成肌细胞是肌组织的前体细胞,来源于中胚层干细胞,经过分裂融合形成肌管,最终分化为成熟的肌纤维。肌纤维是肌肉的基本单位,其数量在胚胎期已基本固定下来,出生后产肉量的增加主要是肌纤维直径和长度的增加^{[1, 2]}。因此,胚胎期成肌细胞的增殖与分化能力的大小决定了肌肉生长潜力的大小。

胰岛素生长因子Ⅰ(insulinlike grow factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)基因是动物生长轴上重要的基因。在鸡体内、体外的研究表明^{[3, 4]},IGF-Ⅰ可促进成肌细胞的增殖与分化。肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN),又称GDF-8(growth and differentiation factor 8),属于转化生长因子β(TGF-β)超家族,主要在骨骼肌表达,对骨骼肌生长具有负调控作用。已有研究发现MSTN能影响肌肉前体细胞增殖与分化之间的平衡^[5]。IGF-Ⅰ与MSTN的作用是相反的。研究表明,肌肉细胞分化过程中,IGF-Ⅰ可以通过CREB转录因子调节MSTN基因表达^[6]。在鸡上的研究发现,IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达比值高低的变化与胸肌发育密切相关^[7]。目前有关鸭胚胎期成肌细胞IGF-Ⅰ与MSTN的变化趋势及二者间的关系,是否存在品种特异性等,尚未发现相关的报道。

关于禽类成肌细胞分离与培养方法,研究人员已经做了大量的工作,Shan等^[8]已经建立一套完善的分离与培养体系。肉用型的高邮鸭(70日龄平均体质量是2.48 kg)与蛋用型的金定鸭(70日龄平均体质量是1.54 kg)在生长发育相关性状上存在明显表型差异。本试验以高邮鸭和金定鸭为研究对象,提取鸭胚胸肌成肌细胞,采用实时荧光定量PCR技术,对原代成肌细胞在鸭胚发育过程中IGF-Ⅰ和MSTN的mRNA表达量及其比值变化进行比较分析,为鸭胚胎期骨骼肌中IGF-Ⅰ与MSTN相互作用的机制提供理论依据,为提高鸭的肌肉产量和品种选育等提供可借鉴的遗传学资料。

收集相同日粮水平下饲喂的高邮鸭和金定鸭种蛋。种蛋孵化前,称质量、消毒和编号,品种内蛋质量变异系数在2%以内。2个品种种蛋随机置入同一孵化箱,在相同条件下(温度37.5~37.8 ℃,相对湿度50%~70%)同时孵化。种蛋入孵后的24 h设定为1胚龄,分别于6个时间点(13、15、17、19、21和23胚龄)取5~8个鸭胚,用于胸肌成肌细胞的提取。

DMEM和FBS购自Hyclone公司;胰蛋白酶,Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司;青霉素-链霉素溶液购自碧云天生物技术研究所;Percoll细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。TRNzol-A⁺总RNA提取试剂、SuperReal PreMix、Quant cDNA 第一链合成试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA产物纯化回收试剂盒均购自TIANGEN公司;DNA Marker(DL2000)为TaKaRa公司产品。倒置显微镜为日本尼康公司产品;9700PCR仪和Max3000P荧光定量PCR仪购自爱普拜斯应用生物系统上海有限公司;凝胶成像系统(Tanon 2500)购自上海天能科技有限公司;GeneQuant Ⅱ紫外分光光度计为Pharmacia Biotech产品。

用无菌的剪刀、镊子分离鸭胚胸肌,用PBS清洗,去除脂肪及筋膜后,将肌肉剪为肉糜,加入1倍体积的混合酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化5~10 min,用终体积分数为5%~10%的FBS终止消化。被消化下来的细胞经不同孔径的滤膜(50~400目)过滤后,1 000 r·min^-1离心10 min,去上清液,细胞团重悬在DMEM培养基中。将重悬的细胞液加入到含60%、20% Percoll的不连续密度梯度Percoll柱中,1 600 r·min^-1离心25 min。小心取出两层Percoll间的云雾状细胞至新的离心管,添加少量DMEM并混匀,1 000 r·min^-1离心10 min,弃上清液,用适量DMEM液悬浮,用吸管将细胞团块吹散后计数,将所得成肌细胞悬液调整单细胞密度为10⁶ mL^-1。取1 mL单细胞悬液进行培养后采用免疫荧光法鉴定。参照文献8的方法鉴定细胞质结蛋白(Desmin)或核Pax7的表达情况,免疫荧光阳性的为成肌细胞,非阳性的基本为成纤维细胞。经分离和培养的鸭成肌细胞纯度达95%左右时,可以进行后续RNA提取试验。

