自然界中,洪水、冬季冰封、过多的降雨、灌溉不均匀以及土壤紧实等都极易使植株根际供氧不足,造成低氧胁迫,影响作物生长^[1]。随着科学技术的发展,无土栽培技术已成为解决设施生产土壤污染、盐渍化、连作障碍等日益严重问题的有效手段。但是,生产实践表明,水培的营养液溶氧浓度低、耗氧快,基质栽培管理不当形成“根垫”时会使根系供氧状况恶化,尤其是根际温度较高时,根系耗氧量增大,易形成明显的根际低氧逆境,而引发种种生育障碍,影响作物正常的生长发育,已成为无土栽培技术大规模用于设施生产的限制性因子^[2]。

植物通过促进糖酵解、启动无氧呼吸系统等维持低氧浓度下的根系能量代谢^[3],同时,也能够通过形态适应促进地上部氧气向根系的运输,从而改善根系的氧气供应状况,缓解胁迫伤害^[4]。目前对黄瓜低氧胁迫的研究主要集中在与呼吸、碳水化合物代谢、抗氧化系统等有关的方面^{[5, 6, 7]},对其在低氧胁迫下的形态结构适应性变化了解较少。因此,本文以低氧敏感黄瓜品种为材料,研究黄瓜幼苗在低氧胁迫条件下的形态及解剖结构变化、乙烯合成及与细胞壁降解有关酶活性的变化,以期阐明植株低氧形态适应的生理机制。

试验于2014年4月在南京农业大学温室内进行。以实验室前期筛选出的耐低氧性较弱的黄瓜(Cucumis sativus L.)品种‘中农6号’为材料。选取整齐饱满的种子,经过浸种、催芽后,选取发芽一致的种子播于装有石英砂的塑料盘中,于昼/夜温度(25~27) ℃/(15~18) ℃的温室内育苗,子叶展平后每天浇灌1次1/4 Hoagland 营养液,待幼苗长出2叶1心时,选取整齐一致的植株定植于装有1/2 Hoagland营养液的水培箱中继续培育,3叶1心时进行低氧处理。

试验设2个处理:对照(CK),用气泵正常通入空气,维持营养液溶氧浓度(DO)为8.0 mg • L^-1左右;低氧处理(H)则向营养液中通入氮气,用溶氧浓度调节仪(QUANTUM,美国)控制营养液DO值为0.9~1.1 mg • L^-1。试验设3次重复。

取处理0、7 d的植株称取鲜质量,105 ℃杀青15 min,75 ℃烘干至恒质量后称量。植株相对生长速率(RGR)=(lnW_t7-lnW_t0)/7。其中:W_t7和W_t0分别为低氧胁迫7和0 d的整株干质量。分别选取植株子叶上第3片展开真叶及根系,使用叶面积根系扫描分析系统(Regent,加拿大)对其进行扫描分析,记录叶片及根系生长参数。

取低氧处理7 d的黄瓜植株,不定根发生及下胚轴横切面采用解剖显微镜(Olympus,日本)观察并照相。叶片及通气组织观察:叶片避开叶脉切取3 mm×3 mm小块,根系取主根,切取距根尖0.5、2、6 cm的片段,下胚轴则取子叶下2 cm左右的段。所有材料用FAA固定,按赵惠玲等^[8]的方法包埋。用石蜡切片机(LeiCaRM2145,德国)将包埋于蜡块中的材料进行切片,叶切片厚度为5 μm,根系切片厚度为7 μm,下胚轴切片厚度为14 μm,用固绿或苏木精复染,在光学显微镜(Olympus,日本)下观察并照相。

取处理0、2、3、5、7 d的植株,将子叶上第3片真叶、根系及下胚轴分别称质量,转移至试管中,封口,室温下孵育2 h后用注射器抽取1 mL气体进行测量。气相色谱为Shimadzu GC-9A(日本),柱温50 ℃,进样口温度200 ℃,检测器温度200 ℃,尾吹50 mL,载气为氮气,流速40 mL• min^-1。

