兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)是无囊膜的单股正链RNA病毒^{[1, 2]},病毒吸附于消化道和呼吸道的上皮细胞上,能够在成年兔的肝脏、脾脏、肺脏等器官中引起严重的病变损伤,使家兔死亡率在90%以上^{[1, 3]}。

研究报道^[4]VP60蛋白主要分为3个区域,即NTA(N端1~65aa)、S区(66~229aa)和P区(238~579aa),此外,在S和P区连接处存在一个短的铰链区(230~237aa)。RHDV VP60的P区主要由P1亚区(238~286aa、450~466aa、484~579aa)和P2亚区(287~449aa、467~483aa)组成^[4]。其中,P2区位于RHDV衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点^{[5, 6]}。研究发现,病毒感染宿主后首先与呼吸道和消化道上皮细胞上的组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)结合,启动病毒复制周期中的入胞环节,RHDV与HBGA的结合对病毒的感染至关重要^[7]。

Wang等^[4]通过冷冻电子显微镜和晶体学等方法解析了RHDV VP60的结构,推测其由5个loop区及凹陷结构所形成的区域C1、C2、C3参与病毒与受体HBGA的结合,包含L1(301~310aa)、L2(346~352aa)、L3(361~369aa)、L4(384~388aa)和L5(411~417aa)。笔者前期研究发现loop1具有与HBGA结合的活性,为进一步验证VP60蛋白其他loop区在RHDV病毒样颗粒(VLP)中的作用,本试验选取loop区411~417aa(L5)进行替换突变,利用柔性氨基酸序列替换RHDV VP60的411~417aa,构建VP60嵌合体,进一步分析该区域的突变对RHDV VLP的形成、血凝特性以及与HBGA受体结合特性的影响。

重组病毒rAc-VP60,质粒pFastBac 1-VP60和pFastBac 1^[8],E.coli DH10Bac和Sf9细胞均由江苏省农业科学院草食动物疫病防控研究室保存。DNA marker(DL2000)、限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、T₄ DNA连接酶、凝胶回收纯化试剂盒等购自TaKaRa公司;Grace′s细胞培养液、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司;生物素化的H(type-2)-PAA-biotin多糖购自GlycoTech公司,SuperBlock Buffer预处理过的高结合力亲和素板购自Thermo公司。其他试剂均为国产分析纯级。小鼠抗VP60单抗A3C为本实验室制备保存^{[9, 10]},病毒样颗粒的电镜观察在南京军区总院的H-7650型透射电镜上操作完成。

利用柔性氨基酸序列GSGGSGG等量替换RHDV VP60蛋白的411~417aa,构建VP60嵌合蛋白,命名为P411-417。

根据GenBank数据库RHDV皖阜株基因序列(GenBank accession No:FJ794180.1),用Primer Premier 5.0软件设计引物,并送上海英骏生物科技有限公司合成。引物序列如下:

表 1 扩增目的基因用引物序列 Table 1 Primers used in this study

引物名称 Primers name	序列 Sequences	PCR扩增条件 PCR amplified condition
VP60-F VP60-R 417-F 411-R	5′-TTTGAATTCATGGAGGGCAAAGCCCGCAC-3′ 5′-GCCAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCC-3′ 5′-CTGTTTGTGATGGCCTCGGG-3′ 5′-GCCGGTTACCACGGCATAAA-3′	94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,68 ℃ 2 min, 30个循环;68 ℃ 5 min
注: 下划线标出的分别是EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位点;阴影标出的是柔性氨基酸序列GSGGSGG对应的核苷酸序列。 Note: The restrict enzyme sites EcoRⅠand HindⅢ were underlined;The shadow is the nucleotide sequence encoding the flexible amino acid sequence of GSGGSGG.

