南京农业大学学报  2016, Vol. 39 Issue (01): 150-155   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201503052
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黄欣梅, 李银, 赵冬敏, 刘宇卓, 杨婧, 韩凯凯.
HUANG Xinmei, LI Yin, ZHAO Dongmin, LIU Yuzhuo, YANG Jing, HAN Kaikai.
11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析
Genetic analysis of neuraminidase genes of 11 H9N2 subtype avian influenza viruses
南京农业大学学报, 2016, 39(01): 150-155
Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(01): 150-155.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201503052

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收稿日期：2015-03-26
引用本文
黄欣梅, 李银, 赵冬敏, 刘宇卓, 杨婧, 韩凯凯. 11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(01): 150-155.
HUANG Xinmei, LI Yin, ZHAO Dongmin, LIU Yuzhuo, YANG Jing, HAN Kaikai. Genetic analysis of neuraminidase genes of 11 H9N2 subtype avian influenza viruses[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(01): 150-155.  DOI: 10.7685/jnau.201503052
11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析
黄欣梅, 李银 , 赵冬敏, 刘宇卓, 杨婧, 韩凯凯    
江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/ 国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏 南京 210014
收稿日期：2015-03-26
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(14)2091]
作者简介：黄欣梅,助理研究员,E-mail:hxmrene@126.com。
通信作者：李银,研究员,研究方向为家禽重要疫病的流行规律与防治,E-mail:muziyin08@163.com。
摘要：[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点(HB)在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。
关键词： H9N2亚型禽流感病毒     神经氨酸酶基因     遗传分析    
Genetic analysis of neuraminidase genes of 11 H9N2 subtype avian influenza viruses
HUANG Xinmei, LI Yin , ZHAO Dongmin, LIU Yuzhuo, YANG Jing, HAN Kaikai    
Institute of Veterinary Medicine/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: [Objectives]The aim of the paper is to study the evolutionary characteristics and the genetic mutations of H9N2 subtype avian influenza virus(AIV)in China. [Methods]11 H9N2 AIVs were isolated from domestic fowl in Jiangsu,Anhui and Zhejiang Provinces during 2008 to 2013. The neuraminidase(NA)genes of the isolates were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction. After cloning and sequencing,homology and phylogenetic analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences of NA were performed. [Results]The phylogenetic analysis results showed that the NA genes of the isolates shared nucleotide and deduced amino acid homologies that ranged from 86.2% to 99.5% and 86.9% to 99.1%,respectively. All the 11 strains belonged to Eurasian lineage,and 9 chicken-origin isolates which had a stalk deletion of 3 amino acid residues at positions 63-65 were derived from Y280-like sublineage,and 2 duck-origin isolates which had a stalk deletion of 2 amino acid residues at positions 39-40 were derived from G1-like sublineage. The potential N-glycosylation sites at amino acid residues at enzyme active sites of the isolates were highly conserved and had no mutations associated with resistance to the neuraminidase inhibitors. [Conclusions]The results indicated that Y280-like sublineage is still the common H9N2 subtype AIV in chickens in Jiangsu,Anhui and Zhejiang Provinces,and the emergence of G1-like sublineage in ducks in this area should be paid attention to. The continuing evolution of NA gene of H9N2 subtype AIV in East China emphasizes the importance of surveillance throughout this region.
Keywords: H9N2 subtype avian influenza virus     neuraminidase gene     genetic analysis    

禽流感(avian influenza,AI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒引起的以禽类呼吸系统和全身败血为特征的禽类传染病。H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于低致病性禽流感病毒,家禽感染后发病率和死亡率较低,但是因为分布广泛,能造成宿主的免疫抑制及引起人类感染,其危害性不容忽视。1966年Homme等[1]从火鸡体内分离到第一株H9N2亚型AIV,之后该亚型病毒在世界范围内广泛流行。我国是1994年首次报道鸡感染H9N2亚型AIV,目前其已成为我国主要的禽流感流行毒株,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。1999年以来,国内外已报道多起人感染H9N2亚型AIV病例[2]。2013年爆发的人感染H7N9亚型AIV与H9N2亚型AIV关系密切,已证实其内部基因是通过基因片段重组从H9N2亚型AIV获得的[3]。H9N2亚型AIV对人类健康是一个潜在的威胁,因此加强对H9N2亚型AIV的监测还具有重要的公共卫生意义。