分别取处理0、1、2、4、7 d的植株子叶上第3片真叶,洗净擦干后称取0.5 g用液氮速冻,随后放入超低温冰箱保存。ACS活性测定参照柯德森等^[9]的方法并略有改动。冻存材料经液氮研磨后加入1.2 mol • L^-1磷酸钾缓冲液(pH8.0)(含0.5 μmmol • L^-1磷酸吡哆醛、4 mmol • L^-1二硫苏糖醇),匀浆于15 000 g、4 ℃离心20 min,取上清液用于酶活性测定。1 mL反应液中含100 mmol • L^-1磷酸缓冲液(pH8.0)、400 μmol • L^-1 S-腺苷甲硫氨酸、0.5 μmol • L^-1磷酸吡哆醛,加入0.5 mL酶提取液,于30 ℃孵育10 min,随后加入500 μL预冷的HgCl₂终止反应。反应形成的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)按照Lizada等^[10]的方法转化为乙烯,以每小时产生1 nmol乙烯为一个酶活性单位(U),单位以U• g^-1表示。

参照Andrews等^[11]的方法并略有改动:取0.2 g根系或下胚轴加入1 mL 40 mmol • L^-1(pH5.5)的醋酸钠缓冲液,内含100 mmol • L^-1 NaCl、2%(体积分数)巯基乙醇和50 g • L^-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30),冰浴研磨,25 000 g冷冻(2 ℃)离心20 min,上清液用于细胞壁降解酶活性测定。多聚半乳糖醛酸酶(PG)以1%多聚半乳糖醛酸为底物,测定生成的还原糖数量,以每小时生成1 mg D-半乳糖醛酸的酶用量为1个酶活性单位(U),单位以U• μg^-1表示。纤维素酶(cellulase)底物为41.7 mmol • L^-1羧甲基纤维素,以每小时生成1 mg葡萄糖的酶用量为1个酶活性单位(U),单位以U• μg^-1表示。果胶酯酶(PME)测定参照Solecka^[12]的方法略有改动:将2 μg蛋白样品加入4 mL底物溶液(33.3 mmol • L^-1果胶,0.2 mol • L^-1 NaCl,74.3 μmol • L^-1甲基红,pH6.8),37 ℃反应1 h,测定D₅₂₅。4 mL底物溶液中加入0.01 mol • L^-1 HCl,测定D₅₂₅并作标准曲线,以每小时生成1 μmol H⁺为1个酶活性单位(U),单位以U• μg^-1表示。

蛋白浓度按照Bradford^[13]的方法测定,用牛血清蛋白(Sigma,德国)作标准曲线。

利用SPSS PASW Statistics 17.0对数据进行统计分析,采用t测验法进行差异显著性检验。

由表 1可以看出:低氧胁迫7 d后黄瓜幼苗生长受到显著抑制,植株干质量较对照下降41.7%;第3片真叶的叶面积、叶宽均显著降低;植株相对生长速率较通气对照下降32.8%。

由表 2可见:胁迫处理7 d后黄瓜幼苗根系干质量显著降低,幼苗根长、根尖数显著减少。

由图 1可以看出:正常通气条件下,黄瓜幼苗叶片组织结构疏松;低氧胁迫处理7 d后,幼苗叶片组织细胞结构紧密度增加,栅栏组织相对比例增加,海绵组织也较发达。

	图 1 低氧胁迫对黄瓜幼苗叶片形态结构的影响 Fig. 1 Effect of hypoxia stress on leaf morphology of cucumber seedlings a. 栅栏组织Palisade tissue;b. 海绵组织Sponge tissue
图选项

胁迫处理7 d后,幼苗下胚轴产生大量的不定根,胚轴表皮破裂出现皮孔(图 2-A);观察下胚轴横切面可发现,低氧胁迫后植株下胚轴表皮组织较通气对照明显疏松(图 2-B),皮层薄壁组织细胞之间互相分离产生大量孔隙(图 2-C)。

图 2 低氧胁迫对黄瓜幼苗下胚轴形态结构的影响 Fig. 2 Effect of hypoxia stress on hypocotyl morphology of cucumber seedlings A.低氧下下胚轴部分形成皮孔、不定根(箭头所示),茎基部肥肿;B.解剖显微镜下的下胚轴横切面,箭头显示细胞薄壁组织疏松的结构;C.光学显微镜下的下胚轴横切面,箭头显示细胞间明显的孔隙。 A. Emergence of lenticel,adventitious root(arrows indicated)and enlargement of stem-base;B. Transverse section of hypocotyls observed by stereomicroscope,arrows indicated loose parenchyma;C. Transverse section of hypocotyls observed by optical microscopy,arrows indicated obviously intercellular cavity.