表选项

利用SOE法对VP 60-411-417基因进行扩增,具体步骤如图 1。首先利用引物VP60-F和411-R扩增(PCR1)获得F 1基因,同时利用引物417-F和VP60-R扩增(PCR2)获得F 2基因,F1和F2所编码的氨基酸片段分别为1~417aa和411~579aa,扩增产物F 1和F2经10 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳鉴定后,用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化,并将其按适当的比例稀释后作为模板,利用引物VP60-F和VP60-R扩增(PCR3)目的基因VP 60-411-417,经10 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收。

	图 1 目的基因VP 60-411-417 的扩增示意图 Fig. 1 The schematic diagram of amplification of VP 60-411-417
图选项

用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切供体质粒pFastBac1和VP 60-411-417,回收目的片段,用T₄ DNA连接酶4 ℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆,并用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定,筛选阳性克隆并送上海英骏生物科技有限公司测序,最终获得重组转移质粒pFastBac1-VP 60-411-417。

将重组转移质粒pFastBac1-VP 60-411-417转化至感受态大肠杆菌DH10 Bac中,经庆大霉素、卡那霉素和四环素以及蓝白斑筛选,挑取白色菌落,提取重组穿梭质粒,使用M13/pUC通用引物,鉴定重组穿梭质粒,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。将获得的阳性重组穿梭质粒命名为Bacmid-VP 60-411-417。

应用Lipofectamin^TM 2000脂质体转染试剂将Bacmid-VP 60-411-417转染入Sf9单层细胞,转染后每12 h观察1次,待细胞出现明显病变后收集上清液,即为第1代病毒液。将获得的重组杆状病毒命名为rAc-VP 60-411-417,无菌分装重组杆状病毒原液,4 ℃保存备用。反转录PCR鉴定重组杆状病毒,提取病变Sf9细胞中重组杆状病毒DNA,作为反转录的模板,以VP 60上、下游引物VP60-F、VP60-R为引物,进行重组杆状病毒的反转录PCR鉴定。反应结束后产物经10 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳鉴定。

Sf9细胞接种24孔细胞培养板,培养过夜,将rAc-VP 60-411-417 、rAc-VP 60 ^[8]和Ac-WT(野生型杆状病毒)分别接种于24孔板中,27 ℃孵育36 h,用间接免疫荧光法检测嵌合蛋白的表达。具体操作如下:吸弃细胞上清液,于37 ℃温箱中干燥10 min;加入-20 ℃乙醇,4 ℃条件下固定1 h;加入1 ∶ 300稀释的单抗A3C,37 ℃温箱中孵育1 h;加入1 ∶ 200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG二抗,37 ℃温箱中孵育1 h。每步结束后均用PBS(pH7.4)洗涤5次,避光保存;同时设置正常Sf9细胞作为空白对照,荧光显微镜下观察。

将重组杆状病毒以1%的体积比感染Sf9细胞,在27 ℃下于细胞培养箱中培养4~5 d后收集病变细胞,1 000 r · min^-1离心8 min后分离细胞和上清液,PBS(pH7.4)重悬细胞洗涤3次后溶于PBS(pH7.4)中,反复冻融3次,11 000 r · min^-1离心15 min,弃掉细胞碎片沉淀,上清液即为重组杆状病毒表达的嵌合蛋白,命名为P411-417。

将上述获得的嵌合蛋白以120 g · L^-1的分离胶进行SDS-PAGE电泳,随后将其转印至硝酸纤维素膜上,5%脱脂乳封闭过夜,以1 ∶ 300倍稀释的VP60单抗A3C为一抗,1 ∶ 5 000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗,最终用ECL显色剂显色。

取适量的嵌合蛋白样品滴于载样铜网上,吸附作用2 min,2%的磷钨酸染液滴于铜网上,固定2 min。室温干燥后使用H-7650型透射电镜观察嵌合蛋白VLP的形成。

将重组病毒接种Sf9细胞,分别收获重组VP60蛋白以及嵌合蛋白细胞培养物,反复冻融3次后,5 000 g离心15 min去除细胞碎片,再次10 000 g离心30 min去除大的蛋白复合物和杆状病毒粒子,上清液中的VLP再次100 000 g离心2.5 h进行浓缩,4 ℃ PBS重悬沉淀,进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化,将样品铺于0.1~0.5 g · mL^-1蔗糖上,100 000 g 4 ℃离心2 h,吸取分界面的样品,再次100 000 g 4 ℃离心2 h除蔗糖,沉淀用PBS重悬,进行SDS-PAGE鉴定。