神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感病毒粒子表面的一种重要的糖蛋白,可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸,帮助成熟的病毒粒子脱离宿主细胞并感染新的细胞。NA还能协助病毒穿透宿主呼吸道表面的黏膜层,侵入呼吸道上皮细胞内,并将诱捕受体从上皮细胞表面的糖萼上移除,从而促进病毒在体内的传播[4]。有报道[5]称NA能激活转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β),进而抑制炎症和免疫损伤的发展,有利于病毒的持续感染和传播。NA还具有较强的免疫原性,能有效诱导机体产生特异性的免疫力,用NA免疫小鼠可减轻疾病症状,减少肺脏内病毒效价以及排毒量[6]。NA不仅是制备疫苗的重要抗原成分,还是流感治疗药物的作用靶点,抗流感药物通过结合NA的酶活性位点抑制NA的活性,对于治疗流感病毒感染有显著效果。但由于NA具有较高的变异性,易发生抗原漂移以及产生耐神经氨酸酶抑制剂的毒株。本文分析了华东地区2008—2013年分离的H9N2亚型AIV的NA基因序列,从分子水平了解本地区H9N2亚型AIV NA基因的变异特点和耐药性情况,为H9N2亚型禽流感的防控提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 病毒

11株H9N2亚型AIV毒株由农业部兽用生物制品工程技术重点实验室于2008—2013年从江苏、安徽、浙江等省有温和流感症状或无明显病症的家禽中分离,并通过血清学鉴定。将病毒接种10日龄SPF鸡胚,72 h后收集尿囊液,测定血凝效价后置于-70 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

RNase 抑制剂、AMV反转录酶、Ex Taq酶、pMD18-T载体克隆试剂盒、限制性内切酶等购自大连宝生物有限公司;体液病毒DNA/RNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒、小量提取质粒试剂盒等购自Axygen公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已发表的H9N2亚型AIV NA基因序列,设计1对引物用以扩增NA基因全长序列:上/下游引物NAF/NAR:5′-AGCAAAAGCAGGAGT-3′/5′-AGTAGAAACAAGGAGTTTTT-3′。反转录引物使用流感病毒通用引物Uni12:5′-AGCAAAAGCAGG-3′。扩增片段长度约为1.4 kb。引物由南京金斯瑞公司合成。

1.4 NA基因的RT-PCR扩增与测定

用体液病毒DNA/RNA抽提试剂盒提取病毒RNA,按AMV反转录酶说明书进行反转录。以合成的cDNA为模板进行PCR 扩增,PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 10 min。反应结束后取PCR产物在10 g·L-1琼脂糖凝胶中进行电泳。回收目的片段,与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。经酶切鉴定后,挑选阳性克隆质粒送南京金斯瑞公司进行基因序列测定。

1.5 NA基因的序列分析

用Lasergene 7.1 DNAStar软件分析NA基因的同源性,并对唾液酸结合位点、 蛋白酶活性位点、潜在糖基化位点、抗原决定簇的氨基酸差异进行分析。应用MEGA 5.05软件对本研究获得的11株NA基因序列与GenBank中已发表的H9N2亚型禽流感经典毒株和疫苗毒株进行遗传进化关系分析,构建系统进化树。采用基于默认参数的邻接法(Neighbor-joining)计算遗传距离,自举检验值(Bootstrap test)设置为重复1 000次。参考毒株的名称和GenBank登录号如下:TU/WS/1/66(CY130056)、CK/GD/SS/94(DQ874395)、CK/BJ/1/94(AF156398)、CK/SD/6/96(AF508591)、CK/HK/G9/97(AF156391)、DK/HK/Y280/97(AF156394)、DK/HK/Y439/97(AF156395)、QU/HK/G1/97(AF156396)、CK/SH/F/98(AY253754)、DK/NJ/01/99(DQ681205)、QU/ST/11195/05(EF155120)、DK/HN/S4111/11(CY146662)、CK/RZ/267/13(KF259593)、CK/WZ/606/13(KF259563)。