图选项

由图 3可见:正常通气条件下,植株根尖部分细胞质浓密,皮层细胞排列紧密。低氧胁迫7 d后,根系表皮染色加深,根尖细胞质明显淡薄,且伸长区出现皮层细胞崩解,形成通气组织;但根系分生区和成熟区无明显的通气组织形成,仅在分生区部分一些皮层细胞之间有孔隙形成。根系分生区和伸长区的表皮细胞染色较通气对照加深,说明这一部分根系形成了径向氧气损失(ROL)屏障。

	图 3 低氧胁迫对黄瓜幼苗根系形态结构的影响 Fig. 3 Effect of hypoxia stress on root morphology of cucumber seedlings 箭头所示为低氧下根系分生区形成的细胞间孔隙和根系伸长区产生的通气组织。 Arrows indicated schizogenous intercellular cavity formed in meristematic zone and aerenchyma in elongation zone under hypoxia stress.
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由图 4可知:低氧显著促进了黄瓜幼苗乙烯的合成。胁迫3 d后,下胚轴的乙烯产生速率达到262 nmol • g^-1 • h^-1,较通气对照增加7倍;而根系和叶片的乙烯合成速率也显著增加。

	图 4 低氧胁迫对黄瓜幼苗乙烯产生速率的影响 Fig. 4 Effect of hypoxia stress on ethylene production rate of cucumber seedlings
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由图 5可见:胁迫初期植株ACS活性显著提高,处理1 d后下胚轴ACS活性较通气对照增加3.3倍,根系提高1.4倍,而叶片酶活性增加4%;随胁迫时间延长,植株各部位的ACS活性逐渐降低,但下胚轴和叶片的酶活性仍显著高于通气对照。

	图 5 低氧胁迫对黄瓜幼苗1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)活性的影响 Fig. 5 Effect of hypoxia stress on 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase(ACS)activity of cucumber seedlings
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由图 6可见:低氧胁迫下黄瓜幼苗根系和下胚轴纤维素酶活性显著提高,处理3 d后,下胚轴酶活性较通气对照增加3.54倍,根系酶活性则提高2.36倍。下胚轴纤维素酶活性在整个低氧处理期间持续升高,始终保持较高水平;而根系则呈现先升高后降低的变化趋势。低氧也明显增强了下胚轴和根系的多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,其中下胚轴PG酶活性在整个处理期间持续增加,而根系则呈现先升高后降低的变化趋势。此外,胁迫也显著提高了幼苗的果胶酯酶(PME)活性,且下胚轴酶活性升高的幅度更大。

	图 6 低氧胁迫对黄瓜幼苗与细胞壁降解有关酶活性的影响 Fig. 6 Effect of hypoxia stress on activity of enzymes involved in cell wall degradation of cucumber seedlings
图选项

低氧是植物生长环境中常见的一种非生物胁迫,影响植物正常的生长发育^[3]。本研究中低氧胁迫显著抑制了黄瓜幼苗的生长,胁迫处理7 d后根系干质量和根尖数目也显著降低。

逆境胁迫如干旱、低温等均会造成叶片在形态构造上的变化^{[14, 15]}。本研究中,低氧胁迫处理7 d后,幼苗叶片组织细胞结构紧密度增加,栅栏组织相对比例增加,海绵组织也较发达。通过叶片结构的这种变化,根际低氧胁迫下的幼苗叶片光利用能力得到了改善^[16]。