将纯化后重组VP60蛋白和P411-417,以及野生型杆状病毒细胞培养物(WT)作为阴性对照,进行血凝试验。具体步骤:在50孔U型板上,A、B和C行的1~10孔加入PBS(pH6.5),每孔50 μL;在A、B和C行的第1孔分别加入50 μL VP60、P411-417以及WT,倍比稀释至第9孔,弃50 μL;第10孔为阴性对照;每孔加入50 μL 1%人O型红细胞悬液,4 ℃作用45 min后,观察并记录血凝结果。

利用BAC蛋白定量试剂盒测定纯化后重组VP60蛋白和P411-417的浓度,每个蛋白样品分别按终质量浓度10、5、2.5和1.25 μg · mL^-1稀释。重组VP60蛋白和P411-417与HBGA结合试验方法参照Ruvoen-Clouet等^[11]的研究报道,具体步骤如下:用2.5 μg · mL^-1生物素化的H(type-2)-PAA-biotin多糖包被封闭缓冲液预处理过的高结合力亲和素板,每孔100 μL,22 ℃作用2 h;将上述处理后不同稀释度的样品分别加入酶标板中,每孔100 μL,各样品设置3个重复孔,37 ℃孵育1.5 h;加入单克隆抗体A3C(1 ∶ 1 000),每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,加HRP标记山羊抗小鼠IgG(1 ∶ 5 000),每孔100 μL,37 ℃孵育1 h;加TMB显色液,每孔100 μL,避光8~15 min,显色。每步结束后均用PBST洗涤5次。最后,每孔加入50 μL 2 mol · L^-1 H₂SO₄终止反应,测定D₄₅₀值。重组VP60蛋白作为阳性对照,设置PBS(pH7.4)和Ac-WT接种的Sf9细胞培养物(WT)作为阴性对照。

PCR1和PCR2分别扩增获得目的基因F 1和F2,预期大小分别为1 230 bp和510 bp,PCR3扩增获得VP 60-411-417,大小约为1 740 bp。琼脂糖凝胶电泳结果(图 2)显示,PCR1、PCR2和PCR3扩增获得的基因均与预期大小一致,目的基因VP 60-411-417扩增成功。

	图 2 PCR1、PCR2和PCR3产物鉴定 Fig. 2 The results of PCR1,PCR2 and PCR3 M.DNA marker(DL2000);1. F 1 ;2. F 2 ;3. VP 60-411-417
图选项

利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切重组转移质粒pFastBac1-VP 60-411-417,获得2个大小不同的片段,其4 800 bp片段与转移载体pFastBac 1的大小一致,其1 740 bp片段与VP 60-411-417的大小一致(图 3)。测序结果显示,目的基因序列与VP60模板序列同源性100%。此结果表明,pFastBac1-VP 60-411-417构建成功。随后利用M13/pUC通用上、下游引物PCR鉴定重组穿梭质粒Bacmid-VP 60-411-417,结果为阳性,表明目的基因已整合到穿梭载体Bacmid中(图略)。

	图 3 重组转移载体的酶切鉴定 Fig. 3 Identification by restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid M. DNA marker(DL15000);1. pFastBac1-VP 60-411-417
图选项

以Lipofectamin 2000为共转染试剂,将Bacmid-VP 60-411-417质粒转染Sf9细胞,4~5 d细胞发生明显病变,与正常生长的Sf9细胞相比,病变细胞变大变圆。

