水稻是全球最主要的粮食作物之一,我国60%以上的人口以稻米为主要食物。随着人们生活水平的提高,对水稻品质的要求也越来越高。虽然我国近几年籼型两系杂交稻和籼型常规稻的品质有所提高,但是还远不能满足市场的需求。如在2013年通过审定的品种达到部标优质一级米要求的只有7个,仅占当年审定品种总数的1.67%^[1]。同样,超级杂交稻的垩白粒率及垩白度优质达标率仍然较低,仅为34.7%和51.0%^[2]。同时垩白不仅直接决定了稻米的外观品质、碾磨品质等,也是决定市场品质的一个重要因素。一般一级优质稻垩白率不高于10.0%,垩白度不高于1.0%;二级优质稻垩白率不高于20.0%,垩白度不高于3.0%^[3]。从我国稻米出口情况来看,出口稻米垩白较大,大多超过了二级米要求的标准,因而在国际市场上缺乏竞争力,使我国的稻米生产面对外国优质米竞争时常常处于不利的局面。此外,垩白高的稻米在国内市场也不受消费者欢迎。因此,加快阐明垩白形成的机制和育种改良垩白性状,就显得尤为重要。开发新的与目标性状紧密连锁的分子标记能够直接应用于后代的选择,从而加快优质品种的选育过程,更加高效地改良稻米品质。方珊茹等^[4]通过选择回交导入法结合分子标记辅助选择技术与农艺性状选择,将外观品质性状基因导入Ⅱ-32B中,垩白粒率以及垩白度显著降低,这个策略是分子标记辅助选择育种的核心。因此,应该加大水稻垩白性状研究力度,结合分子标记辅助选择的方法,加快选育进程,逐渐提升我国水稻品种的国际竞争力。水稻垩白性状包括垩白粒率、垩白度等,是一个典型的数量性状,受多基因控制,以加性效应为主,且容易受外界环境因素的影响。随着分子数量遗传学的发展和饱和水稻分子连锁图谱的构建,对控制水稻垩白性状基因位点的定位和剖析研究已广泛开展。迄今为止,国内外学者利用DH群体^{[5, 6]}、重组自交系群体^{[7, 8]}、F₂及次级分离群体^{[9, 10]}和置换系^{[11, 12]}等不同作图群体对水稻垩白性状进行了QTL检测,在水稻12条染色体上都检测到了控制垩白性状的QTL位点。目前,虽然检测出众多的垩白QTL位点,但是利用生产中主栽品种构建高世代回交来检测垩白相关性状,从而进行品质改良的报道并不多见。

本研究中,利用日本优质粳稻品种‘越光’和国内曾大面积种植的高产籼稻品种‘桂朝2号’杂交、回交的方法,构建了一系列高世代回交群体,对垩白相关性状进行遗传和分子机制研究,以期为垩白性状相关QTL的精细定位和克隆以及分子育种提供科学依据。

以优质粳稻品种‘越光’(Koshihikari)为供体亲本,以高产不优质的籼稻品种‘桂朝2号’为回交亲本,连续回交,回交至BC₄F₁~BC₆F₁,并连续自交3代得到稳定纯合家系,选取均匀覆盖水稻12条染色体的144个SSR分子标记进行背景检测,最终得到包含71个家系的纯合高世代回交家系。在高世代回交家系构建过程中,本文主要从株高、叶片、抽穗期、结实率和有效穗数等性状进行考察。

于2014年5月和2015年1月将亲本和群体分别种植于南京市江宁区土桥南京农业大学水稻所实验基地和海南陵水县南京农业大学南繁基地。采取随机区组设计,每个家系种植4行,2次重复,每行10株,单苗宽窄行种植。株距为16.5 cm,宽行行距为23.5 cm,窄行行距为16.5 cm。田间管理同大田生产。所有家系及亲本的种子完全成熟后,每个家系收取中间5株进行混收,经过一定时间晾晒后,进行品质性状的测定。

参照徐小飒等^[13]的方法进行DNA的提取,最终将DNA母液稀释到20 ng • μL^-1,4 ℃保存备用。

通过南京农业大学水稻所提供的788对SSR标记进行‘越光’和‘桂朝2号’亲本多态筛选,最终挑选144对多态性较好的引物进行高世代回交家系构建。

PCR扩增体系:1 μL DNA扩增模板,1 μL稀释引物,1 μL dNTP,1 μL 10×Buffer(Mg²⁺ plus)和0.1 μL Taq DNA聚合酶,用ddH₂O补足10 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃解链 30 s,72 ℃延伸 1 min,重复34次;72 ℃延伸10 min;4 ℃冷藏。引物的具体解链温度根据具体情况微调。

