DNA甲基化与植物基因的表达、基因沉默、细胞及组织分化、组蛋白乙酰化等多个生物学过程关系密切,去甲基化或者过甲基化的发生都会导致植物生长发育的形态异常^{[1, 2, 3]}。多倍体植物较之亲本呈现的外观形态的巨大性极有可能是DNA甲基化水平与模式的差异导致的。MSAP(methylation sensitive amplified polymorphism)技术是研究植物全基因组DNA甲基化水平与模式变化的有效手段,该技术操作简便、敏感度高、试验结果稳定可靠,在植物甲基化状态研究中受到越来越多的科学工作者的青睐^{[4, 5]}。前人采用MSAP技术研究不同植物不同倍性水平的DNA甲基化状态,均发现加倍前后其DNA甲基化水平与模式发生了较大改变,杨岚等^[6]发现甜叶菊二倍体与四倍体DNA甲基化水平与模式差异明显;四倍体南方泡桐与二倍体相比,总甲基化率和半甲基化率均有所提高,且40.80%的DNA位点甲基化模式发生了变化^[7];杨飞等^[8]认为菘蓝四倍体的DNA胞嘧啶甲基化水平低于二倍体。白术(Atractylodes macrocephala)是菊科多年生草本植物,其根茎为临床常用药之一^[9]。四倍体和二倍体白术外观形态差异较大,本文在AFLP研究的基础上,采用MSAP技术进一步探究两者是否存在表观遗传学方面的差异。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkiewicz等^[10]在SSR(simple sequence repeat)基础上创建的一种新型的分子标记技术,兼具AFLP、RFLP、RAPD、SSR等分子标记技术的优点,与DNA模板结合度高,能够确保试验结果的可重复性,检测区域覆盖整个DNA基因组,PCR扩增能较全面的反映植物群体的变异,较适用于多倍体育种中基因组的检测及倍性体系的评价^{[11, 12]}。前人采用ISSR技术研究了生姜^[12]、菘蓝^[13]、鸢尾^[14]、桑树^[15]等植物多倍体在分子水平上的基因组变化规律,发现二倍体植物染色体加倍前后DNA水平表现出了一定的差异。了解白术二倍体亲本及其同源四倍体的遗传背景,是选育出大量具有优良特性的多倍体白术株系的基础。本研究采用MSAP和ISSR两种分子研究方法对白术二倍体及其同源四倍体的基因组DNA进行分析,以期为白术高产优质新品种的选育提供理论依据。

于2012年11月采用当年采收的新鲜白术(Atractylodes macrocephala)种子,在南京农业大学园艺学院蔬菜系统组培室建立白术二倍体无菌体系,在此基础上,采用白术幼芽结合秋水仙素离体诱导后经根尖染色体鉴定法获得其同源四倍体株系。1个白术二倍体株系及其5个同源四倍体株系用于ISSR分析,2株生长势一致的二倍体和四倍体株系组培苗用于MSAP分析。

取白术二倍体及其同源四倍体叶片各0.5 g,DNA的提取参照马辉等^[16]和黄恒等^[17]的方法,提取产物纯化后用10 g • L^-1琼脂糖凝胶电泳,核酸测定仪检测,于-20 ℃保存备用。

为了减少试验误差,酶切与连接反应同时进行。MSAP酶切和连接体 系参照Cervera等^[18]和褚会娟等^[19]的方法,并略作调整,第1个酶切体系为400 ng样本DNA中加入0.8 μL EcoRⅠ和HpaⅡ内切酶以及2 μL 10×Buffer4(10 mmol • L^-1乙酸镁,20 mmol • L^-1Tris-acetate,50 mmol • L^-1乙酸钾,1 mmol • L^-1 dTT,pH7.9,置于25 ℃),于37 ℃保温过夜;第2个酶切反应体系为400 ng样本DNA中加入0.8 μL EcoRⅠ和MspⅠ以及2 μL 10×Buffer1(10 mmol • L^-1 MgCl₂和Tris-HCl,1 mmol • L^-1 dTT,pH7,放置于25 ℃),于37 ℃保温过夜。在酶切片段的两端加上与HpaⅡ/MspⅠ和EcoRⅠ互补的接头进行连接,连接反应体系为20 μL,试验所用引物(接头)信息见表 1。