使用柱式动物RNAout试剂盒提取感染rAc-VP 60-411-417 、Ac-WT(野生型杆状病毒)以及正常的Sf9细胞的总RNA,其中野生杆状病毒感染的Sf9细胞为阴性对照,正常Sf9细胞为空白对照,以VP60-F和VP60-R为引物进行PCR鉴定,重组杆状病毒组PCR获得大小为1 740 bp左右的特异性条带(图略),表明重组杆状病毒构建成功,命名为rAc-VP 60-411-417。

rAc-VP 60-411-417 、rAc-VP 60和Ac-WT分别感染Sf9细胞,36 h后进行间接免疫荧光检测。结果表明,感染rAc-VP 60-411-417的细胞与感染rAc-VP 60的细胞均具有很强的特异性荧光,而感染Ac-WT的细胞和正常Sf9细胞无特异性荧光(图 4),说明嵌合蛋白P411-417在杆状病毒中可以有效表达。

	图 4 IFA检测嵌合蛋白的表达 Fig. 4 Identification of the chimera protein by IFA A:rAc-VP 60 感染的Sf9细胞Sf9 cells infected with rAc-VP 60 ;B:rAc-VP 60-411-417 感染的Sf9细胞Sf9 cells infected with rAc-VP 60-411-417 ;C:Ac-WT感染的Sf9细胞Sf9 cells infected with Ac-WT(WT);D:正常Sf9细胞Sf9 insect cells
图选项

SDS-PAGE和Western blot对嵌合蛋白的鉴定结果显示,在相对分子质量为60×10³左右处有特异性条带出现,表明目的蛋白得到表达,且蛋白能够与单抗A3C发生特异性的反应,说明嵌合蛋白P411-417在杆状病毒中表达成功(图 5)。

	图 5 SDS-PAGE(A)与Western blot(B)鉴定嵌合蛋白的表达 Fig. 5 SDS-PAGE and Western blot analysis of chimera protein M. 蛋白分子质量标准Marker;1. 野生杆状病毒表达的蛋白 Protein expressed by wild-type baculovirus;2. 重组VP60蛋白 Recombiant VP60 protein;3. 嵌合蛋白P411-417 Chimera protein P411-417
图选项

负染透射电镜观察重组VP60蛋白和P411-417病毒样颗粒的形成,结果可见杆状病毒表达的重组VP60蛋白和嵌合蛋白P41-417均能够形成结构完整的病毒样颗粒,大小为30~40 nm(图 6)。

	图 6 电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形态 Fig. 6 Identification of virus like particles(VLP)by electron microscopy A. 重组VP60形成的病毒样颗粒VLP of recombinant VP60 protein;B. 嵌合蛋白P411-417形成的病毒样颗粒VLP of chimera protein P411-417
图选项

重组VP60蛋白和P411-417的血凝试验结果(图 7)显示,重组VP60蛋白能够凝集人的O型红细胞,且血凝效价为2¹¹,而P411-417和野生型杆状病毒细胞培养物(WT)均不能凝集人的O型红细胞。

	图 7 重组蛋白的血凝检测试验 Fig. 7 Hemagglutination assay of recombinant proteins
图选项

重组VP60蛋白和P411-417与H2型合成生物素化HBGA多糖的结合试验结果(图 8)显示,重组VP60蛋白和P411-417均能够与合成的HBGA多糖结合,并随着蛋白浓度的升高结合反应值也升高,PBS和Ac-WT接种的Sf9细胞培养物(WT)组均不与合成的HBGA多糖结合。

	图 8 合成HBGA多糖的结合试验 Fig. 8 The chimeric protein binding to synthetic HBGA
图选项

衣壳蛋白在昆虫细胞中表达时能够自发地形成形态学和抗原学与天然病毒无差异的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)^[12],其可以与病毒敏感细胞上的受体结合,模拟病毒感染过程,诱导机体产生中和抗体及有效的细胞免疫应答。因此,VP60 VLP可用作兔出血症病毒免疫学、结构功能学和致病机制的研究模型。

蛋白融合表达时常用低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽作为接头(linker),尽量避免对原始蛋白构象的影响,保证蛋白自身的天然构象。甘氨酸的分子结构简单,对其他多肽结构的影响小,此外,适当增加表达蛋白中丝氨酸的比例,有助于增加重组蛋白的可溶性,故本研究中选择富含甘氨酸和丝氨酸的linker来替换VP60蛋白的loop区411~417位氨基酸,以期在保证RHDV VLP天然构象的基础上,研究该loop区对RHDV结构和功能的影响。

