金华火腿是我国著名的传统肉制品,含有丰富的营养成分^[1]。金华火腿的传统工艺加工周期长达8个月以上,主要的加工工艺包括:新鲜猪肉后腿经凉透和休整后反复擦盐腌制(约1个月);腌制完成后的腿料经浸泡洗刷并晾晒校形(约1个月);洗晒后的腿料再经上架发酵成为火腿产品(6个多月)。而金华火腿新生产工艺是用控温控湿的人造小气候取代自然条件,主要通过缩短发酵期使加工时间从原来的8个月以上缩短到3个月,新工艺生产的金华火腿同样具有传统工艺生产的金华火腿的色、香味^[2]。

抗氧化肽是具有清除或抑制体内各种自由基氧化物的小分子活性肽^[3]。虽然人工合成的抗氧化剂如丁基羟基甲苯(BHT)和丁基羟基茴香醚(BHA)等具有高效抑制氧化的作用,但人工合成的抗氧化剂具有潜在的负面作用^[4]。一些天然抗氧化剂,如从大豆蛋白^[5]、豌豆蛋白^[6]、蓝圆鲹蛋白^[7]等从食物蛋白中分离得到的抗氧化肽,具有较好的抗氧化作用,且无毒副作用而受到越来越多的关注。

在加工过程中,火腿中的肌肉蛋白质在内源蛋白酶的作用下发生水解而产生大量的多肽、小肽和氨基酸等。Sforza等^[8]的研究表明帕尔玛火腿中含有大量小分子多肽,并且主要为二肽。中国传统发酵肉制品如宣威火腿,采用阴离子交换柱和反向液相色谱等方法提取出来具有较高抗氧化活性的氨基酸片段,主要的抗氧化肽的序列为天冬氨酸-亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸、丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、丝氨酸-甘氨酸-酪氨酸和脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸^[9]。然而,关于金华火腿中抗氧化活性肽的提取及应用研究非常少,且比较传统工艺和新工艺条件下生产的金华火腿中粗肽液的抗氧化活性的研究也未见报道。因此,本研究以2种工艺条件下生产的金华火腿中提取的粗肽液为研究对象,以常用的具有较高抗氧化活性的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)为对照,研究金华火腿粗肽液对自由基的清除能力,螯合金属离子能力以及粗肽液的还原能力和总抗氧化能力,探讨不同工艺条件下金华火腿粗肽液的抗氧化活性,旨在进一步比较不同工艺金华火腿抗氧化肽的结构组成,分析不同工艺条件对金华火腿抗氧化肽造成的影响。

金华火腿(传统工艺和新工艺火腿)购于浙江省金字火腿食品有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、还原型谷胱甘肽(GSH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、还原型辅酶(NADH)、菲咯嗪(Ferrozine)购自Sigma公司,均为分析纯;邻苯二甲醛、β-巯基乙醇、氢氧化钠、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾购于国药集团化学试剂公司,均为分析纯;总抗氧化能力试剂盒购于南京建成试剂公司。

GM200刀式研磨仪购于德国Retsech公司;T25匀浆机购于德国IKA公司;ES2030冷冻干燥机购于日本Hitachi公司;Spectral Max M2e多功能酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司;水浴锅购于德国优莱博公司。

参照王娟等^[10]的方法并稍作修改。取成熟结束的成品股二头肌25 g绞碎后放入离心瓶中,加入100 mL磷酸缓冲溶液(pH 7.2),匀浆(22 000 r · min^-1,3次,每次10 s),在4 ℃条件下静置2 h;离心(4 ℃,12 000 g,20 min),吸取上清液,加入3倍体积的乙醇(40%,体积分数),静置12 h;再次离心(4 ℃,12 000 g,20 min),冷冻干燥。在分析测试前将样品保存于-20 ℃冰箱中。