将所得的单细胞悬液分装至2 mL离心管中,每管1 mL,每个时间点分装6~8管,1 000 r·min^-1离心5 min后弃上清液。将所得的细胞沉淀加入1 mL Trizol裂解液,保存在-20 ℃用于总RNA提取。成肌细胞总RNA的提取按总RNA提取试剂盒说明书进行。所得的RNA用DEPC水溶解后用14 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度和含量,计算样品总RNA浓度。取1 μg经检测合格的总RNA样品,按照反转录(R)试剂盒的使用说明书合成cDNA第一链。用内参基因β-actin检测cDNA合成质量以及是否有基因组DNA污染。RT产物保存在-20 ℃用于PCR检测。

根据GenBank中相关序列设计引物,由上海英骏生物工程有限公司合成。PCR产物经20 g·L^-1琼脂糖凝胶鉴定后,用DNA产物纯化回收试剂盒纯化、回收目的片段,与pGM-T载体相连接,然后转化E.coli TOP10感受态细胞。挑取转化子接种含氨苄抗性的LB液体培养基中,37 ℃ 200 r·min^-1振摇培养过夜,然后进行PCR鉴定。将鉴定正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定,所获序列结果在NCBI网站中用BLAST程序与数据库中公布的已知基因进行序列同源性比较。比对正确后用质粒小提试剂盒提取阳性克隆的质粒,用分光光度计测其浓度后作为标准品备用。

所用荧光定量PCR采用SYBR GreenⅠ法。将上述经测序验证后正确的含IGF-Ⅰ、MSTN基因的标准质粒,分别做10倍梯度稀释。将每个待测样品RT产物取等体积混合,用混合样(cDNA Mix)和梯度稀释的标准品进行反应条件的优化,包括标准品稀释梯度范围、目的基因和内参基因引物设计和合成、最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等,确定好最佳反应条件。根据最佳反应条件,将待测样品进行稀释。将稀释后的样品与梯度稀释的标准品在同一个试验中进行定量PCR。每次反应均设阴性对照,每个样品设置3个重复。根据标准品构建的标准曲线(标准曲线由系统软件自动分析获得)计算出待测样品目的基因的拷贝数。

运用SPSS 20.0软件中One-way ANOVA、t测验、Univarinate、Bivariate Correlation进行方差分析、差异显著性检验和相关性分析。所有数据均以 x±SE表示。

2.1 鸭胚原代成肌细胞纯度鉴定

如图1所示,Desmin、Pax7均呈阳性表达，Desmin在细胞质中表达(图1-B、E),Pax7在细胞核中表达(图1-C),Desmin和Pax7阳性细胞能占到总量的95%左右,表明所分离和培养的不同胚龄鸭成肌细胞纯度较高。

图 1 鸭胚成肌细胞的免疫荧光鉴定(100×) Fig. 1 Identifications of duck embryos myoblasts using immunofluorescence technique A:体外培养的17胚龄鸭成肌细胞;B、E:表达Desmin蛋白的鸭成肌细胞;C:表达Pax7蛋白的鸭成肌细胞;D:体外培养的19胚龄鸭成肌细胞 A:Morphologic characteristics of in vitro cultured duck myoblasts on embryonic days 17;B,E:Observation of the Desmin protein expressing in the duck myoblast respectively;C:Observation of the Pax7 protein expressing in the nucleus of duck myoblast;D:Morphologic characteristics of in vitro cultured duck myoblasts on embryonic days 19