参照Guo等^[14]的方法进行测定,从供试样品精米中随机挑选饱满精米试样各3份,每份100粒(N),置于垩白观测仪上进行观察,将有垩白的米粒与无垩白的米粒分开,数出垩白米粒(n),计算垩白粒率(percentage of grains with chalkiness,PGWC),PGWC=n/N×100%。重复3次,取平均值作为垩白粒率的表型值。

参照中华人民共和国农业部标准米质测定方法(NY/T 593—2013),随机挑取垩白米10粒,在垩白观测仪上,米粒平放,逐粒目测垩白面积占整个籽粒面积的百分率,求出10粒垩白米的垩白面积百分率的平均值。重复2次,2次测定结果的平均值为垩白大小。垩白度(degree of percentage of grains with chalkiness,DPGWC)=垩白粒率×垩白大小。

QTL定位参照Tang等^[15]WINDOWS QTL CARTOGRAPHER v2.5软件CIM方法。该方法通过引入检测区间外的其他标记来消除区间外的位点对检测区间的影响,控制背景遗传效应,可大大提高QTL定位的精度。计算出的LOD值大于2.5将被视为存在一个假定的QTL位点。

从表 1中可见:‘越光’和‘桂朝2号’在各个性状上差异都较为明显,高世代回交家系中,除了结实率和有效穗数这2个性状以外,其余性状都介于2个亲本性状之间。利用垩白观测仪对随机挑选‘桂朝2号’和‘越光’2个亲本进行垩白粒率、垩白度观察(图 1),通过对双亲垩白粒率、垩白度进行t测验,双亲在这2个性状上均达到极显著水平。‘桂朝2号’在2014年南京和2015年海南两季都表现出高达100%的垩白粒率,而‘越光’垩白粒率只有2%~3%;‘桂朝2号’垩白度为30%左右,‘越光’垩白度为0。2014年高世代回交群体垩白粒率的平均值为97%,垩白度的平均值28%;2015年垩白粒率的平均值为98%,垩白度的平均值为29%(表 2)。相关性分析表明:在2014年南京,垩白粒率与垩白度相关系数为0.69,达到了极显著水平;同样在2015年海南,2个性状相关系数达到了0.70,也达到极显著水平。对这2年数据分析表明,垩白粒率与垩白度间是高度相关。

	图 1 ‘桂朝2号’(A)、‘越光’(B)及部分家系(C~F)垩白外观 Fig. 1 Grain chalkiness appearance for ‘Guichao 2’(A),‘Koshihikari’(B)and sectional lines(C-F)
图选项

从图 2可见:高代回交家系垩白粒率偏向高垩白亲本,尤其在2015年海南更为明显。两年两地的垩白度测定结果表明,71个高代回交家系在该性状上表现出明显的正态连续性分布,2014年垩白度大多集中在25%左右,但2015主要集中在30%左右,表明不同的环境能够影响水稻垩白度的分布。

	图 2 2014和2015年亲本和群体垩白性状分布 Fig. 2 The distribution of PGWC and DPGWC of parents and population in 2014 and 2015
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根据两年两地的表型数据和每个家系的分子数据,进行了垩白粒率和垩白度的QTL定位分析。从表 3 可见:共检测到33个与垩白粒率相关的QTL,其中2014年检测到16个,2015年检测到21个,LOD值变异范围为8.24~23.84,对表型变异的贡献率变异范围为8.51%~38.24%,加性效应值变幅为-0.34~0.11。除第11染色体外,在其他染色体上均检测到QTL。此外,除第3染色体上的qPGWC 3.3和qPGWC3.4 外,其余位点的加性效应表现为减效作用,加性效应值在-0.19~0.34之间,表明来自‘越光’的片段能够显著降低具有‘桂朝2号’背景家系的垩白粒率。检测到5个重复性位点(两年两地均检测到),其中有2个位于第4染色体,一个是RM1359~RM16939区间内的qPGWC 4.1 ,贡献率分别达到25.14%和8.68%,另一个是SSR11~RM17332区间内的qPGWC 4.3 ,贡献率分别达到25.14%和14.06%;位于第5染色体RM13~RM430区间内的qPGWC 5.2 的贡献率分别达到25.14%和8.51%;位于第7染色体RM5344~RM6872区 间内的qPGWC 7.1 ,贡献率分别达到38.24%和8.51%;位于第8染色体RM152~RS73区间内的qPGWC 8.1 ,贡献率分别达到25.16%和11.62%。