参照Church等^[11]的方法并稍作修改。将传统工艺与新工艺粗肽粉分别配成质量浓度为0.5、1.0、5.0 mg · mL^-1的粗肽液,取待测样品150 μL加入3.0 mL邻苯二甲醛混合液配制:取40 mg邻苯二甲醛溶于1.0 mL甲醇,依次加入25 mL 100 mmol · L^-1硼砂(十水四硼酸钠)、2.5 mL 20%(质量分数)十二烷基硫酸钠和100 μL β-巯基乙醇,用去离子水调至总体积为50.0 mL,在室温下精确反应2 min,测定其在340 nm波长下的吸光值。取胰酪蛋白胨作为标准蛋白分别配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg · mL^-1等梯度浓度的溶液,测定其吸光值,绘制胰酪蛋白胨标准曲线后计算出传统工艺与新工艺金华火腿提取物中肽的含量。

清除DPPH自由基能力的测定参照Amarowicz等^[12]和Orban等^[13]的方法并作修改。将传统工艺与新工艺金华火腿粗肽液分别配成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg · mL^-1的溶液,并以相应质量浓度的GSH为对照。 取0.5 mL待测肽液与0.5 mL 0.2 mmol · L^-1的 DPPH- 无水乙醇溶液混合,振荡混匀,室温放置30 min后,在517 nm波长处测定反应物吸光值,记为A₁;以0.5 mL DPPH-无水乙醇溶液与0.5 mL无水乙醇混合物为对照组,在517 nm波长处测定反应物吸光值,记为A₂;空白组为0.5 mL肽液与0.5 mL无水乙醇混合,在517 nm波长处测定反应物吸光值,记为A₀。DPPH自由基清除率的计算公式为:DPPH自由基清除率=[1-(A₁-A₀)/(A₂-A₀)]×100%。

金属螯合能力的测定参照Lee等^[14]的方法。分别配制质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg · mL^-1的传统工艺与新工艺粗肽液,以相应质量浓度的GSH为对照。取1 mL待测溶液,加入0.05 mL 2 mmol · L^-1 FeCl₂,充分混匀后加入0.2 mL 5 mmol · L^-1菲咯嗪试剂,混匀。室温静置10 min后,在562 nm处测定吸光值,记为A₁。以双蒸水代替样品作为空白组,记为A₀。Fe²⁺螯合率计算公式为:Fe²⁺螯合率=(A₀-A₁)/A₀×100%。

还原能力的测定采用铁氰化钾还原体系,参照Ahmadi等^[15]的方法并稍作修改。分别配制质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg · mL^-1的传统工艺与新工艺火腿的粗肽液,以相应质量浓度的GSH为对照。取0.5 mL待测肽液加入0.5 mL 0.2 mol · L^-1磷酸缓冲液(pH6.6)和0.5 mL 10 g · L^-1铁氰化钾溶液的混合液中,置于50 ℃恒温水浴锅中保温20 min,取出并快速冷却。然后在反应液中加入0.5 mL 100 g · L^-1乙酸,混匀后3 000 r · min^-1离心10 min。吸取0.5 mL上清液,加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL 1.0 g · L^-1氯化铁反应,之后充分混匀静置10 min,在波长为700 nm处测定其吸光值,吸光值越大,说明该待测样品还原能力越强。

采用硝基四氮唑蓝还原法(NBT法),参照Sakanaka等^[16]的方法并稍作修改。用50 mmol · L^-1 Tris-HCl(pH8.0)缓冲液将传统工艺和新工艺粗肽分别配制成质量浓度为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg · mL^-1的粗肽液,并以相应质量浓度的GSH为对照。同样用Tris-HCl缓冲液(pH8.0) 分别配制300 μmol · L^-1 NBT、468 μmol · L^-1 NADH和60 μmol · L^-1 PMS溶液(最好现配现用)。取1.5 mL待测粗肽液,依次加入0.5 mL NBT、0.5 mL NADH和0.5 mL PMS,混匀后于25 ℃水浴5 min,在560 nm处测定吸光值,记为A₁。并以Tris-HCl(pH8.0)缓冲液代替样品作为空白对照,记为A₀。计算公式为:超氧阴离子自由基清除率=(1-A₁/A₀)×100%。

配制质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg · mL^-1的传统工艺与新工艺粗肽液,以相应质量浓度的GSH为对照。按照总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒说明书的步骤进行测定。

采用SPSS Statistics 17.0软件进行统计分析,用One-way ANOVA方法进行方差分析,采用Duncan′s multiple range test进行多重比较,显著水平设为P<0.05,数值表示为平均值±标准差。

