文章信息
- 谷淑华, 孙文星, 褚维伟, 韩海银, 党小勇, 陈杰.
- GU Shuhua, SUN Wenxing, CHU Weiwei, HAN Haiyin, DANG Xiaoyong, CHEN Jie.
- 猪NCOA3启动子甲基化对其在肌内和皮下脂肪组织差异表达的影响
- Effect of NCOA3 promotor methylation on its differential expression profile in intramuscular and subcutaneous adipose tissue in porcine
- 南京农业大学学报, 2016, 39(01): 120-126
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(01): 120-126.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201503022
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文章历史
- 收稿日期：2015-03-11
脂肪沉积调控对提高动物生产效率具有重要的意义。在动物生产中,不同部位脂肪经济价值上的差异致使其选育的方向也不同,如皮下脂肪和内脏脂肪等体脂的沉积应尽量减少,而肌肉内脂肪的沉积应适量提高以改善肉质。因此,尽管对脂肪细胞分化调控机制已有大量的研究,然而在动物育种工作中,如何实现不同部位脂肪组织的差异调控仍是亟待解决的问题。研究发现,不同部位的脂肪细胞具有不同的分化能力,并且不同部位的脂肪在代谢调控上也存在差异。位于肌纤维中的肌内脂肪与皮下脂肪细胞在分化和代谢上存在差异[1]。新淮猪是由淮阴地方猪与约克夏猪杂交而来,具有适应快、体格大、体质量增加快等特点[2]。本试验以新淮猪为研究对象,了解调控脂肪在肌内脂肪与皮下脂肪差异沉积的机制,提高肌内脂肪沉积,同时不影响甚至减少皮下脂肪沉积,对于提高新淮猪的猪肉品质具有重要的经济意义。
核受体辅激活蛋白3(nuclear receptor coactivator 3,NCOA3),属于固醇类激素受体辅激活蛋白p160家族一员,通过与核受体的结合调控核受体的转录激活。研究发现,NCOA3基因敲除的小鼠模型表现出脂肪沉积减少、能量消耗增加[3, 4, 5]。Hartig等[6]研究表明,NCOA3通过与脂肪分化关键因子核受体PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor gamma)结合,减少PPARγ-S114的磷酸化,从而促进核受体PPARγ的转录活性,进而促进脂肪的沉积。由此可见,NCOA3对于脂肪沉积至关重要,研究NCOA3的调控机制对于了解脂肪沉积分子机制具有重要意义。
DNA甲基化是哺乳动物基因表达调控的重要方式之一,它是在甲基化转移酶的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,转移到胞嘧啶5′碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶。一般来说,DNA甲基化主要发生在启动子区或第一外显子区的CpG岛上[7],这种修饰并没有改变基因的序列,但它参与机体的许多生物学过程,如基因转录抑制、基因组印迹、染色体完整性的维持、细胞分化和发育调控[8]。近年的研究表明,甲基化有高度组织特异性[9],并且DNA甲基化与脂肪沉积有关[10]。因此,了解基因在不同组织中甲基化程度对于解释基因的组织差异表达具有重要意义。
鉴于NCOA3在脂肪分化中的重要作用,本试验通过分析猪的NCOA3启动子活性,并通过亚硫酸盐测序检测皮下脂肪与肌内脂肪组织的NCOA3启动子CpG岛的甲基化水平,来探讨NCOA3在皮下与肌内脂肪组织中差异表达的原因。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 肌内脂肪与皮下脂肪样品取自48头新淮猪,将其颈动脉放血屠宰后,立即于胸腰结合处取背最长肌肌肉与其周围皮下脂肪组织,组织离体后立即放入液氮罐保存。从48头个体中挑选质量为80 kg左右的个体10头,采取每一头猪的皮下脂肪,用镊子在冰上从肌肉中分离出脂肪,用液氮速冻研磨,以备RNA和DNA提取。