低氧下不定根的形成是许多耐淹植物对淹水的一种主要适应方式,这些不定根与茎部的通气组织相联系,其根尖细胞具有较高细胞分裂能力和生理活性,根内部有发达的通气组织形成,从而明显改善植株的氧气摄取和运输能力^[17],满足根系生理活动对氧气的需求^[18]。茎基或下胚轴肥肿有利于地上部的氧气向根系扩散,也有益于根系在低氧胁迫下产生的有害代谢物质的排出,淹水时大豆茎基部由皮孔运输的氧气维持了根系的呼吸^[19]。本试验中,低氧处理7 d后黄瓜幼苗茎基部下胚轴部分结构疏松,表面出现大量皮孔和不定根,与前人的研究报道一致。

植物通气组织提供了氧气由地上部向低氧根系扩散的途径,从而保证根的代谢需要。在根际受到氧气供应限制时,湿地植物(如水稻)和旱生植物(如玉米、小麦)能通过形成通气组织改善根际的低氧状态,缓解逆境对植株的伤害^{[20, 21, 22]}。另外,植物可以利用通气组织向根际释放氧,从而缓解低氧胁迫下根际还原性物质对植物的毒害,起到脱毒作用;同时它也能促进在厌氧土壤和植物组织中积累的挥发性化合物(其中包括乙醇、二氧化碳和甲烷)由根部向上流动^[23]。本试验结果表明,低氧胁迫下黄瓜幼苗下胚轴表皮破裂形成皮孔,皮层薄壁细胞之间互相分离,形成了较大的细胞间隙,而靠近根尖的根系伸长区内有通气组织形成。

由根系向土壤的径向氧气损失(ROL)减少时,厌氧条件下植物的根系生长和氧气扩散效率增加^[24]。一些植物具有组成型的ROL屏障,而另一些植物则具有在低氧逆境下诱导产生ROL屏障的能力^[25]。墨西哥类蜀黍相对于玉米较耐低氧的原因在于形成更大的通气组织支持从地上部向根尖的氧气运输,且不定根中的ROL屏障更强^[22]。本研究中黄瓜幼苗在低氧处理后根表皮部分染色加深,说明根系在低氧下形成了ROL屏障。黄瓜幼苗发生的这一系列形态结构的变化可能是植株对低氧胁迫的一种适应性、防御性反应,阻止了根际低氧对植株生长的进一步抑制。

乙烯参与通气组织的形成^[21]。ACS是乙烯合成途径的关键酶和限速酶,低氧下玉米根系ACS活性增强,乙烯合成增加^[26]。乙烯作用抑制剂或乙烯合成抑制剂能有效地阻止低氧条件下通气组织的形成^{[21, 26]},通气条件下乙烯处理也能诱导通气组织产生^[27],玉米根系和皮层细胞与程序性细胞死亡(PCD)有关的通气组织形成受到外源乙烯或低氧条件下产生的内源乙烯的促进^[20],这些结果表明乙烯调控低氧胁迫下植物可诱导的通气组织形成。本研究发现,与通气对照相比,低氧胁迫明显促进了黄瓜幼苗的ACS活性,植株乙烯产生速率显著增加。低氧对乙烯合成的促进作用可能与幼苗在胁迫条件下的形态适应有关。

植物在低氧条件下的形态适应过程中伴随着细胞壁降解酶如纤维素酶和果胶酶的激活^[28]。与通气组织形成有关的细胞壁代谢酶可能受到低氧胁迫下乙烯的诱导^[29],低氧逆境所致的质外体酸化为细胞壁松弛蛋白的作用提供了最适的酸性环境^[30]。全基因组转录测序结果表明,低氧条件下与细胞壁代谢有关的基因在耐性品种中出现上调^[31]。本研究也表明,在低氧胁迫下黄瓜幼苗根系和下胚轴部分与细胞壁代谢有关的酶活性显著提高,这些变化可为黄瓜幼苗的低氧形态结构适应提供生理生化基础。

综上可知,低氧胁迫显著抑制了黄瓜植株生长,并使形态结构发生了适应性的变化。低氧胁迫促进了黄瓜幼苗植株ACS酶活性的提高和乙烯的产生;同时,与细胞壁降解有关的酶活性也显著增加,这些可能是低氧下黄瓜植株发生形态改变的生理基础。