2 结果与分析 2.1 NA基因的扩增及序列测定

分别提取11株H9N2亚型AIV的RNA,用RT-PCR方法扩增NA基因片段,大小约为1.4 kb,与预期相符。测序结果经NCBI在线比对确认为H9N2亚型AIV的NA基因。分离毒株名称、宿主、分离时间和分离地点见表1。

表 1 H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离毒株 Table 1 Isolations of H9N2 subtype avian influenza virus(AIV)
病毒名称Virus name宿主Host分离时间Isolation time分离地点Isolation site病毒名称Virus name宿主Host分离时间Isolation time分离地点Isolation site
CK/AH/FT/08Chicken2008Anhui ProvinceCK/ZJ/JX1603/13Chicken2013Zhejiang Province
CK/AH/MG08/08Chicken2008Anhui ProvinceCK/JS/WX0201/13Chicken2013Jiangsu Province
CK/AH/HF1004/10Chicken2010Anhui ProvinceCK/JS/WX0204/13Chicken2013Jiangsu Province
CK/JS/JT1005/10Chicken2010Jiangsu ProvinceDK/JS/WX5001/13Duck2013Jiangsu Province
CK/JS/SZ0207/13Chicken2013Jiangsu ProvinceDK/JS/KS0802/13Duck2013Jiangsu Province
CK/ZJ/JX1605/13Chicken2013Zhejiang Province
表选项
2.2 NA基因的同源性分析

通过DNAStar 软件比对分析,发现本试验分离的11株毒株NA基因核苷酸序列同源性为86.2%~99.5%,推导的氨基酸同源性为86.9%~99.1%。2株鸭源毒株DK/JS/KS0802/13和DK/JS/WX5001/13与H9N2亚型AIV欧亚分支中G1-like亚系的代表株QU/HK/G1/97的同源性较高,核苷酸序列同源性为91.6%~92.6%,氨基酸同源性为90.9%~92.2%;其余9株鸡源毒株与Y280-like亚系的代表株DK/HK/Y280/97的同源性较高,核苷酸序列同源性为92.2%~94.5%,氨基酸同源性为92.5%~95.9%。

2.3 NA基因的系统进化分析

将11株分离毒株的NA基因核苷酸序列与参考毒株进行比较,并绘制系统进化树。如图1所示:11株分离毒株均属于欧亚分支,其中2株鸭源分离株位于以QU/HK/G1/97为代表株的G1-like亚分支内,其余9株鸡源分离株位于以DK/HK/Y280/97为代表株的Y280-like亚分支内,但与疫苗株亲缘关系较远,位于不同的进化分支。

图 1 H9N2亚型AIV NA基因系统进化树分析 Fig. 1 Phylogenetic tree of H9N2 subtype AIV based on the NA gene 本研究分离的11株毒株用粗体标记,疫苗株用▲标记,欧亚分支内各亚系的代表毒株用★标记。
The virus strains characterized in this study were marked in bold,vaccine strains were marked with triangles,and the isolates marked with stars stand for representative strains of sublineage group.
图选项
2.4 NA蛋白氨基酸序列分析