通过测定,传统工艺粗肽粉中的肽含量为56.4%,高于新工艺粗肽粉中的肽含量(50.9%),且差异显著(P<0.05)。

由图 1可知:从2种工艺火腿提取的粗肽液都有清除DPPH自由基的能力,且随浓度的增加对DPPH自由基的清除能力逐渐提高,但均显著低于谷胱甘肽(GSH)对DPPH的清除能力。传统工艺与新工艺粗肽液在质量浓度为1.0 mg · mL^-1时清除DPPH自由基的能力差异不显著(P>0.05);当肽浓度大于2.0 mg · mL^-1时,新工艺粗肽液清除DPPH自由基的能力显著高于传统工艺;在浓度为5.0 mg · mL^-1时,新工艺粗肽液的清除率(40.10%)比传统工艺(30.13%)提高了约10%。在一定质量浓度范围内,新工艺粗肽液对DPPH自由基清除作用显著强于传统工艺。

	图 1 不同浓度抗氧化物对清除DPPH自由基能力的影响 Fig. 1 The effect of different concentrations of antioxidants on DPPH radical scavenging ability Crude peptide T:Crude peptide extracted from traditional processing method; Crude peptide N:Crude peptide extracted from new processing method. The same as follows.
图选项

由图 2可知:金华火腿粗肽液具有极强的金属离子螯合能力,极显著高于GSH(P<0.01);在浓度为1.0 mg · mL^-1时,传统工艺粗肽液螯合作用(92.9%)显著高于新工艺(87.2%),为GSH(12.05%)的7.7倍。当浓度大于2.0 mg · mL^-1时,传统工艺和新工艺粗肽液螯合Fe²⁺的能力差异不显著,且均显著高于GSH。表明传统工艺和新工艺粗肽液均具有较强的Fe²⁺的螯合能力。

	图 2 不同浓度抗氧化物对螯合Fe2+能力的影响 Fig. 2 The effect of different concentrations of antioxidants on Fe2+-chelating ability
图选项

由图 3可知:当质量浓度为1.0 mg · mL^-1时,传统工艺粗肽液的还原力与新工艺和GSH之间没有显著差异;当质量浓度高于2.0 mg · mL^-1时,GSH的还原能力显著高于传统工艺与新工艺,而2种工艺之间差异不显著。

	图 3 不同浓度抗氧化物对还原力的影响 Fig. 3 The effect of different concentrations of antioxidants on reducing power
图选项

由图 4可见:当肽浓度为1.0 mg · mL^-1时,传统工艺的清除率为73.6%,新工艺为49.1%,传统工艺粗肽液的清除作用显著高于新工艺,且2种工艺粗肽液清除率显著高于GSH(16.9%);当质量浓度分别为2.0和3.0 mg · mL^-1时,传统工艺粗肽液清除超氧阴离子自由基的能力高于新工艺,而新工艺粗肽液清除能力显著高于GSH;当质量浓度为5.0 mg · mL^-1,GSH对超氧阴离子的清除能力显著提高,且显著高于传统工艺和新工艺,而传统工艺粗肽的清除率则显著高于新工艺。

	图 4 不同浓度抗氧化物对清除超氧阴离子自由基能力的影响 Fig. 4 The effect of different concentrations of antioxidants on superoxide anion radical scavenging ability
图选项

由图 5可见:在不同质量浓度下,GSH总抗氧化能力均显著高于新工艺与传统工艺粗肽液。当质量浓度为1.0 mg · mL^-1时,传统工艺粗肽液总抗氧化能力(0.060 U)显著低于新工艺(0.246 U);当质量浓度分别为2.0和3.0 mg · mL^-1时两者差异不显著;当质量浓度高于4.0 mg · mL^-1时,新工艺粗肽液总抗氧化能力显著高于传统工艺,在4.0 mg · mL^-1时新工艺粗肽液总抗氧化能力达到0.850 U,为传统工艺(0.400 U)的2.1倍。表明在一定质量浓度范围内,新工艺粗肽液总抗氧化能力高于传统工艺粗肽液。

	图 5 不同浓度抗氧化提取物对总抗氧化能力的影响 Fig. 5 The effect of different concentrations of antioxidants on total antioxidant capacity(T-AOC)
图选项

