、披碱草属(Elymus)、旱麦草属(Eremopyrum)等^[26]。因此,各国的研究人员都将探索范围扩大到与麦类植物近缘的其他禾本科植物,其中以披碱草属和鹅观草属的相关工作最多。

披碱草属和鹅观草属亲缘关系非常密切,两者最显著的区别是在每节穗轴上小穗的数量。披碱草属植物有2个或2个以上(2-4-6)的小穗;而鹅观草只有1个小穗^[26]。在美洲,披碱草属植物种类多,分布广,而只有1个小穗的鹅观草属植物则很少。因此,在美国的植物分类学,鹅观草属被合并入披碱草属中。相反,在高加索以东的亚洲地区,只有1个小穗的鹅观草属植物十分丰富。因此,在以苏联为代表的基于欧亚大陆的植物分类学体系中,鹅观草属植物独立成为一个属^[26]。在我国的植物分类学体系中,鹅观草属与披碱草属共存。此前,欧美学者从美洲的披碱草属植物中,发现了有性的E.elymi^[11],而我们从鹅观草属植物中发现的类似的内生真菌则为E.bromicola(syn.E.yangzii)^{[1, 17]},显示出两者在宿主/内生真菌应答机制方面的差异。我们对我国18个省市鹅观草(Roegneria spp.)植物中的真菌进行过调查,报道了2个新物种,分别是有性型的E.bromicola(syn.E.yangzii)和无性型的E.sinica^{[17, 19]}。分离得到E.sinica各菌株的宿主植物有R.kamoji、R.ciliaris、R.japonensis和R.canina等鹅观草属植物,在多年的研究中逐渐拓宽了E.sinica的宿主种类。将E.sinica地理范围由华南、华东延伸至西北、华北^[27]。E.bromicola(syn.E.yangzii)的宿主目前仅为鹅观草(R.kamoji),且地理范围较E.sinica局限。基于tefA和tubB基因序列的系统发育学分析,E.sinica被认为是E.bromicola(syn.E.yangzii)和E. sylvtica的杂交后代。

从广泛分布于北美大陆的加拿大披碱草中,目前已有2个物种被报道,分别是有性型的 E.elymi及无性型的E.canadensis^{[11, 12]}。根据系统发育学分析,E.canadensis同样具有双拷贝,被认为是 E.elymi和E.amarillans的杂交后代。虽然我国已有在披碱草中分离到内生真菌的报道^{[13, 14]},15个披碱草分离菌株仅得到1个actG拷贝、1个tefA和tubB拷贝^[15],也并未发现任何菌株具有第2个tefA基因拷贝^[16],并认为它们为非杂交起源。

由于无法扩增得到5个圆柱披碱草分离菌株的tubB第2拷贝,我们通过PCR直接测序的方法,获得了单一的峰图。之前的研究表明,若菌株有多拷贝且采用PCR产物直接测序时,测序得到的信号峰图会在某段位置出现双峰或杂峰^{[6, 28]}。所以可以判定分离菌株的tubB基因没有多拷贝,这与E.sinica有所区别。本研究为首次从我国圆柱披碱草属内生真菌中检测到tefA基因片段的2个拷贝,其中第2拷贝通过特异性引物获得。

由tefA和tubB基因序列获得的最大简约树拓扑结构相似,圆柱披碱草植物分离菌株的第1拷贝和第2拷贝在MP树上都与E.sinica亲缘关系较近,其中tefA序列第1拷贝能够聚为单独的一支。在系统发育树上,分离菌株的tefA序列2个拷贝中其中1个拷贝与E.bromicola(syn.E.yangzii)聚类,另一个拷贝位于ETC一支,所以分离菌株很可能是杂交而来。根据系统发育树我们认为分离菌株可能起源于E.bromicola(syn.E.yangzii)和ETC中菌株,与E.sinica有相似的起源。而且从目前在中国发现的具有杂交起源的分离菌株都表现出比较近的亲缘关系,第1拷贝都聚于EBY大支,第2拷贝分布于ETC大支上,因此这些菌株可能都有相同的祖先E.bromicola(syn.E.yangzii)^{[19, 27]}。

长期以来的研究结果发现,亲缘关系接近的物种其中的内生真菌也往往接近^[19]。虽然来自我国西北的圆柱披碱草分离菌株与E.elymi及E.canadensis都分离自同一属的植物^{[11, 12]},但两者亲缘关系较远。分离菌株与E.elymi在地理分布和系统发育分析上都有很大的差异,分离菌株与E.elymi及E.canadensis明显属于不同的类群。中国的菌株与国外菌株在起源上存在着巨大的差异,这可能是由于分布地点上有较为明显的地域隔离所产生的结果。

圆柱披碱草分离菌株在基于tefA的系统发育树中聚类于独立的分支,但依然与E.sinica关系密切。再加上宿主植物种类的差异,地理分布上的不同,它们之间存在一定的差异。本文发现的Epichloë sp.-El.cylindricus为一个新的共生体组合,从我国西北地区圆柱披碱草中获得的分离菌株为具有杂交[E.bromicola(syn.E.yangzii)和E.sylvatica]起源的无性Epichloë属内生真菌。

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