本研究中11株H9N2亚型AIV的NA基因中,2株鸭源毒株DK/JS/KS0802/13和DK/JS/WX5001/13的开放阅读框(ORF)含1 404个核苷酸,编码467个氨基酸,其余9株鸡源毒株的ORF含1 401个核苷酸,编码466个氨基酸。流感病毒NA蛋白的颈部区域可以有不同长度氨基酸的缺失。分析分离毒株的NA基因序列后,发现2株鸭源毒株的氨基酸序列在颈部第39、40位有Q、N 2个氨基酸的缺失,G1-like亚系的毒株QU/HK/G1/97和QU/ST/11195/05在该位点也有相同的氨基酸缺失。9株鸡源毒株在NA蛋白颈部第63、64、65位有T、E、I 3个氨基酸的缺失,2株鸭源毒株在该位点没有发生氨基酸缺失,但第65位氨基酸由I突变为V(表2)。

表 2 H9N2亚型AIV NA蛋白颈部缺失和潜在N-糖基化位点的比较 Table 2 Comparison of stalk deletions and potential N-glycosylation sites of H9N2 subtype AIV NA proteins
毒株Virus颈部缺失Deletion in the stalkN-糖基化位点Potential N-glycosylation sites
39-4063-65 61697086143146155200234264306368402
CK/AH/FT/08QN--NST-NWS-NGT-NATNGTNIS---
CK/AH/MG08/08QN--NST-NWS-NGT-NATNGTNIS---
CK/AH/HF1004/10QN--NST---NGT-NATNGTNIS---
CK/JS/JT1005/10QN--NST-NWS-NGT-NATNGTNIS---
CK/JS/SZ0207/13KD--NNTNTTNWS-NGT-NATNGTNIS-NGS-
CK/ZJ/JX1605/13QT--NST-NWS-NGT-NATNGTNIS---
CK/ZJ/JX1603/13QN--NST-NWSNHSNGT-NATNGTNIS-NNSNWS
CK/JS/WX0201/13QN--NST--NHSNGT-NATNGTNIS-NNSNWS
CK/JS/WX0204/13QN--NST-NWS-NGT-NATNGTNIS-NDSNWS
DK/JS/WX5001/13-TEVNTTNNT-NWS-NGT-NATNGT---NWS
DK/JS/KS0802/13-TEVNTTNNT-NWS-NGT-NATNGT---NWS
QU/HK/G1/97-TEINITNNTNTTNWS-NGT-NATNGT----
DK/HK/Y280/97QN--NST-NWS-NGT-NATNGT---NWS
DK/HK/Y439/97QNTEINITNST-NWS-NGTNRTNATNGT-NMT--
注:“-”表示颈部缺失或失去潜在的N-糖基化位点。
Note：“-”means stalk deletions or no potential N-glycosylation sites.
表选项

糖基化位点被证实对于维持NA蛋白分子的结构和正常生物功能具有重要意义[7]。如表2所示:对本研究获得的分离毒株及欧亚分支内3个亚系代表毒株的NA蛋白潜在的N-糖基化位点(拥有N-X-T/S基序,X为除P以外的氨基酸)进行分析,发现在69、146、200、234位氨基酸的糖基化位点比较保守;所有分离毒株均失去了155、306位点的糖基化位点;9株鸡源毒株由于在63位氨基酸发生了缺失,因而失去了61位点处的潜在糖基化位点;CK/JS/SZ0207/13毒株的第70位氨基酸由S突变为N,因此在该处增加了一个糖基化位点;CK/AH/HF1004/10和CK/JS/WX0201/13失去了86位点处的糖基化位点;CK/ZJ/JX1603/13和CK/JS/WX0201/13毒株的第143位氨基酸突变为N,出现了一个新的糖基化位点;9株鸡源毒株在264位点增加了一个糖基化位点;4株毒株在368位点出现新的糖基化位点;6株毒株由于402位氨基酸发生突变而失去了该处的糖基化位点。

