梨是我国的重要经济作物,是我国的三大水果之一。作为世界上最大的梨出口国,我国梨产业的发展关系着世界梨产业的发展^[1]。梨腐烂病是梨树上最主要的枝干病害之一,又名臭皮病,主要危害梨树的主干和主、侧枝等,其症状主要表现为溃疡型和枝枯型两种。该病在我国发生十分普遍,我国主要梨产区每年均有不同程度的发生,部分重灾区甚至出现了死树和毁园现象^[2],这严重影响了我国梨产业的发展,因此对该病致病机制和预防措施等的深入研究十分必要^[3]。

梨树腐烂病是一种真菌病害,其病原菌属于苹果黑腐皮壳梨变种(Valsa mali Miyabe et Yamada var.pyri)。长久以来,国内外学者对梨腐烂病菌的命名一直存在争议。目前,虽然有Valsa ceratosperma、Valsa ambiens、Valsa mali var.pyri^{[4, 5]}几个名称在同时使用,但近期研究发现梨腐烂病菌主要为Valsa mali var.pyri^{[6, 7]}。对病原真菌进行鉴别时,一般采用形态学结合分子生物学的方法^[8],这样较为准确。测定病菌致病力时,可选用菌丝块或分生孢子悬浮液,采用烫伤、割伤、打孔、针刺等有伤处理接种于离体枝条、嫩梢、叶片及果实,在合适的温、湿度等环境条件下即可发病。针刺法接种嫩梢及枝条打孔法是较为简便的方法,但是梨果接种的稳定性更高^{[9, 10, 11, 12, 13]}。

目前,学者普遍认为梨腐烂病菌的不同菌株存在致病力分化现象,但是该现象与病原菌的培养性状及地理来源是否相关则存在争议^[14]。本文通过大量采集我国主要梨产区的梨腐烂病样品,对其进行分离并获得梨腐烂病菌,观察病菌的培养性状并测定其致病力,从而研究菌株的培养性状及地域差异对腐烂病的影响,研究结果将会为梨腐烂病的防治提供一些新的参考。

根据梨腐烂病田间症状特征,分别从我国13个省、市、自治区(黑龙江、河南、新疆、甘肃、吉林、河北、山西、山东、辽宁、江苏、安徽、陕西、北京)共收集梨腐烂病样品600余份,其中一部分由本实验室人员采集,另一部分为国家梨产业技术体系各综合试验站提供。

‘砀山梨’1~2年生离体枝条,‘库尔勒香梨’果实。

马铃薯蔗糖培养基(PDA):去皮马铃薯200 g,切成小块,加琼脂20 g,1 000 mL水煮沸30 min,4层纱布过滤,滤液中加入20 g蔗糖,补足1 000 mL水。

采用ITS通用引物,上、下游引物序列如下:ITS1,5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4,5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

病原菌的分离采用组织分离法。灭菌手术刀于样品病健交界处切取小块组织,70%乙醇表面消毒后,无菌水冲洗干净,晾干后将组织块置于PDA平板上,28 ℃黑暗培养,待样品组织周围长出真菌菌丝后,从边缘处取少量疑似梨腐烂病菌菌丝移植于新的PDA平板上,28 ℃黑暗培养至形成完整菌落。

首先以形态学方法初步鉴定梨腐烂病菌。将纯化后的各菌株活化培养至形成完整菌落后,观察菌丝形态、颜色及分生孢子器等的形态特征,同时切取直径8 mm菌丝块,采用打孔法接种于1~2年生梨树离体枝条,将枝条插于湿润沙槽中28 ℃、黑暗培养2周,观察是否产生黄色孢子角,同时镜检观察孢子形态。其次进行分子生物学鉴定。CTAB法提取梨腐烂病菌基因组DNA后,采用通用引物ITS1、ITS4 通过PCR扩增其ITS序列。PCR扩增产物经电泳检测后,送至上海英骏生物技术有限公司测序,将测序结果于NCBI数据库中进行BLAST比对。

将分离鉴定所得的梨腐烂病菌置于PDA平板上,28 ℃黑暗培养至形成完整菌落,观察并记录菌落特征,包括菌丝形态、菌落颜色及子座等。

离体枝条接种时,首先选取粗细相同的枝条,表面消毒后截成15 cm长小段,上端用石蜡封口后,用直径为8 mm的打孔器在树枝上打孔。切取8 mm新鲜梨腐烂病菌菌丝块,并将长有菌丝的一面紧贴离体枝条伤口部位,以接种PDA培养基作为空白对照,用封口膜将伤口部位包扎好后,将枝条插入灭菌的湿沙盘中,置于28 ℃培养箱中12 h光照、12 h黑暗培养,5 d左右记录病斑长度,每个病菌重复3次。