本研究表明,传统工艺火腿粗肽粉中肽含量高于新工艺。金华火腿传统工艺生产周期达8个月以上,而改进后的新工艺加工时间只有3个月,传统工艺相较于新工艺而言加工时间更长,在此过程中火腿中的肌肉蛋白在内源蛋白酶的作用下可能会水解出更多的短肽和游离氨基酸等^[17]。

DPPH是一种有机自由基,目前清除DPPH自由基被作为评价物质抗氧化能力的指标之一^[18]。本试验中,传统工艺与新工艺粗肽液对DPPH自由基均有较好的清除能力,金华火腿含有一些疏水氨基酸如脯氨酸、色氨酸、缬氨酸等^[19],随着浓度增加,对DPPH自由基的亲和能力越强。而谷胱甘肽具有亲核性硫原子的半胱氨酸,可改变被结合的亲电子物质中的亲脂部位水溶性^[20],从而提高对DPPH自由基的清除作用,因而具有较高的DPPH自由基清除能力,且显著强于传统工艺与新工艺粗肽液。而传统生产工艺粗多肽的肽含量高于新工艺,所以DPPH自由基清除作用强于新工艺。

Fe可以通过Fenton反应使过氧化物产生自由基,进而导致人类的一些心血管疾病,降低亚铁离子的浓度可以预防氧化损伤^[21]。邢路娟等^[22]对宣威火腿的研究表明,质量浓度为1.0~5.0 mg · mL^-1之间时,宣威火腿粗肽液的Fe²⁺螯合率均在70%以上,变化幅度较小。本试验中,两种工艺金华火腿粗肽液Fe²⁺螯合率在同浓度范围内,均在87%以上,且显著高于GSH,说明金华火腿粗肽液具有极强的金属离子螯合能力。这可能与粗肽液中含有大量的酸性氨基酸和抗氧化性氨基酸有关,如含组氨酸肽,就可以通过螯合过渡金属离子起到钝化其氧化作用,从而增强螯合作用^[23]。

超氧阴离子在生物体内可以长时间攻击靶向目标,破坏细胞DNA,损伤机体功能^[24]。本研究表明,2种工艺方法提取得到的金华火腿粗肽液都具有较强的超氧阴离子清除能力。而新工艺金华火腿粗肽液清除超氧阴离子自由基的能力却随浓度增加略有下降,可能是新工艺火腿在加工期间产生了其他物质减弱了其清除超氧阴离子自由基的作用,或者是一些氨基酸片段的存在具有一定的拮抗作用。传统工艺粗肽液的超氧阴离子自由基清除能力显著高于新工艺,可能是其粗肽液中含有的含谷氨酸肽的片段协同抗氧化性的效果强于新工艺粗肽液^[25]。

胡亚亚等^[26]对金华火腿的研究表明,经磷酸盐法提取的传统工艺金华火腿粗肽液的还原能力较低,显著低于GSH,本文研究结果与之一致。金华火腿两种生产工艺粗肽液的还原能力与抗氧化能力都显著低于GSH,2种工艺粗肽液的还原能力与总抗氧化能力在质量浓度2.0和3.0 mg · mL^-1时没有显著差异,在质量浓度大于4.0 mg · mL^-1时,新工艺粗肽液的总抗氧化能力却表现出显著高于传统工艺的效果,可能是在较高浓度时,新工艺粗肽液中某些短肽之间的相互作用具有更高的抗氧化能力。此外,金华火腿粗多肽的抗氧化活性还与其中氨基酸片段的排列顺序有联系。Zhu等^[27]研究表明,从传统金华火腿中提取的天然粗肽液具有较好的抗氧化能力,通过层析柱及反向液相色谱等方法,得到了氨基酸片段如甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸,该片段具有较好的清除自由基的作用。

总之,本试验通过磷酸盐溶液浸提得到传统工艺与新工艺金华火腿的抗氧化肽,经过测定其抗氧化活性可知,新工艺抗氧化肽清除DPPH自由基及总抗氧化能力优于传统工艺抗氧化肽,而传统工艺抗氧化肽对亚铁离子的螯合能力及清除超氧阴离子的能力强于新工艺,而两者还原力相当。然而,目前对新工艺金华火腿粗多肽所含氨基酸片段没有深入的研究,关于其具体的作用机制等有待进一步研究。