图选项

从图2-A可知:2个品种成肌细胞IGF-ⅠmRNA发育变化模式基本一致,都存在17胚龄的表达高峰,19胚龄时表达量显著下降,之后表达量虽略有上升,但与19胚龄并无显著差异,并持续至23胚龄,但高邮鸭13胚龄时的基因表达量与17胚龄高峰期无显著差异。品种间比较发现,13胚龄时,高邮鸭的基因表达量是金定鸭的近3倍，差异极显著(P < 0.01);17胚龄时,金定鸭基因表达量是高邮鸭的近2倍,差异极显著(P< 0.01)。成肌细胞IGF-ⅠmRNA 表达存在极显著的日龄(P< 0.01)、日龄与品种的交互效应(P< 0.01),品种效应不显著(P=0.662)。

图 2 不同品种鸭胚胸肌成肌细胞IGF-ⅠmRNA(A)和MSTN mRNA(B)的表达量变化 Fig. 2 The change of IGF-Ⅰ(A)and MSTN(B)mRNA expression in breast myoblast of different duck breeds *、**表示同胚龄品种间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01);柱形图上字母不同者表示同一品种不同胚龄之间差异显著(P<0.05),n=6~8。 *,** indicate significantly different between Gaoyou ducks and Jinding ducks in the same age at the levels of 0.05 and 0.01. Bar diagram values with the different letters in the same breed mean significant difference between different embryo ages(P<0.05),n=6-8. The same as follows.

图选项

鸭胚成肌细胞MSTN mRNA表达变化如图2-B所示。在不同胚龄都能检测到该基因在成肌细胞中的表达,且在品种间的发育变化模式较为一致,都存在13、17胚龄2个表达高峰,19胚龄时表达量显著下调,并持续至23胚龄。品种间比较发现,13胚龄时,高邮鸭基因表达量是金定鸭的近2倍,差异极显著(P< 0.01);17胚龄时,2个品种的基因表达量无显著差异(P > 0.05)。成肌细胞MSTN mRNA表达存在日龄(P< 0.01)和日龄与品种的交互效应(P< 0.05),但品种效应不显著(P=0.475)。

如图3所示:鸭胚胸肌成肌细胞IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达量比值在两个品种的变化模式较为一致,均呈现前低后高。19胚龄之前,高邮鸭的基因表达量比值除15胚龄外,都小于1;金定鸭中,除17胚龄外,其他胚龄表达量比值都小于1。21、23胚龄时,与之前相比,高邮鸭的基因表达量比值显著升高10倍以上,金定鸭的则是显著升高4倍以上;品种间高邮鸭的高于金定鸭的近3倍,差异极显著(P < 0.01)。IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达量的比值存在极显著的日龄、品种效应(P < 0.01),以及二者的交互效应(P < 0.01)。

	图 3 不同品种鸭胚胸肌成肌细胞IGF-Ⅰ/MSTN mRNA比值的变化 Fig. 3 The ratio of IGF-Ⅰand MSTN mRNA expression in breast myoblast of different duck breeds
图选项

相关性分析可见(表2):鸭胚成肌细胞IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达在2个品种都呈极显著正相关,相关系数(r)分别为高邮鸭0.730(P=0.000)、金定鸭0.757(P=0.000)。两品种的IGF-Ⅰ与IGF-Ⅰ/MSTN mRNA表达量比值无显著相关性,MSTN与IGF-Ⅰ/MSTN mRNA表达量比值均呈显著负相关(P < 0.05)。

近年来,成肌细胞的研究受到广泛关注,但是关于其在禽类肌肉组织中不同发育时期的基因表达情况鲜有报道。高邮鸭和金定鸭作为生长速度差异较大的2个地方品种,胚胎期的体质量^[9]和胸肌质量^[10]已出现显著差异。为了揭示鸭成肌细胞IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达的发育变化规律,本试验检测了2个品种鸭胚胎期胸肌成肌细胞中IGF-Ⅰ和MSTN mRNA的表达规律,并进行比较。IGF-Ⅰ在胸肌成肌细胞中的表达没有品种差异,与之前在IGF-Ⅰ受体上的研究结果相一致^[11]。高邮鸭IGF-Ⅰ的表达有13、17胚龄2个表达高峰,而金定鸭仅有一个17胚龄的表达高峰,IGF-ⅠmRNA表达升高,能促进成肌细胞的分化^[12],推测高邮鸭比金定鸭多了一个肌细胞分化的高峰期。MSTN在2个品种的表达规律基本一致,表达高峰都在13和17胚龄。在鸡胚和鼠胚上的研究发现^[5],MSTN可以通过激活p21和Myod的表达促进胚胎肌肉前体细胞的分化。MSTN表达升高,可能会促进部分成肌细胞向分化的方向转变。比较发现,13胚龄时,高邮鸭成肌细胞IGF-Ⅰ与MSTN的表达都显著高于金定鸭,与这个时间点高邮鸭的胸肌质量显著高于金定鸭相一致,推测该胚龄可能是鸭胸肌生长发育出现品种差异的重要时期,IGF-Ⅰ与MSTN的共同参与,使高邮鸭比金定鸭多了一个肌纤维生长的高峰期。

