文章信息
- 张丹妮, 黄瑶, 乔颖, 夏彩萍, 骆宇强, 陈志刚. 2016.
- ZHANG Danni, HUANG Yao, QIAO Ying, XIA Caiping, LUO Yuqiang, CHEN Zhigang. 2016.
- 羟丙基-β-环糊精包合穿心莲内酯及其衍生物的抑菌活性研究
- Antibacterial activity of inclusion complexes of andrographolide and 14-acetylandrographolide by hydroxypropyl-β-cyclodextrin
- 南京农业大学学报, 39(2): 318-324
- Journal of Nanjing Agricultural University, 39(2): 318-324.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201509035
-
文章历史
- 收稿日期：2015-09-23
穿心莲内酯(andrographolide,AND)是我国传统中草药爵床科植物穿心莲[Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees]的有效活性成分之一,是一种二萜内酯类化合物[1, 2],水溶性较差(25 ℃下的溶解度为46.3 μg · mL-1[3]),具有清热解毒、抗病毒、抗肿瘤等功效[4, 5, 6]。Chen等[7, 8, 9]对穿心莲内酯进行了酶法修饰研究,并进行了初步的抑菌活性探究。研究表明,对于某些菌株,原料穿心莲内酯不具有活性,但其修饰产物——乙酰化穿心莲内酯具有明显的活性[9]。上述酶法修饰由于引入了疏水性的脂肪酸链,导致产物的水溶性降低,因此该产物在食品、医药等行业的实际应用中会受到很大限制。而羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)具有良好的亲水性,其分子空腔可包合大分子物质,能显著提高被包合物的水溶性和稳定性,2010年我国药典已收载了其可作为包合剂[10]。本试验即采用羟丙基-β-环糊精对穿心莲内酯及其衍生物进行包合,以提升原料的水溶性,并以食品中常见的4种致病菌为试验菌株,研究了包合物的抑菌作用,为穿心莲内酯及其衍生物在食品(作为一种新型的防腐剂)及医药工业中的应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 药品试剂穿心莲内酯纯品(AND,纯度大于99%)购自南京替斯艾么中药研究所;乙酰化穿心莲内酯由本实验室Chen等[9]自行酶催化制备(AcAND,纯度大于98%);羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD,平均取代度5.5,纯度大于99%)由泰兴市一鸣生物制品有限公司惠赠;乳酸链球菌素(Nisin,效价大于900 IU · mg-1)购自浙江新银象生物工程有限公司;对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,纯度大于95%)购自广州捷倍斯生物科技有限公司;碱性磷酸酶(AKP)测试盒购自南京建成生物工程研究所。
所用试剂除了2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA二钠盐)的纯度大于98%外,其他如氯化钠、氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钠、碳酸氢钠、五水硫酸铜等均为分析纯。
1.1.2 菌株及培养基4种试验菌株分别为大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 25923)、沙门氏菌(Salmonella enterica,ATCC 14028)、单増李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,CICC 21634)。营养琼脂(NA)培养基、平板计数琼脂(PCA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基和MH肉汤(MHB)培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3 实验仪器TG16-WS台式高速离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司;H1650-W台式微量高速 离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司;SW-CJ-ID单人净化工作台购自苏州净化公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂;SHX-250B生化培养箱购自常州冠军仪器制造有限公司;SHZ-82A气浴恒温振荡器购自金坛市科析仪器有限公司;T18 digital ULTRA-TURRAX分散机购自IKA公司;紫外可见分光光度计购自北京莱伯泰科仪器有限公司。