人红细胞表面携带有A、B和H2型的HBGA,合成多糖试验表明这些血型抗原是G1-G6型RHDV毒株的配体^[7]。另外,监测和流行病学调查结果显示,兔HBGA H2型抗原与病毒的抵抗力和易感性密切相关^[13]。本实验室分离并保存的皖阜株RHDV,属于G6型(RHDVa型)^[14],具有血凝性,能够与A、B和H2型的HBGA结合,因此本研究选用H2型的HBGA合成多糖进行结合试验。

组织血型抗原(HBGA)目前已被鉴定为多种病毒的受体,有关病毒与受体的互作研究已有报道,关于杆状病毒属另一个成员——诺如病毒(Norovirus,NV)及其与HBGA受体结合域的研究相对成熟,研究发现NV病毒衣壳蛋白的P区是病毒与HBGA受体结合的关键区域,P区羧基端存在一个高度保守的精氨酸簇,参与受体结合过程^{[15, 16, 17, 18]}。Hu等^[19]通过糖矩阵筛选人轮状病毒的结合物时发现该病毒与HBGA结合,将HBGA表达于CHO细胞表面,成功使人轮状病毒感染本不敏感的CHO细胞株,证明HBGA是人轮状病毒的感染受体,并通过结晶成像技术鉴定出与HBGA结合的人轮状病毒VP8蛋白中的结合位点,阐明了病毒与HBGA受体结合的分子机制。

研究学者发现RHDV能够凝集人的红细胞依赖于红细胞表面HBGA的存在^[11]。Rademacher等^[20]通过核磁共振试验发现HBGA的L-岩藻糖是VP60 VLP最小的识别结构。在此基础上,Guillon等^[13]研究发现,欧洲穴兔中H2型HBGA表达及调控该抗原表达的α-1,2岩藻糖基转移酶,与欧洲穴兔对RHDV的敏感性直接相关。以上研究RHDV与HBGA的结合仅在HBGA分子上,对参与受体结合的RHDV上配体的位点知之甚少。最新研究利用晶体结构分析发现RHDVb与HBGA的结合位点位于472~479位氨基酸^[21],然而RHDVa与RHDVb序列同源性仅有84%,且VP60 P区结构明显不同,因此对RHDVa毒株与HBGA受体相互作用的研究十分必要,我们前期利用截短表达VP60蛋白的方法,发现320~350位氨基酸(loop1)能够与HBGA受体结合,是RHDV关键的受体结合区域^[22],该结果与Wang等^[4]研究并推测的受体结合域一致。为进一步验证其他loop区是否参与HBGA受体的结合,本研究选择loop5区进行基因突变,构建VP60 VLP突变体,分析嵌合蛋白的血凝性以及与HBGA受体的结合,进一步揭示两者之间的相关性,此外,其余loop区的突变验证将在后续研究中开展。本研究结果显示,等量替换411~417位氨基酸后,嵌合蛋白仍然能够形成完整清晰的病毒样粒子,仍能够与合成的HBGA多糖结合,但其血凝特性消失。这表明loop5区并非病毒与HBGA受体结合的关键区域,但可能是病毒关键的血凝位点。与RHDV同属于杯状病毒科的诺如病毒,具有类似的特点,该病毒不具有血凝特性,但是能够通过多种不同的机制结合不同型的HBGA,从而实现对机体的侵染^[23]。虽然RHDV的HBGA受体的发现是基于病毒的血凝特性,但是本研究以及对其他杆状病毒的研究显示,病毒的血凝性以及HBGA受体结合活性之间无直接的相关性。

病毒黏附受体并侵入宿主细胞是病毒感染的先决条件,本研究通过对RHDV VP60中关键loop区的突变,研究其对病毒的结构和功能的影响,将为RHDV感染机制及RHD的有效防控提供依据。