体外研究表明:MSTN能通过影响IGF-Ⅰ诱导的Akt/TORC1/p70S6K信号通路来调节成肌细胞的分化与肌管的大小^[13]。Kurokawa等^[14]在研究鸡的成肌细胞时,发现IGF-Ⅰ浓度很高,而成肌细胞的融合并没有加快,是因为MSTN的表达也同时提高。在鸭胚肌肉中的检测结果显示^{[10, 15]},IGF-Ⅰ与MSTN的表达高峰出现的时期是一致的。在鸡上的研究结果也证实了这一点^[16]。胡骏鹏等^[17]在鹅中的研究表明,MSTN的基因表达量与血清IGF-Ⅰ的变化基本一致,具有相关性。本试验结果证实,IGF-Ⅰ的表达高峰与MSTN的表达高峰几乎是同步出现的,且二者的表达呈较强的正相关。因此,推测鸭胚胎期成肌细胞的增殖与分化平衡可能受到了IGF-Ⅰ和MSTN的协同控制。

Guernec等^[7]在鸡上的研究表明:尽管出雏前后IGF-Ⅰ和MSTN的表达量都显著下降,但是IGF-Ⅰ/MSTN表达量比值显著升高,且比值变化与鸡胸肌的相对生长变化规律相似。本试验显示:19胚龄之前,IGF-Ⅰ和MSTN表达都处于高峰期,但表达量的比值在两品种的各个胚龄几乎都小于1,说明此时IGF-ⅠmRNA的表达量低于MSTN。19胚龄之后,IGF-Ⅰ与MSTN表达量比值升高3倍以上,说明此时IGF-Ⅰ的表达显著高于MSTN。在羊成肌细胞中过表达IGF-Ⅰ,能使肌管融合率和直径显著增加,加入MSTN后,这种促进作用仍存在^[18]。岑石强等^[19]研究发现,IGF-Ⅰ对成肌细胞的作用具有剂量效应,低剂量时可以促进成肌细胞增殖,含量越高,促进分化的作用就越强,成肌细胞的融合率就越高,推测19胚龄之前成肌细胞可能以增殖为主,21至23胚龄时则以分化为主,说明鸭胚胎期成肌细胞向增殖或分化方向的转变,需要IGF-Ⅰ、MSTN的协同作用。

本试验结果显示:尽管单独的IGF-Ⅰ、MSTN表达的品种效应不显著,但mRNA比值的品种效应显著。21胚龄后,高邮鸭的IGF-Ⅰ/MSTN表达量比值显著高于金定鸭,与胚胎期^[10]高邮鸭的胸肌质量显著高于金定鸭出现的时间点(21胚龄后)相一致。IGF-Ⅰ和MSTN相对表达水平高低产生了差异,从而表现出骨骼肌生长速率的差异,这与鸡上的研究结果是一致的^[7]。因此,推测IGF-Ⅰ和MSTN的相对水平的高低可能在调节品种间胸肌发育差异方面起重要的作用,其中可能存在一个阈值,在不同品种、不同肌肉组织中存在差异。因此,要根据不同品种的生长特性,进一步深入研究二者相对水平的变化对肌肉生长速率产生影响的机制。

综上所述,鸭胚成肌细胞的增殖与分化的平衡同时受IGF-Ⅰ、MSTN的协同调控,鸭胚发育中期以增殖为主,后期以分化为主,二者的表达量比值更能反映遗传背景的差异对鸭胚胸肌成肌细胞发育的影响,可能在调节品种间肌肉生长速率差异方面具有重要的作用。