1.2 包合物制备及检测方法的确定抑菌液的制备:创新包合方法,取45.8 mg AND和51.2 mg AcAND分别溶于含196.0 mg HP-β-CD的8.0 mL去离子水中,分别在T18高速分散机中以15 000 r · min-1的转速均质5 min后,以12 000 r · min-1的转速离心15 min,取上清液。
抑菌液经0.45 μm的微孔滤膜过滤后进行紫外波长扫描,确定包合物的最佳检测波长,用相同浓度的HP-β-CD水溶液作空白调零。
1.3 菌株的活化及菌悬液的制备将供试菌株接入NA试管斜面培养基中,37 ℃静置培养24 h进行活化;活化后的菌种接种于TSB培养基中,置于气浴恒温振荡器中,以180 r · min-1、37 ℃的条件培养18~24 h,使菌株达到对数生长期。
1.4 包合物对4种菌株生长的影响取1.2节中的抑菌液经0.22 μm的微孔滤膜过滤,将其与菌悬液以1 : 1的体积比进行混合,置于气浴 恒温振荡器中,以180 r · min-1、37 ℃的条件培养。培养一定时间后,分别于0、2、5、8、12和25 h取样1 mL,按照国家标准(GB 4789.2—2010)进行菌落总数的测定,以相同浓度的HP-β-CD水溶液为空白对照。共筛选出2种菌株进行后续抑菌试验。
1.5 包合物对筛选出的2种菌株的抑菌效果 1.5.1 抑菌圈的测定取1.2节中的抑菌液,经0.22 μm的微孔滤膜过滤作为抑菌圈试验的抑菌液。将1.3节中的2种菌液转接至TSB培养基,置于气浴恒温振荡器以180 r · min-1、37 ℃的条件振荡培养,取浓度为106~107 CFU · mL-1的菌液,参照刘秀丽[11]的方法进行抑菌圈的测定。
1.5.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定将1.3节中的大肠杆菌抑菌液转接至MHB培养基中,单増李斯特氏菌的抑菌液转接至TSB培养基中,分别置于气浴恒温振荡器以180 r · min-1、37 ℃的条件振荡培养,取浓度为106~107 CFU · mL-1的菌液,采用倍比微量稀释法[12]分别进行最小抑菌浓度(MIC)的测定,同浓度的HP-β-CD水溶液为空白孔对照。
1.5.3 最小杀菌浓度(MBC)的测定从1.5.2节中大于等于MIC的孔中取100 μL培养液,涂布接种至平板计数培养基,同时从原接种液中吸取100 μL做涂布接种,在37 ℃生化培养箱中培养48~72 h后计数菌落数,即可得到该药的最小杀菌浓度(MBC)。
1.6 包合物对2种菌的抑菌机制制备MIC浓度的抑菌液,将其与1.5.1节中的菌悬液以1 : 1的体积比进行混合,相同浓度的HP-β-CD水溶液为空白对照,置于37 ℃、180 r · min-1气浴恒温振荡器中培养,分别于0、2、5、8和12 h进行取样,经8 000 r · min-1离心5 min后取上清液进行抑菌机制的研究。
1.6.1 包合物对菌体细胞壁的影响使用AKP试剂盒测定细胞破损后释放在菌液上清液中的碱性磷酸酶(AKP)活性。单位定义:每克酶蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位,即7.14 U · L-1。
1.6.2 包合物对菌体细胞膜的影响β-半乳糖苷酶(β-GAL)作为细胞膜完整性的一个检测指标,其检测方法参照叶敏[13]的方法进行。1个酶活性单位(U)定义为37 ℃、pH7.0的条件下,每分钟生成1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
1.6.3 胞内蛋白质外泄的检测采用二喹啉甲酸(BCA)法测上清液蛋白含量,取0.1 mL样品液和标准液,加入2 mL BCA工作试剂,混匀后于60 ℃水浴加热15 min,冷却至室温,562 nm处测定上清液中的总蛋白浓度。
1.7 数据分析所有的试验至少设有3个平行,数据用SPSS 18.0进行显著性分析(One-way ANOVA),数据结果以均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 包合物的检测方法以原料摩尔比为1 : 1制备好的AND/AcAND-HP-β-CD包合物,稀释后在200~400 nm紫外波段内扫描,扫描结果见图 1。由图 1可知:2种包合物的最大紫外吸收波长均为220~225 nm,选取224 nm作为包合物的最佳检测波长。此波长下,根据标准曲线计算,所制备的抑菌液中AND-HP-β-CD为2 200 μg · mL-1,AcAND-HP-β-CD为1 200 μg · mL-1。参照陈梅莉[3]的方法,试验分别测定了25 ℃下AND和AcAND的溶解度。结果(表 1)可见:HP-β-CD的包合作用可以显著提高AND和AcAND的水溶性。
 |
图 1 AND/AcAND-HP-β-CD的紫外波长扫描图
Fig. 1 UV wavelength scan of AND/AcAND-HP-β-CD