梨果接种时,选取大小相等表面无伤痕的‘库尔勒香梨’,表面消毒后用直径8 mm打孔器在梨果表面打孔后,接种直径8 mm新鲜梨腐烂病菌菌丝块,将长有菌丝的一面紧贴伤口部位,同时以接种PDA培养基作为空白对照。将处理后的梨果置于铺有灭菌湿纱布的灭菌烧杯中,上部用保鲜膜封口,28 ℃恒温条件下12 h光照、12 h黑暗培养,6 d后记录病斑长度,每个病菌重复3次。本试验中,病斑长度≥6 cm时,为强致病力,6 cm>病斑长度>4 cm时,为中等致病力,病斑长度≤4 cm时,为弱致病力。

本试验共采集样品600余份,根据形态特征初步鉴定梨腐烂病菌465株,均能在PDA平板上或侵染梨树离体枝条后形成黄色孢子角,同时镜检观察分生孢子呈香蕉形。将这些菌株进行rDNA-ITS测序并将测得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,发现与梨腐烂病菌(Valsa mali var.pyri)具有极高的同源性,ITS序列都在540 bp左右,同源性达到99%以上,因此，结合形态学将这些病原菌鉴定为梨腐烂病菌。

将各株梨腐烂病菌置于PDA平板上,28 ℃黑暗培养5 d后,菌株均能长满整个平板,观察发现各菌株的菌丝基本都呈羽状分布,排列紧密,呈乳白色,能分泌胶状物质,气生性较弱,菌丝主要紧贴培养基匍匐生长。由于各菌株色素的分泌使得培养基的颜色稍有不同(图 1)。因此,培养前期可粗略将其分为3种类型:Ⅰ型(白色)、Ⅱ型(黄绿色)和Ⅲ型(黄色)。

	图 1 梨腐烂病菌菌株在PDA平板上培养5 d的菌落形态 Fig. 1 Colony morphology of pathogen strains from pear Valsa canker cultured on PDA plate for 5 days
图选项

将菌株继续培养至15 d时,由于色素的积累,菌落的颜色更加多样化。如图 2所示,培养后期可将其分为5种类型:A型(白色)、B型(灰色)、C型(黄色)、D型(黄绿色)、E型(淡轮纹状)。此外,菌株在PDA平板上也开始产生不同类型的子座。如图 2所示,E型菌株的子座不太明显,而其他4种类型的菌株均能产生多样性的子座,包括子座的大小、颜色、形状、数量、在培养基上的分布情况以及完全突起或是埋生于培养基等均存在较大差异。

	图 2 梨腐烂病菌菌株在PDA平板上培养15 d的菌落形态 Fig. 2 Colony morphology of pathogen strains from pear Valsa canker cultured on PDA plate for 15 days
图选项

对不同地区分离到的各菌株类型作数量统计(表 1)。结果显示:A型和B型菌株较易分离获得,且数量较多,说明这2种类型的菌株为常见菌株。而C型和E型菌株则较难分离获得,且形态也与常见的梨腐烂病菌有所不同,属于较为稀有的菌株。江苏及新疆地区均能分离获得一定数量的各类菌株,表明这2个地区的菌株类型较为丰富。

梨腐烂病菌的致病力测定通常以离体梨树枝条或果实作为接种材料。为了得到可靠的测定结果,首先对离体梨树枝条及果实这2类接种材料作比较。随机选取若干菌株分别接种于梨树离体枝条及果实上,培养5 d后观察发病情况。如图 3所示,以梨树离体枝条为接种材料时,同一梨腐烂病菌菌株接种的3个重复之间,病斑大小差异较大,发病率不稳定,影响了试验的准确率;而以果实作为接种材料时,同一梨腐烂病菌菌株接种的3个重复之间,病斑大小基本一致,结果较为稳定。基于以上结果,同时考虑到不同季节获取长势、树龄一致的枝条较为困难以及离体枝条的存放问题,本试验主要以梨果实进行接种,以进一步测定不同梨腐烂病菌分离菌株的致病力。

图 3 江苏-215和吉林-429菌株分别接种‘库尔勒香梨’果实及‘砀山梨’枝条5 d时的病斑形态 Fig. 3 The lesion feature on fruits of‘Korla Pear’and on the branches of‘Dangshan Pear’infected by the strains of Jiangsu-215 and Jilin-429 at 5 days past inoculation A1、A2. 江苏-215菌株接种于‘库尔勒香梨’果实及‘砀山梨’枝条;B1、B2. 吉林-429接种于‘库尔勒香梨’果实及‘砀山梨’枝条。 A1,A2. The fruits of the‘Korla Pear’and the branches of‘Dangshan Pear’infected by the strain of Jiangsu-215;B1,B2. The fruits of the‘Korla Pear’and the branches of‘Dangshan Pear’infected by the strain of Jilin-429.