共检测到与垩白度相关的17个QTL,分别分布在第1、2、4、6、7、8、10和11等8条染色体上,LOD值变异范围为2.62~6.91,对表型变异的贡献率变异范围为13.38%~33.52%(表 3),加性效应值变异范围为-9.16~0.06。所有QTL加性效应值为负值,表明通过导入‘越光’的片段,能使具有‘桂朝2号’背景的家 系垩白度降低。检测到3个重复性位点,分别是位于第4染色体RM1359~RM16939区间内的qDPGWC 4.1 ,贡献率为27.94%和16.28%;第8染色体RM152~RS73区间内的qDPGWC 8.1 ,贡献率为20.42%和13.38%;第10染色体RM467~RM271区间内的qPGWC 10.1 ,贡献率为24.84%和24.35%。

在2年定位结果中,共检测到了5个能够稳定遗传的垩白粒率QTL,它们分别是第4染色体上的qPGWC 4.1和qPGWC4.3 ,第5染色体上的qPGWC 5.2 ,第7染色体上的qPGWC 7.1 以及第8染色体上的qPGWC 8.1 。其中,控制垩白度的QTL qDPGWC 4.1、qDPGWC8.1和qDPGWC10.1 在两年两地都能重复检测到,且这3个QTL位点中有2个位点能与垩白粒率的位点重合,表明垩白粒率与垩白度间存在高度相关的内在分子基础(图 3)。

	图 3 控制垩白粒率及垩白度的QTL在染色体上的分布 Fig. 3 Chromosomal locations of QTL for PGWC and DPGWC
图选项

目前,Li等^[16]通过QTL定位的方法,成功克隆了水稻垩白基因Chalk 5 ,表明通过定位的方法研究水稻垩白性状是可行并且有效的。本研究通过优质低垩白粳稻品种‘越光’为供体亲本,高产高垩白籼稻品种‘桂朝2号’为受体亲本,构建了一套高世代回交群体。利用这套群体在2014年南京和2015年海南两年两地共检测到50个控制垩白性状的QTL。其中一些QTL位点与已报道等位。如本研究检测到的qPGWC 9.1和qPGWC1.1 位点与Liu等^[17]利用Asominori/IR24置换系定位到的qPGWC 9.1和qPGWC2.1 在相同的连锁位置上。Zhou等^[18]利用PA64s/9311置换系群体在第7染色体定位到垩白粒率qPGWC- 7与本研究定位到的qPGWC7.2 连锁位置完全重合。Bian等^[19]利用Sasanishiki与Habataki的近等基因系定位到的qPGWC 1.1与本研究定位的qPGWC1.3 一致。本研究在两地能稳定表达的5个控制垩白粒率性状的位点中有2个已有报道,如qPGWC 5.2 与Liu等^[20]定位到的qJPGC- 5 、Peng等^[21]定位到的qCR 5 -H+、高 方远等^[22]定位到的qPGWC 5一致;qPGWC8.1 与刘家富等^[23]定位到的qPGWC 8-a部分重叠。而qPGWC4.1、 qPGWC4.3和qPGWC7.1 三个位点未见有报道,可能是本研究新发现的控制垩白性状的QTL。其余控制垩白粒率的位点只能在一个环境中检测到,属于对环境敏感型,如qPGWC 8.2 的LOD值虽然达到了19.67,表型贡献率达到38.24%,但仅在2014年南京点检测到,在2015年却未检测到。但可通过利用具有环境敏感型的QTL以实现不同地区的生产需要。本研究定位到的垩白度qDPGWC 1.1和qDPGWC2.1 与Wan等^[24]定位到的qDEC- 1b和qDEC-2 位置一致,而2个稳定表达的位点qDPGWC 4.1和qDPGWC10.1 未有相关报道,可能为新的QTL位点。

在本研究检测到的8个稳定表达的位点中,有2个位点不仅能调控垩白粒率,而且对垩白度也存在一定的影响,其余非稳定性位点中,有5个位点也表现类似的情况。这与垩白粒率与垩白度间存在显著相关性的结果相一致,表明这2个性状可能存在相同的遗传基础^{[10, 25, 26, 27]}。这些结果均表明垩白粒率和垩白度之间存在着一定的相关性。本研究检测到的垩白粒率与垩白度共定位的QTL位点,它们的加性效应值方向一致,来自‘越光’的等位基因均表现出明显降低垩白粒率与垩白度的作用,在今后的分子选择育种过程中,可考虑通过降低其中某一性状来实现对另一性状的调控。

垩白性状属于数量性状,受到遗传以及环境等方面的影响,目前很多专家学者已经从QTL定位,基因缺失、抑制,转录RNA和蛋白表达等方面进行研究,但是终究对垩白基因的调控机制研究尚浅。本文利用‘越光’作为非轮回亲本,由于其优质低垩白的特质,对垩白性状研究创造了优良的基础。在下一步工作中,利用本文定位到的新垩白QTL,进行进一步回交,缩短定位区间,精细定位垩白基因,探究垩白基因调控机制。