AND-HP-β-CD:穿心莲内酯-羟丙基-β-环糊精包合物;AcAND-HP-β-CD:乙酰化穿心莲内酯-羟丙基-β-环糊精包合物 The same as follows. |
| 被包合物Target substance | 包合前溶解度/(μg·mL-1)The aqueous solubility before inclusion | 包合后溶解度/(μg·mL-1)The aqueous solubility after inclusion | P值P-value |
| 穿心莲内酯AND | 70.18±0.83 | 2 200.08±28.20 | <0.001 |
| 乙酰化穿心莲内酯AcAND | 110.58±0.65 | 1 198.72±24.57 | <0.001 |
AND-HP-β-CD(1 100 μg · mL-1)和AcAND-HP-β-CD(600 μg · mL-1)对菌体生长影响的平板计数结果(图 2)可知:AND的酶法修饰产物AcAND经HP-β-CD包合后,形成的包合物AcAND-HP-β-CD的抑菌能力比AND-HP-β-CD强。
 | 图 2 AND/AcAND-HP-β-CD对菌株生长的影响 Fig. 2 Effect of AND/AcAND-HP-β-CD on the strain growth A:大肠杆菌Escherichia coli;B:单增李斯特氏菌Listeria monocytogenes;C:沙门氏菌Salmonella enterica;D:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus |
由图 2-A可见:空白组的细菌总数持续上升并最终达到稳定;AcAND-HP-β-CD组加入抑菌液后,大肠杆菌总数即刻开始下降,并在8 h左右达到最低,虽然后续细胞数增加,但仍远低于空白组,说明AcAND-HP-β-CD可显著抑制大肠杆菌的增殖。虽然AND-HP-β-CD组的细菌数量与空白组相比也有所降低,但AND-HP-β-CD包合物的整体抑菌效果较差且持续时间短,8 h后的菌落数与空白持平。
图 2-B显示:加入AcAND-HP-β-CD组的细胞数相对于其他两组,从2 h起开始显著降低,且持续整个试验过程;AND-HP-β-CD组与空白菌落数相差不大,说明AND-HP-β-CD对单増李斯特氏菌的生长无明显抑制作用,AcAND-HP-β-CD包合物能显著抑制单増李斯特氏菌的生长。
由图 2-C、D可知:AcAND-HP-β-CD包合物和AND-HP-β-CD包合物均对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌产生了一定的抑制效果,且AcAND-HP-β-CD包合物比AND-HP-β-CD包合物的抑菌效果更显著。总体来说,2种包合物对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制效果不如对大肠杆菌和单增李斯特氏菌的抑制效果显著。因此,后续抑菌试验选择大肠杆菌和单增李斯特氏菌为试验菌株。
2.3 包合物的抑菌效果2种包合物的抑菌效果通过测定抑菌圈、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)这3个指标来判断。由表 2和表 3可知:AND-HP-β-CD无可见的抑菌圈形成,没有显示出体外抑菌活性,但其酶法修饰产物AcAND与HP-β-CD形成的包合物显示出很强的抑菌活性,且抑菌活性随质量浓度升高而增强。因此,选用AcAND-HP-β-CD包合物为后续抑菌机制研究的试验药物。此外,从表 2还可以看出:AcAND-HP-β-CD的抑菌效果比天然活性抗菌肽Nisin的效果更佳。
| mm | |||||
| 菌株Strains | ρ(AcAND-HP-β-CD)/(mg·mL-1) | ρ(AND-HP-β-CD)/(mg·mL-1) | 乳酸链球菌素质量浓度/(mg·mL-1)Concentration of nisin | ||
| 1.2 | 0.6 | 1.2 | 0.6 | 1.0 | |
| 大肠杆菌E.coli | 25.0±0.1 | 24.3±0.5 | — | — | 9.5±0.2 |
| 单增李斯特氏菌L.monocytogenes | 20.5±0.2 | 18.4±0.3 | — | — | 11.0±0.5 |
| 菌株Strains | MIC/(μg·mL-1) | MBC/(μg·mL-1) | ||
| AcAND-HP-β-CD | AND-HP-β-CD | AcAND-HP-β-CD | AND-HP-β-CD | |
| 大肠杆菌E.coli | 18.75 | >128 | 37.50 | >128 |
| 单增李斯特氏菌L.monocytogenes | 37.50 | — | 75.00 | — |
| 注:MIC>128 μg · mL-1的抑菌物质被认为几乎没有抑菌效果。 Note:The antibiotics of MIC>128 μg · mL-1 was considered to be inactive. |