1.1.2 主要试剂Trizol试剂、Tris-饱和酚、pMD19-T vector、DH5α感受态、PCR纯化试剂盒、rTaq酶、LATaq酶、限制性内切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ购自TaKaRa公司;SYRB Green Master Mix购自罗氏公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、无内毒提取试剂盒、双荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase® Reporter Assay System)购自OMEGA公司;亚硫酸氢盐试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)购自Zymo公司;转染试剂盒(LipofectamineTM 2000)购自Invitrogen公司;CpG甲基转移酶(CpG Methyltransferase)购自NBE公司;SDS、Tris-HCL、EDTA-Na2、氯仿、异丙醇、异戊醇、乙醇、DEPC(diethylpyrocarbonate)等均为分析纯。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取及实时定量PCRTrizol方法提取10头新淮猪肌内脂肪(按上述手术分离)与皮下脂肪的总RNA,测定浓度后,随即使用反转录试剂盒反转录成cDNA,其反应体系为:RNA模板不大于500 ng,5 μL反转录Mix,双蒸水补足到10 μL。反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。合成的cDNA进行实时荧光定量PCR,体系为20 μL,包括:稀释过的cDNA 2 μL，SYRB Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL(引物见表1),DEPC水6.8 μL。在StepOne Plus荧光分析仪(Life公司)上根据说明书完成操作,反应条件为:94 ℃ 4 min,1个循环;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环;熔解曲线:95 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,95 ℃ 30 s,1个循环。定量时每个cDNA样本重复4管,并以内标基因RPLP0矫正个体间差异,以2-ΔΔCT对有效性数据进行统计分析。
| 引物名称Primer name | 引物对序列(5′→3′)Primer pairs sequence |
| qPCR F/R | GCTATCAGTGAGGGTGT/TACTTGGTTGGGTTATG |
| pLUC-2062 F/R | CGGGGTACCTTCCTTTTCTCACTCACTTATAAA/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAAGAAAGA |
| pLEC-1432 F/R | CGGGGTACCGTATTTTGTGTGAAATTT/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAA |
| pLUC-1057 F/R | CGGGGTACCAATAATCATTGCTTTGT/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAA′ |
| pLUC-704 F/R | CGGGGTACCGTTTTGGAGTTTACATAT/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAA |
| pLUC-340 F/R | CGGGGTACCATTCTTGAAATCTTCAGAATAGTCA/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAAGAAAGAA |
| pLUC-150 F/R | CGGGGTACCAGGGAGAGAATATTACGAACTATCT/CCCAAGCTTATAAACATCAGCAACTAAGAAAGAA |
| BSP F/R | TTTATGGTGGTTTTTAGGTTAGG/CAAAACATTCTACTTAAAAATTCCC |
注:qPCR:NCOA3定量引物The quantitative primer of NCOA3;BSP:NCOA3 CpG岛扩增引物The amplification primer of CpG island in NCOA3
从GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)找到猪NCOA3启动子区序列,利用http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html预测分析启动子区转录因子结合位点。使用MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)以及Methyl Primer Express v1.0软件对NCOA3启动子区进行CpG岛预测。
1.2.3 构建NCOA3基因5′侧翼区缺失报告载体以新淮猪基因组为模板,用表1中引物扩增出NCOA3上游-2 062~-3、-1 432~-3、-1 057~-3、-704~-3、-340~-3、-150~-3共6个片段。得到的PCR产物经过KpnⅠ,Hind Ⅲ双酶切,纯化回收后与pGL3-basic连接,构建缺失报告载体。6个缺失报告载体分别命名为pLUC2062(-2 062~-3)、pLUC1432(-1 432~-3)、pLUC1057(-1 057~-3)、pLUC704(-704~-3)、pLUC340(-340~-3)、pLUC150(-150~-3),对经双酶切鉴定的阳性克隆进行序列分析(苏州金唯智生物科技有限公司)。
1.2.4 瞬时转染及荧光活性鉴定瞬时转染:复苏PK15细胞,置含10%血清的培养基中,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。第2天,用胰酶消化,将长满的PK15细胞接种到24孔板中培养,待细胞贴壁汇合度达到60%~80%时,用转染试剂盒将脂质体瞬时转染到细胞中。转染时,按1 μg目的质粒与0.05 μg内参质粒phRL-TK为20∶1的比例与脂质体混合,室温放置20 min,最后滴加到细胞中。培养5~6 h后换上新鲜的培养基继续培养,24 h后收集细胞。荧光活性的测定:按细胞双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书,把收集的细胞用裂解液充分裂解收集到离心管,利用单管酶标仪检测报告质粒(目的质粒)及内参质粒phRL-TK的活性,计算报告基因的活性。
1.2.5 亚硫酸氢盐测序分析提取皮下脂肪与手术分离肌内脂肪的DNA,测定其浓度,取500 ng用亚硫酸氢盐试剂盒处理。以获取的DNA为模板,利用Methyl Primer Express v1.0软件设计针对CpG岛的特异性引物(表1),通过PCR获取目的片段,150 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。鉴定后,用纯化试剂盒纯化PCR产物,将纯化产物16 ℃过夜连接到pMD19-T vector中。第2天转化DH5α感受态细胞,涂板,挑选单菌落进行测序。根据亚硫酸盐测序法的原理:单链DNA经亚硫酸氢盐处理后,甲基化的胞嘧啶C保持不变,而未甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶(U),再经PCR特异性扩增最终变为胸腺嘧啶(T)。利用BIQ Analysis软件对测序片段与原序列进行比对,判断出该片段的甲基化位点,统计分析甲基化的程度。
1.2.6 体外甲基化构建含有CpG岛的荧光报告载体(pLUC-1057),使用CpG甲基转移酶(M.SssⅠ)处理pLUC-1057。反应体系:质粒DNA 5 μg,CpG甲基转移酶(M.SssⅠ)5 μL,SAM(S-腺苷甲硫氨酸)10 μL,双酶切Buffer(NEB)10 μL,ddH2O补足至100 μL。同时设置不添加M.SssⅠ的阴性对照。处理过后,纯化回收,经甲基化敏感性酶HapⅡ(能将未甲基化的CG切开)酶切鉴定,-20 ℃保存,以备转染使用。
1.3 数据统计分析采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,差异显著性使用t测验分析。
2 结果与分析 2.1 NCOA3基因在肌内脂肪与皮下脂肪中mRNA表达水平NCOA3基因在肌内脂肪组织中的表达量极显著低于在皮下脂肪组织的表达(P < 0.01)(图1)。
 | 图 1 皮下脂肪组织与肌内脂肪组织中NCOA3 mRNA表达(**P < 0.01) Fig. 1 Expression of NCOA3 mRNA in subcutaneous and intramuscular adipose tissue SAT:皮下脂肪组织Subcutaneous adipose tissue;IAT:肌内脂肪组织Intramuscular adipose tissue |
对NCOA3上游2 000 bp进行生物信息学预测,对猪的NCOA3基因5′调控区进行CpG岛预测,结果显示NCOA3基因存在CpG岛,位于-930~-699 bp,且在启动子区只有这一个CpG岛(图2)。对转录因子预测,发现在上游-39~-30 bp处有TBP(TATA框结合蛋白)结合位点,另外启动子区内含有Sp1、c-Jun、CREBP1、CEBPδ等转录因子结合位点,其中Sp1为甲基化敏感位点。