预扩增与选择性扩增反应参考杨岚等^[6]和杨炳艳等^[20]的方法进行,选择性扩增产物在60 g • L^-1的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳,银染显色后观察。

同裂酶HpaⅡ和MspⅠ分别与EcoRⅠ组合进行双酶切,2种酶对应的扩增结果呈现出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ不同的带型(表 2),而且每个样品同时拥有2条泳道,同一位点,有条带记为“1”,无带记为“0”。

PCR反应程序参考孙靓等^[21]和苏小俊等^[22]的方法,并适当修改。反应体系为20 μL:20 ng DNA,10 μL 1 mmol • L^-1 dNTP,0.2 μL 100 mmol • L^-1引物,其余体积用ddH₂O补齐。

随机选取一个白术二倍体株系及同源四倍体株系进行引物筛选,从20条ISSR引物中筛选出5条条带清晰、试验结果稳定的ISSR引物,用于白术6个株系的扩增。

PCR扩增产物电泳时无DNA条带记为0,有条带记为1,形成的01数据矩阵采用NTSYS软件计算相似系数(DICE系数),并采用UPGMA程序进行聚类分析。

通过根尖染色体鉴定法发现白术二倍体染色体数为2n=2x=24(图 1-A),与之生长势一致的同源四倍体株系染色体数为2n=4x=48(图 1-B)。

	图 1 白术二倍体(A)及其同源四倍体(B)根尖体细胞染色体 Fig. 1 The chromosome of diploid(A)and autotetraploid(B)of root tip cells of Atractylodes macrocephala
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MSAP扩增结果见表 3。白术二倍体及其同源四倍体总扩增条带数均为373条,但二倍体总甲基化率(77.74%)和全甲基化率(61.03%)都高于四倍体,而四倍体半甲基化水平(48.79%)却高于二倍体(38.97%);白术四倍体呈单链外甲基化(141)和双链外甲基化状态(84)的条带数高于二倍体,但其双链内甲基化(93)和无甲基化状态(55)的条带数却低于二倍体。

参照王春国等^[23]和樊洪泓等^[24]的方法,将20对MSAP引物扩增的不同甲基化模式划分为4大类(A、B、C、D)和15个亚类。由表 4和图 2可知:A、B、C、D分别包含3、5、5、2个亚类,A表示非甲基化类型,即四倍体白术与二倍体相比45.04%的DNA基因位点未发生甲基化;B为去甲基化类型,即四倍体白术23.06%的基因检测位点发生了去甲基化变异;C为超甲基化类型,27.61%的白术四倍体DNA检测位点甲基化水平相对于二倍体有所提高;D为次甲基化类型,即4.29%的白术四倍体基因检测位点甲基化水平相对于二倍体有所降低,但仍存在呈甲基化状态的DNA条带。与二倍体相比,白术四倍体54.96%的DNA基因组甲基化模式发生了改变。

	图 2 MSAP部分引物扩增结果 Fig. 2 Part of the amplification results of MSAP E46 Msp40~E86 Msp44表示引物组合。E46 Msp40-E86 Msp44 indicate the combinations of primer. 2H2M和4H4M分别表示二倍体白术及其同源四倍体EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ酶切的扩增结果。 2H2M and 4H4M show amplification results of diploid and autotetraploid of A.macrocephala are digested by EcoRⅠ/HpaⅡ and EcoRⅠ/MspⅠ.
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从表 5可知:5对ISSR引物共扩增出24条清晰可见的DNA条带,有13条是多态性条带,多态性比例为52%。引物853扩增出的DNA条带最多,多态性为57.14%;引物843扩增出的条带数最少,却全是多态性条带。引物866和845扩增出的DNA多态性条带最少,多态性位于20%~25%。引物844和845的扩增图谱见图 3,白术同源四倍体与二倍体相比,ISSR引物扩增出的DNA条带数呈现不规律变化,四倍体株系DNA条带既有增加,也有丢失。