||||
从图 3可以看出:与空白对照相比,加入AcAND-HP-β-CD的菌液上清液中,AKP活性显著升高,且大肠杆菌组的AKP活性升高更显著。可见,AcAND-HP-β-CD对大肠杆菌和单增李斯特氏菌的细胞壁都有一定的破坏作用,且对大肠杆菌的破坏作用尤为显著,使胞内AKP外泄至细胞外。
 | 图 3 AcAND-HP-β-CD对胞外碱性磷酸酶(AKP)活性的影响 Fig. 3 The effect of AcAND-HP-β-CD on extracellular alkaline phosphatase(AKP)activity A:大肠杆菌E.coli;B:单增李斯特氏菌L.monocytogenes |
图 4-A显示:菌液上清液中β-GAL活性在加入AcAND-HP-β-CD后即出现明显升高,提示细胞膜出现了破损,导致该酶泄漏到细胞外。这与图 2-A的结果一致。单增李斯特菌培养液上清液中的β-GAL活性也显示出类似结果(图 4-B)。此外,12 h内大肠杆菌酶活性变化(2.3个酶活单位)约为单增李斯特氏菌酶(0.9个酶活单位)的2.5倍,提示包合物对大肠杆菌生长的抑制效果更好。
 | 图 4 AcAND-HP-β-CD对胞外β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性的影响 Fig. 4 The effect of AcAND-HP-β-CD on extracellular β-galactosidase(β-GAL)activity A:大肠杆菌E.coli;B:单增李斯特氏菌L.monocytogenes |
由图 5可见:与空白相比,随时间延长,加入AcAND-HP-β-CD试验组菌液上清液中的蛋白质质量浓度增大,说明菌体内蛋白质泄漏明显增加,尤其是大肠杆菌蛋白质的泄漏程度更高。
 | 图 5 AcAND-HP-β-CD对胞内蛋白质外泄的影响 Fig. 5 The effect of AcAND-HP-β-CD on the intracellular protein A:大肠杆菌E.coli;B:单增李斯特氏菌L.monocytogenes |
HP-β-CD是由β-环糊精(β-CD)多个羟基上的氢被羟丙基取代所形成的衍生物,由于破坏了β-CD的分子间氢键,使其水溶性增加,现已广泛被用作药物的增溶剂、稳定剂等[14]。本研究表明,AND被16 mmol · L-1 HP-β-CD包合后,水溶性显著提高,提高了50倍,物质水溶性的增加使其抑菌活性增强。此外,本试验创新了包合物的制备方法,与传统常见的研磨法、超声波法、共沉淀法等[3, 15, 16, 17]相比,该方法不仅操作简单、快捷,同时无有机溶剂残留问题;更重要的是,可明显缩短制备时间,提高生产效率,节约能源。
穿心莲是中国传统中药,具有清热解毒、消肿止痛等功效,其主要有效成分之一是AND。很多学者[9, 18, 19]对AND及其衍生物的抑菌作用进行了一定的探究,结果表明AND对于某些菌株几乎无体外抑菌作用,但不同AND衍生物却表现出良好的抑菌能力,本试验结果与之相一致。此外,已有的构效关系研究表明,穿心莲内酯的二萜双环及其五元内酯环是其重要的药效团,α,β-不饱和双键是其解热抗炎活性所必需的药效基团[20, 21]。本文中的乙酰化穿心莲内酯是通过对五元内酯环进行酶法修饰而得,产物高效的抑菌活性再一次印证了此观点。同时,本研究的抑菌试验中,通过将AcAND-HP-β-CD与天然防腐剂Nisin的抑菌圈大小进行对比,发现其抑菌活性比Nisin更为显著,这为AcAND作为天然防腐剂的开发提供启发和参考。
AKP存在于菌体细胞壁与细胞膜之间,当细胞发生破损后,细胞壁的透性会变大,导致AKP泄漏到细胞外,因此通过检测菌液上清液中AKP的含量,可推测AcAND-HP-β-CD对菌体细胞壁的影响。β-GAL属于细胞膜的膜内物质,当细胞膜受到损害后,透性变化导致胞内酶外泄,所以其可作为细胞膜完整性的一个检测指标。AcAND-HP-β-CD包合物的抑菌机制研究显示:试验组的菌液上清液中检测到大量的AKP、β-GAL和胞内蛋白,说明AcAND-HP-β-CD破坏了大肠杆菌和单增李斯特氏菌的细胞壁和细胞膜的完整性,造成细胞通透性增加,细胞内生物酶和蛋白类物质渗出,从而造成了菌体的死亡。然而,AcAND-HP-β-CD对菌体的作用靶点、与菌体遗传物质的作用方式等抑菌模式还有待于进一步研究。
| [1] | Mishra K,Dash A P,Dey N. Andrographolide:a novel antimalarial diterpene lactone compound from Andrographis paniculata and its interaction with curcumin and artesunate[J]. Jounal of Tropical Medicine,2011,2011:1-6. |