图选项

从所有梨腐烂病菌分离菌株中,随机选取128株进行致病力测定,其中强致病力菌株占29%,中等致病力菌株占64%,弱致病力菌株占7%,因此就整体而言,梨腐烂病菌中,中等致病力菌株分布最多。不同地理来源的梨腐烂病菌菌株在侵染‘库尔勒香梨’果实后的致病力强弱分布和病斑大小情况如图 4和图 5所示,来自各地的梨腐烂病菌引起的病斑大小均不同,存在致病力分化现象,并且各省市之间梨腐烂病菌的致病力强弱的分布也有一定的差异。其中强致病力菌株分布于山西、甘肃、山东、新疆、吉林、河南、河北、黑龙江及辽宁,弱致病力菌株仅分布于新疆、河南、黑龙江、江苏、陕西及北京,而中等致病力菌株则在各个地区均有分布,尤其分离自安徽省的梨腐烂病菌,全部为中等致病力菌株,因此就地理来源而言,中等致病力菌株的分布范围最为广泛,强致病力菌株次之,弱致病力菌株的分布范围最小。此外,由图 4可知,山西、甘肃、山东及新疆这4个省的强致病力菌株所占比例均超过50%,因此在今后的梨腐烂病的防控过程中,这4个省份应该重点防治和监控。

	图 4 各省市梨腐烂病菌致病力类型的分布 Fig. 4 The distribution of pathogenicity of pear Valsa canker strains
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	图 5 各地理来源梨腐烂病菌在‘库尔勒香梨’果实上病斑大小分布 Fig. 5 The distribution of lesion size on fruits of‘Korla Pear’infected by pear Valsa canker strains from different origins
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不同培养性状的梨腐烂病菌菌株在侵染‘库尔勒香梨’果实后的致病力强弱分布及病斑大小情况如图 6、7所示,5种培养性状的梨腐烂病菌均存在致病力分化现象,并且各培养性状间梨腐烂病菌的分化情况也存在差异。其中A型、C型及E型这3种培养性状的梨腐烂病菌均包括强、中、弱3种致病力类型菌株,B型培养性状和D型培养性状的梨腐烂病菌只有强、中等2种致病力类型的菌株,即5种培养性状的梨腐烂病菌均包括强致病力和中等致病力的菌株。此外,由图 6可知:5种培养性状的梨腐烂病菌中,中等致病力的菌株所占比例均较高,即中等致病力菌株在各种培养性状的梨腐烂病菌中分布最多,同时B型培养性状的梨腐烂病菌中强致病力菌株所占比例最多,约占 40%,因此在防控梨腐烂病的过程中,应密切注意B型培养性状的灰色菌株。

	图 6 各培养性状梨腐烂病菌致病力类型的分布 Fig. 6 The distribution of pathogenicity type of pear Valsa canker strains of different colony morphologies
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	图 7 各培养性状梨腐烂病菌在‘库尔勒香梨’果实上病斑大小的分布 Fig. 7 The distribution of lesion size on fruits of‘Korla Pear’infected by pear Valsa canker strains of different colony morphologies
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笔者从我国13个省市共分离鉴定获得梨腐烂病菌465株。将这些菌株在PDA培养基上培养5 d时,发现其菌落颜色有白色、淡黄绿色及黄色3种类型。继续培养至15 d时,由于色素在培养基上的积累,根据菌落颜色及形态又可区分为白色、灰色、黄绿色、黄色及轮纹状5种类型,每种类型的菌株在培养基上均产生了多样性的子座,这些子座的大小、形状、颜色、数量、在平板上的分布特点以及着生方式均有不同,主要将其分为A型(白色)、B型(灰色)、C型(黄色)、D型(黄绿色)及E型(淡轮纹状)。

为研究菌株的地理来源及培养性状与其致病力分化之间的关系,从所获得的分离菌株中挑选出了128株进行致病力的测定。从试验结果及统计情况看,不同地理来源及不同培养性状的菌株均存在着致病力分化的情况,并且中等致病力的梨腐烂病菌的分布数量均是最多的,强致病力的腐烂病菌次之,弱致病力的梨腐烂病菌分布数量均最少,因此中等致病力的梨腐烂病菌在群体中应为优势菌种,属主要防控对象。此外,山西、甘肃、山东及新疆4个省份,以及B型培养性状的梨腐烂病菌中,强致病力菌株均占有较大比例,因此这4个省份及各省的B型灰色梨腐烂病菌应作重点预防和监测。本研究结果对于了解我国梨腐烂病菌在各地的致病力强弱分布情况有重要参考价值,有助于制订合理有效的防控梨腐烂病的措施。此外,在研究过程中还发现了几株致病力极弱或者极强的特殊菌株,后期需要将这些菌株挑选出来,对梨腐烂病菌的致病机制作进一步的研究。