唾液酸结合位点,即红细胞结合位点(hemadsorbing site,HB)位于NA蛋白的表面,远离神经氨酸酶酶活性区域,对病毒的复制具有重要作用。本试验分析了NA蛋白HB位点的氨基酸变异情况,如表3所示,11株分离毒株在431~433氨基酸位点区域比较保守,均为PQE。而在366~373位点区域的367、368和369氨基酸位点,以及399~404位点区域的401、402氨基酸位点表现出较大的变异。

表 3 H9N2亚型AIV NA蛋白红细胞结合位点的比较 Table 3 Comparison of hemadsorbing(HB)sites of H9N2 subtype AIV NA proteins
毒株Virus红细胞结合位点 Hemadsorbing(HB)sites 毒株Virus红细胞结合位点 Hemadsorbing(HB)sites
366-373399-404431-433366-373399-404431-433
CK/AH/FT/08IKSDSRSGDSDSWSPQECK/JS/WX0201/13-RNN------EN-----
CK/AH/MG08/08--------E--------CK/JS/WX0204/13-RN-------EN-----
CK/AH/HF1004/10----L------------DK/JS/WX5001/13-NK-------NN-----
CK/JS/JT1005/10-----------------DK/JS/KS0802/13-NK-------NN-----
CK/JS/SZ0207/13--NG-------D-----QU/HK/G1/97--K-------DIR----
CK/ZJ/JX1605/13-----------------DK/HK/Y280/97--E-------DN-----
CK/ZJ/JX1603/13-RNN------EN-----CK/HK/Y439/97-SK------NNN---K-
表选项

当流感病毒NA蛋白酶活性位点中的氨基酸发生突变时,病毒将获得抗神经氨酸酶抑制剂如扎那米韦和奥赛米韦的抗药性。对本研究中分离毒株NA蛋白的酶活性位点进行分析,发现这些位点都非常保守,没有发生突变,表明这些毒株还没有对神经氨酸酶抑制剂产生抗药性(表3)。

NA蛋白含有7个抗原决定簇,均位于其头部区域,分别为位于153、197~199、328~336、339~347、367~370、400~403和431~434位氨基酸[8]。经过氨基酸序列比对分析,发现11株分离毒株NA蛋白抗原决定簇中的153、199、328、331、346、136、368、369、401、402和434位氨基酸变异较为活跃。

3 讨论

H9N2亚型AIV遗传进化关系分为北美种系和欧亚种系两大分支,欧亚分支进一步分为Y280-like、G1-like以及Y439-like 3个亚系,其 代 表 株 分 别 为DK/HK/Y280/97、QU/HK/G1/97和DK/HK/Y439/97[9]。本研究中的11株分离毒株均属于欧亚分支,其中9株鸡源病毒属于Y280-like亚系,但与疫苗株之间存在一定的遗传差距,说明近年来华东地区鸡群中H9N2亚型AIV正在不断变异演化,与疫苗株之间的遗传距离不断增加,应考虑筛选与现阶段流行毒株相匹配的疫苗候选毒株。值得注意的是,2株鸭源病毒与分离自鹌鹑的QU/HK/G1/97亲缘关系较近,属于G1-like亚系。而QU/HK/G1/97毒株的内部基因与同期在香港感染人的H5N1亚型AIV高度同源,使得G1-like亚系病毒备受关注,被认为可能对哺乳动物具有潜在致病性。之前G1-like亚系主要在鹌鹑中流行[10],此次从鸭体内分离到该亚系毒株,说明G1-like亚系毒株已在华东地区水禽中流行,很有可能会传入鸡群中,鉴于该亚系病毒的公共卫生意义,应加强对该类病毒的监测。