| [2] | Sinaha P K,Roy S,Dey S. Protective activity of andrographolide and arabinogalactan proteins from Andrographis paniculata Nees.against ethanol-induced toxicity in mice[J]. Jouranl of Ethnopharmacology,2007,111(1):13-21. |
| [3] | 陈梅莉. 橙皮素和穿心莲内酯的增溶研究[D]. 杭州:浙江大学,2010. Chen M L. Studies on solvency enhancement of hesperetin and andrographolide[D]. Hangzhou:Zhejiang University,2010(in Chinese with English abstract). |
| [4] | Zhu Y Y,Yu G C,Zhang Y,et al. A novel andrographolide derivative AL-1 exerts its cytotoxicity on K562 cells through a ROS-dependent mechanism[J]. Proteomics,2013,13(1):169-178. |
| [5] | Dai G F,Xu H W,Jiang Z W,et al. Uses of C15-substituted andrographolide derivatives in the preparation of anti-hepatitis B virus medicament:US,2014/0187627 A1[P]. 2014-07-03. |
| [6] | Low M,Khoo C S,Munch G,et al. An in vitro study of anti-inflammatory activity of standardised Andrographis paniculata extracts and pure andrographolide[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2015,15(1):525-533. |
| [7] | Chen Z G,Tan R X,Cao L. Efficient and highly regioselective acylation of andrographolide catalyzed by lipase in acetone[J]. Green Chemistry,2009,11:1743-1745. |
| [8] | Chen Z G,Tan R X,Huang M. Efficient regioselective acylation of andrographolide catalyzed by immobilized Burkholderia cepacia lipase[J]. Process Biochemistry,2010,45:415-418. |
| [9] | Chen Z G,Zhu Q,Zong M H,et al. Enzymatic synthesis and antibacterial activity of andrographolide derivatives[J]. Process Biochemistry,2011,46:1649-1653. |
| [10] | 邱燕子. 羟丙基-β-环糊精与五种酶蛋白相互作用的研究[D]. 武汉:中南民族大学,2012. Qiu Y Z. Interaction between hydroxypropyl-β-cyclodextrin and five kinds of protein[D]. Wuhan:South-Central University for Nationalities,2012(in Chinese with English abstract). |
| [11] | 刘秀丽. 植物缩合单宁对大肠杆菌的抑制作用及抑菌机理的研究[D]. 呼和浩特:内蒙古农业大学,2013. Liu X L. Research on inhibition action of plant condense tannins to E.coli and antibacterial mechanism[D]. Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University,2013(in Chinese with English abstract). |
| [12] | 王喆,刘茜倩,庞博,等. 胰蛋白酶和糜蛋白酶与抗生素联用的体外抗菌活性研究[J]. 南京农业大学学报,2015,38(4):636-644. DOI:10.7685/j.issn.1000-2030.2015.04.017. Wang Z,Liu X Q,Pang B,et al. Antimicrobial activity of trypsin and chymotrypsin in combioution with antibiotic on pathogenic bacterium of cows mastitis in vitro[J]. Journal of Nanjing Agricultural University,2015,38(4):636-644(in Chinese with English abstract). |