	图 3 引物844和845的ISSR扩增图谱 Fig. 3 The amplification profiles of primers 844 and 845 by ISSR CK:二倍体;1~5:白术同源四倍体的不同株系;M:Marker;A:白术四倍体增加的条带;B:白术四倍体缺失的条带 CK:The diploid;1-5:Different autotetraploid strains of A.macrocephala;M:Marker;A:The incremental loci;B:The deleted loci. The same as follows.
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白术6个株系的聚类分析结果见表 6和图 4。二倍体白术与同源四倍体株系之间的遗传相似系数在0.565~1.000之间,两者的遗传距离在0~0.080之间。在遗传相似系数为0.26时,白术二倍体株系及5个四倍体株系都聚为一大类,其中二倍体与四倍体株系1之间的遗传相似系数为1,遗传距离为0,说明两者遗传特性相似;四倍体株系2和5,3与1和二倍体在相似系数0.08处聚为一类;四倍体株系4、3、1与二倍体株系在0.119处聚为一类。

	图 4 二倍体及其同源四倍体白术的聚类分析图 Fig. 4 The dendrogram of diploid and autotetraploid of A.macrocephala CK:白术二倍体;1~5:白术同源四倍体株系 CK:Diploid;1-5:Autotetraploid strains
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本研究发现,白术四倍体与二倍体相比,其DNA总甲基化率和全甲基化率均有所降低,DNA半甲基化水平却有提高,这与杨岚等^[6]在不同倍性甜叶菊的研究中的试验结果类似。翟晓巧等^[25]在毛泡桐的研究中也发现其同源四倍体的DNA总甲基化水平低于二倍体。由此可见,植物经人工诱导加倍后,DNA甲基化水平发生了一定程度的改变,这可能是多倍体植物维持其遗传稳定性所必需的。

Guo等^[26]研究不同倍性玉米的甲基化差异后发现,玉米染色体加倍后基因的表达调控发生了改变,其多倍体基因组中有些基因的表达水平提高的同时还能抑制其他一些基因的表达;聂丽娟等^[27]在西瓜的研究中发现二倍体与四倍体甲基化水平遗传差异仅为0.02%,且未检测到两者之间碱基序列的变化。本试验中,二倍体和同源四倍体白术之间的甲基化多态性差异为54.96%,这说明二倍体白术人工诱导变异后不仅染色体数增加,而且为适应新的基因调控系统,其DNA甲基化模式会也发生相应的调整,从而使四倍体白术外观形态的巨大性、较强的抗逆性、较优的生理生化代谢等多倍体的优良特性得以稳定遗传。

本试验中,白术二倍体及其同源四倍体的主要遗传位点相同,但有些四倍体株系扩增条带数少于二倍体,有些株系扩增条带数却多于二倍体。条带数少于二倍体的四倍体株系,推测可能是亲本在人工加倍过程中发生染色体的丢失、突变等导致DNA片段的缺失;而条带数多于二倍体的四倍体株系可能是在加倍过程中在该位点发生了DNA片段的重复、插入等,继而在扩增图谱上出现了多出的DNA位点^[13]。对桑树^[15]、金鱼草^[28]、生姜^[12]等的ISSR研究也发现二倍体亲本采用秋水仙素加倍后DNA碱基序列发生了变化。选育的5个白术四倍体株系虽然都来源于二倍体亲本,但在组织培养中发现,有些四倍体株系的外观形态不同于其他株系,采用ISSR技术分析发现这些四倍体株系除主条带与二倍体一致外,每个株系存在部分多态性位点,这与段英姿^[13]的研究结果一致。白术不同四倍体株系间及与二倍体之间存在差异,说明二倍体在加倍过程中除了染色体数目加倍外,可能发生了不同程度的基因变异,从而在DNA水平上表现出了多态性。对于来源于同一亲本的不同白术四倍体株系表现出的DNA多态性及其遗传机制,相关报道较少,还需进一步研究。

本研究采用MSAP技术发现白术二倍体加倍后DNA甲基化水平及模式均发生了变化,同源四倍体白术半甲基化率高于二倍体,而总甲基化率和全甲基化率却低于二倍体,54.96%的四倍体DNA甲基化模式发生了调整,这或许是白术同源四倍体外观形态及生理性状区别于二倍体的原因之一;通过ISSR分析后发现白术同源四倍体株系与二倍体相比,DNA条带既有增加,也有丢失,两者遗传距离及遗传相似系数差异较大。由此可见,白术二倍体人工加倍后遗传机制发生了变化。本研究为进一步探究白术同源四倍体基因表达调控与其外观形态的巨大性、逆境胁迫的增强性、活性成分积累等的相关性奠定了试验基础。