在不同亚型和同亚型流感病毒之间,NA蛋白颈部的氨基酸序列差异较大,并且长度也不尽相同。NA 蛋白颈部长度的变化会影响神经氨酸酶的活性,引起病毒复制能力的变化,进而影响病毒的毒力[11]。Y280-like 分支的毒株在颈部63~65位点缺失3个氨基酸,G1-like分支在颈部38、39位点缺失2个氨基酸。Liu等[12]报道NA蛋白颈部63~65位点缺失3个氨基酸是大陆鸡群中H9N2亚型AIV的分子标志,本研究中分离的9株鸡源毒株符合这一特点。2株鸭源毒株在38、39位点缺失 2个氨基酸,符合G1-like分支的特点。NA蛋白颈部氨基酸的缺失是否会影响病毒毒力尚待进一步研究。

N-糖基化位点对病毒毒力、宿主免疫反应以及神经氨酸酶的作用都至关重要。较早的研究表明,中国大陆地区H9N2亚型AIV的NA蛋白中第86、146、200、234和402位潜在糖基化位点高度保守[13],但本试验中有2株毒株缺失了第86位糖基化位点,6株毒株失去了第402位糖基化位点。与Y439-like亚系的代表株相比,所有分离毒株均失去了155、306位点的糖基化位点;9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,与2株G1-like亚系的鸭源毒株相比存在较大差异,分别在61位缺失了1个糖基化位点,在264位增加了1个糖基化位点;此外,CK/JS/SZ0207/13毒株在第70位增加了1个糖基化位点,2株毒株的第143位点出现了1个新的糖基化位点,4株毒株在368位点出现新的糖基化位点。与早期报道相比,本研究中分离毒株NA蛋白潜在的糖基化位点出现了较多的变异,这是否会影响病毒的生物学特性还有待进一步的研究。

NA蛋白通过唾液酸结合位点,即红细胞结合位点(HB)与另一表面糖蛋白血凝素(HA)结合,当HA结合到感染细胞的受体上后,NA蛋白就裂解细胞受体上的唾液酸残基,使病毒完全进入到细胞中。如果HB位点发生变异,可能就会影响病毒的繁殖特性。Kobasa等[14]报道早期北美和韩国水禽中H9N2亚型AIV NA蛋白的HB位点在366~373区域和399~404区域非常保守,氨基酸序列分别是ISKDSRSG和DNNNWS。而本研究中分离毒株的HB位点氨基酸序列差异较大,主要表现在第367位氨基酸残基由S突变为K/R/N,第368位由K突变为S/N,第369位由D突变为G/N,第400位由N突变为S,第401位由N突变为D/E,第402位由N突变为S/D。

分离毒株的NA蛋白抗原决定簇中有部分氨基酸序列变异较为活跃。由于本地区普遍使用H9N2亚型AIV灭活疫苗,推测抗原决定簇的变异可能与抗体选择有关。HB位点中变异较大的位点恰好处于抗原决定簇区域,其发生突变可能也与疫苗的使用有关。

当流感病毒NA蛋白酶活性位点中的氨基酸发生特定突变时,病毒将获得抗神经氨酸酶抑制剂的抗药性[15]。本研究中分离毒株NA蛋白的酶活性位点都非常保守,没有发生突变,表明这些毒株还没有产生对神经氨酸酶抑制剂的抗药性。

本试验对华东地区2008—2013年分离的11株H9N2亚型禽流感毒株的NA基因进行了序列分析。由于采用灭活疫苗对H9N2亚型禽流感进行防控,在长期的免疫选择压力下,病毒更易发生基因突变和重组,遗传演化愈加复杂。本试验结果表明,本地区家禽中的H9N2亚型禽流感毒株NA蛋白的糖基化位点、HB位点以及抗原决定簇都发生较大变异,遗传关系与疫苗株愈来愈远,在今后的防控工作中应考虑当前流行毒株与疫苗株之间的遗传差异。此次从鸭群中分离到2株G1-like亚系的毒株,鉴于该亚系毒株具有重要的公共卫生学意义,应加强水禽中G1-like亚系AIV的监测,密切关注其是否传入鸡群并发生重组。加强对本地区H9N2亚型AIV的持续监测,对掌握该类病毒的变异情况,制定防控措施和筛选疫苗毒株具有重要意义。

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