| [13] | 叶敏. 牛肝β-糖苷酶催化2'-脱氧核苷区域选择性葡萄糖基化反应的研究[D]. 广州:华南理工大学,2011. Ye M. Enzymatic regioselective glucosylation of 2'-deoxynucleosides catalyzed by β-glycosidase from bovine liver[D]. Guangzhou:South China University of Technology,2011(in Chinese with English abstract). |
| [14] | 安琳娜. 环糊精包合技术用于提高难溶性药物溶解性的研究[D]. 北京:北京协和医学院,2010. An L N. The research on cyclodextrin inclusion techniques for improving solubility of poorly soluble drugs[D]. Beijing:Peking Union Medical College,2010(in Chinese with English abstract). |
| [15] | 韩光,李景华,刘蕾,等. 超声法制备穿心莲内酯-β-环糊精包合物的研究[J]. 中国新药杂志,2008,17(7):582-585. Han G,Li J H,Liu L,et al. Studies on preparing inclusion compound of andrographolide-β-cyclodextrin by ultrasonics[J]. Chinese Journal of New Drugs,2008,17(7):582-585(in Chinese with English abstract). |
| [16] | 李清波. 穿心莲内酯β-环糊精包合物的透皮吸收研究[D]. 长春:吉林大学,2009. Li Q B. Study of transdermal delivery of cyclodextrin inclusion of andrographolide with β-cyclodextrin[D]. Changchun:Jilin University,2009(in Chinese with English abstract). |
| [17] | Zhao D Y,Liao K J,Ma X Y,et al. Study of the supramolecular inclusion of β-cyclodextrin with andrographolide[J]. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry,2002,43:259-264. |
| [18] | Jiang X J,Yu P,Jiang J,et al. Synthesis and evaluation of antibacterial activities of andrographolide analogues[J]. European Journal of Medicinal Chemistry,2009,44(7):2936-2943. |
| [19] | Aromdee C,Sriubolmas N,Wiyakrutta S,et al. Effect of the derivatives of andrographolide on the morphology of Bacillus subtilis[J]. Archives of Pharmacal Research,2011,34(1):71-77. |
| [20] | Nanduri S,Nyavanandi V K,Thunuguntla S S R,et al. Synthesis and structure-activity relationships of andrographolide analogues as novel cytotoxic agents[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2004,14(18):4711-4717. |
| [21] | Agarwal D,Singh P. Synthesis,characterization and antibacterial activity of C(14)-sulfonyl ester-type andrographolide derivatives[J]. Journal of Global Biosciences,2015,4(5):2348-2354. |