 | 图 2 NCOA3启动子区CpG岛(蓝线区域)预测 Fig. 2 Prediction of CpG island(the blue area)in NCOA3 promotor region |
以新淮猪DNA为模板扩增出6段目的片段,分别命名为:pLUC-2062、pLUC-1432、pLUC-1057、pLUC-704、pLUC-340、pLUC-150,连接到pGL3-Basic。经双酶切鉴定(图3)测序，确定载体序列准确无误。
 | 图 3 NCOA3启动子重组质粒的双酶切鉴定 Fig. 3 Recombinant plasmid with NCOA3 promoter identified by double enzyme digestion |
NCOA3上游2 000 bp的6个缺失报告载体的荧光活性检测结果(图4)显示:pLUC-150活性最高,结合生物信息学推测猪的NCOA3基因5′侧翼区核心启动子区位于-150~-3 bp区域内。
 | 图 4 NCOA3系列启动子缺失报告载体的 荧光素酶活性(***P < 0.001) Fig. 4 Series deletion reporter vector luciferase activity of NCOA3 promoter |
猪NCOA3启动子区CpG岛甲基化检测结果(图5)显示:该CpG岛总体甲基化水平在皮下与肌内脂肪组织中分别为83.5%和90.0%,但是差异不显著(P > 0.05)。对CpG岛进行单位点分析结果表明:-904位点甲基化程度在皮下与肌内脂肪组织间差异显著(P < 0.05),其中皮下脂肪的甲基化比例为20%,肌内脂肪甲基化比例为55%。
 | 图 5 NCOA3启动子区域在皮下和肌内脂肪组织中总体甲基化水平(A)和单个甲基化位点的动态变化(B) Fig. 5 The methylation level of NCOA3 promoter(A)and the dynamic changes of individual methylation sites(B)in subcutaneous and intramuscular adipose tissue ●:甲基化位点Methylated site;○:未甲基化Unmethylated site |
为了检测甲基化对NCOA3启动子区活性的影响,利用M.SssⅠ对构建好的质粒pLUC-1057(-1 057~-3 bp)进行体外甲基化处理,利用甲基化敏感性酶HapⅡ(能将未甲基化的CG切开)进行酶切鉴定(图6-A),可以看出甲基化处理成功。进行瞬时转染后,荧光活性检测结果(图6-B)显示:甲基化处理后报告载体荧光活性显著下降(P < 0.05)。
 | 图 6 pLUC-1057体外甲基化的酶切鉴定(A)及DNA体外甲基化对NCOA3启动子活性的影响(B)(*P < 0.05) Fig. 6 The vector pLUC-1057 digested after methylated in vitro(A)and the effect of DNA methylation on NCOA3 promoter activity(B) pLUC-1057-Me:pLUC-1057体外甲基化处理 pLUC-1057 was methylated in vitro |
影响肉质品质的因素很多,其中肌内脂肪含量直接影响猪肉的色泽、风味、嫩度等,而皮下脂肪对猪肉整体风味的贡献非常有限[11],如何降低皮下脂肪沉积的同时增加肌内脂肪的含量成为肉质调控的关键问题。所以,研究肌肉与皮下两个部位的脂肪沉积差异机制对于改善猪肉品质具有重要作用。
脂质生成主要包括脂肪细胞的分化和脂滴的积累,脂肪分化涉及多个基因的转录调控,其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ、增强子结合蛋白家族(CCAAT/enhancer binding proteins,C/EBPs)是脂肪分化过程中关键的转录因子,脂肪分化前期C/EBPβ和C/EBPδ可直接诱导PPARγ的表达,紧接着PPARγ又随同C/EBPs共同促进C/EBPα的表达,C/EBPα又能直接绑定到PPARγ2的启动子上反馈调节并激活其表达,这些对于脂肪分化是必不可少的[12]。另外,转录因子还可通过招募辅激活蛋白,如:P160、CREB结合蛋白等,形成蛋白复合物调控转录因子的转录活性[13, 14]。研究表明:NCOA3(属于P160家族)在前体脂肪分化起始阶段分别通过与C/EBPδ、C/EBPα相互作用促进核受体PPARγ2的表达[3],另外NCOA3通过抑制PPARγ-S114的磷酸化,促进核受体PPARγ的转录活性[6]。本课题组前期研究也发现,NCOA3基因表达与肌内脂肪含量成正相关[15]。鉴于NCOA3在脂肪分化与肌内脂肪沉积中的重要作用,我们比较了NCOA3在皮下脂肪与肌内脂肪中的表达量,发现NCOA3在两组织中的表达量存在显著差异,说明NCOA3参与了脂肪在肌内脂肪与皮下脂肪中的差异沉积，但是NCOA3在脂肪中的转录调控研究鲜有报道。为了研究NCOA3在猪脂肪沉积中的调控作用,我们首先对其启动子进行分析,发现其存在多个Sp1结合位点。Sp1属于锌指DNA绑定蛋白家族的一员,能识别DNA绑定修饰位点GC-box(GGGCGGG)和GT-box(GGTGTGGGG)[16, 17]。它们对于一些不含有TATA框或CAAT框启动子的管家基因和组织特异性基因的表达至关重要[18]。有试验表明Sp1绑定到基因启动子上并正调控基因的表达[19]，但是也有研究表明Sp1具有负调控作用[20, 21]。我们构建了NCOA3启动子区6个缺失报告载体,经双荧光活性鉴定结果显示,-150~-3 bp(pLUC-150)活性最高,生物信息学预测上游-39~-30 bp处有TBP结合位点(TATA框绑定蛋白,是TFⅡD多亚基复合物的一部分,该复合物与RNA聚合酶Ⅱ和其他转录因子结合形成转录的前起始复合物),因此我们推测NCOA3的核心启动子位于-150~-3 bp区域内。另外,含有Sp1结合位点(pLUC-340、pLUC-704、pLUC-1057)区域的荧光活性反而降低,这可能正是Sp1发挥了负调控作用,或是-1 057~-150 bp内包含一些转录抑制因子,这需进一步验证。
DNA CpG岛甲基化是调控基因表达的主要表观调控机制之一[22],且主要通过对启动子区CpG岛的修饰来抑制基因表达。CpG岛即富含CG二核苷酸的区域,一般来说,CpG岛至少含有200 bp碱基,CG含量大于50%,且CpG含量与期望含量的比值大于60%。在正常基因组DNA甲基化中,胞嘧啶仅有3%~6%处于甲基化状态[23]。DNA甲基化抑制基因表达主要通过以下3种方式:一是导致蛋白三维结构发生改变阻碍相关转录蛋白与DNA的结合来抑制基因表达;二是招募可识别甲基化CG位点的转录抑制因子与DNA结合或是募集组蛋白修饰酶形成异染色质结构从而抑制基因表达;三是DNA甲基化与组蛋白修饰相互作用形成静止染色质结构[8]。越来越多的研究表明,DNA甲基化对于脂肪组织的生长发育有重要调控作用。DNA甲基化通过调控脂肪细胞分化过程中转录因子、辅激活因子以及其他有关脂肪分化有关的基因的表达来调控脂肪的生长发育[24]。在脂肪分化的过程中可以观察到DNA的甲基化呈现动态变化[25]。有研究者比较了前体脂肪细胞与成熟脂肪细胞的全基因组DNA甲基化,发现有2 701个基因发生去甲基化,1 070个基因发生甲基化[26]。Fujiki等[27]在研究调控脂肪分化过程的表观调控机制时发现,在饮食诱导的肥胖小鼠与野生型小鼠附睾中,PPARγ上的-437位点甲基化差异影响其mRNA 的表达。因此了解脂肪组织DNA甲基化对脂肪生长发育具有重要意义。NCOA3的甲基化目前还没有报道,利用Methyl Primer Express v1.0软件对NCOA3启动子上游2 000 bp序列进行预测,结果发现在-930~-699 bp处有且仅一个CpG岛,推测该区域的甲基化水平可能导致NCOA3在肌内脂肪与皮下脂肪组织中的表达差异,并做了试验验证。
皮下脂肪组织与肌内脂肪组织的NCOA3基因启动子CpG岛甲基化分析结果显示,两种不同脂肪组织的NCOA3基因启动子CpG岛甲基化水平呈现整体高甲基化状态,但甲基化程度不显著,其中,-904位点的甲基化水平在肌内脂肪组织显著高于皮下脂肪组织(P < 0.05),推测该位点的甲基化可能参与NCOA3在两种脂肪组织的差异表达。因而对NCOA3基因启动子(包含CpG岛)进行体外甲基化处理,发现处理过后其活性显著下降,说明DNA甲基化确实能调控NCOA3启动子活性。同时发现NCOA3启动子区-904位点附近有一转录因子C/EBPδ结合位点(位于-903~-894 bp),其对脂肪分化有重要调控作用。有研究表明,DNA CpG甲基化可以通过阻止转录因子结合来调控基因表达[28],因此,我们推测肌内脂肪与皮下脂肪组织中NCOA3基因启动子区-904位点甲基化水平的差异是否影响C/EBPδ与NCOA3上游调控序列的结合,从而引起NCOA3在皮下脂肪组织和肌内脂肪组织表达差异,其具体机制仍需进一步验证。
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