植物病原细菌的hrp基因簇除负责编码组装Ⅲ型分泌系统(T3SS)调控致病相关基因外,还编码能够激发非寄主或抗性植物过敏反应(hypersensitive response,HR)的非特异性蛋白激发子harpin蛋白。自从1992年韦忠民^[1]首次从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的hrp基因簇中鉴定到harpin_Ea蛋白,并发现harpin_Ea蛋白能够在烟草上激发HR,且激发的HR可以被真核生物代谢抑制剂抑制,随后对harpin蛋白的研究广泛开展起来^{[2, 3, 4]}。

HrpZ蛋白是丁香假单胞菌编码产生的一类harpin蛋白,具有与其他harpin蛋白相似的生物学特性。HrpZ蛋白能够激发烟草HR^{[5, 6, 7]}。HrpZ_Pss能够诱导拟南芥悬浮细胞的防卫反应^{[8, 9]}。HrpZ_Pph在甜菜中内源表达能诱导植株产生系统防卫反应,提高抗丛根病的能力^[10]。HrpZ能够在植物上产生诸多有益生物表型,其分子机制与蛋白的结构和功能密切相关。先前已有报道,HrpZ能够形成二聚体,甚至多聚体^[11]。Alfano等^[12]通过研究HrpZ_Pss部分缺失的突变体,发现C-端216个氨基酸仍有很强的HR激发能力,并证实其中的α-螺旋对HR能力至关重要。He等^[2]研究证明HrpZ_Pss C-端148个氨基酸编码的重组蛋白诱导HR的能力是全长的4倍。Li等^[13]通过构建一系列HrpZ_Pph突变体,对其功能域进行定位,推测C-端负责调控HR功能,Haapalainen等^[14]研究得出HrpZ_Pph靠近C-端区域负责多聚体形成及与膜脂质相互作用,C-端的一段24个氨基酸区域足以诱导烟草产生HR。由此,我们推测,HrpZ蛋白不同区域可能负责不同的生物学效应。

本实验室前期已经从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中克隆到hrpZ_{PsgA 1} 和hrpZ_PsgS1基因(GenBank序列号:HM358042和HM358043),这2个基因核苷酸序列同源性79%,编码的氨基酸序列同源性77%^[7],但这2个HrpZ蛋白在诱导HR的活性上存在差异。进一步的序列分析表明:HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1蛋白在序列上的差异主要集中在C端的3个区域,我们推测这3个区域可能与诱导HR的活性存在一定关系。因此,本研究设计将这2个HrpZ蛋白的3个差异区域分别进行互换,得到相应的重组蛋白,并对重组蛋白诱导烟草HR和抗TMV的活性进行检测,研究此3个差异区域在HrpZ生物活性发挥中所起的作用,为研究丁香假单胞菌harpin类蛋白的结构和功能关系提供基础。

Escherichia coli DH5α和BL21,以及BL21衍生的表达菌株在LB培养基中37 ℃培养。抗生素氨苄青霉素、卡那霉素使用的终质量浓度分别为100 μg·mL^-1和50 μg·mL^-1。本试验中所涉及到的菌株及质粒见表 1。

主要试剂为Ex Taq酶(TaKaRa)、异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)、PBS缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。主要仪器为超声波破碎仪(BRANSON)、蛋白纯化镍柱HisTrap^TMHP(GE Healthcare)、30×10³蛋白超滤离心管(Millipore)。

首先,以本实验室克隆得到的pMHrpZ_PsgA1、pMHrpZ_PsgS1质粒作为模板,以普通PCR和重叠PCR方法分别扩增单片段,然后进行片段融合,最终得到HrpZ_PsgA1与HrpZ_PsgS1 3个差异区域分别互换后的6个重组片段。试验中所用引物见表 2,其中引物F1及F8分别添加了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将纯化得到的6个重组片段PCR 产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,转化子经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切以及测序(南京金斯瑞生物科技有限公司测序)验证正确后,将双酶切回收后的产物克隆到表达载体pET30a(+)上,转入大肠杆菌BL21,得到的转化子利用菌落PCR和双酶切进行验证。同时,全长hrpZ_{PsgA 1}和hrpZ_PsgS1 也克隆到该表达载体并转化宿主菌BL21,作为对照。

8个构建好的蛋白表达载体分别转入宿主菌BL21,得到相应的表达菌株,在28 ℃下,经0.1 mmol·L^-1的IPTG诱导表达4 h后收集菌体,重新悬浮于1/20原菌体培养体积的PBS缓冲液中,经超声波破碎后离心取上清液即为粗提蛋白,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。蛋白纯化使用HisTrap^TMHP镍柱,粗蛋白经10~200 mmol·L^-1梯度浓度咪唑洗脱,洗脱下的纯蛋白使用30×10³蛋白超滤离心管脱盐浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度,所得纯蛋白保存于-70 ℃。

6个HrpZ_Psg重组蛋白及全长对照HrpZ_PsgA1与HrpZ_PsgS1,用灭菌水分别稀释成50、70、100、300和500 μg·mL^-1,注射于烟草叶片中(生长30 d)。每个接种点注射20 μL,每个浓度设3个重复,24 h后观察接种区域的HR表型。

烟草生长至5~6叶期时,以300 μg·mL^-1纯化的重组蛋白HrpZ_Psg及全长对照HrpZ_PsgA1、HrpZ_PsgS1及清水对照预先喷雾处理烟草叶片,12 h后在叶片上摩擦接种烟草花叶病毒(TMV),72 h后调查叶片发病情况^[15],试验设3个重复。诱导抗病效果=(清水处理的烟草叶片平均枯斑数-蛋白HrpZ_Psg处理的烟草叶片平均枯斑数)/清水处理的烟草叶片平均枯斑数×100%。

前期研究表明,HrpZ_PsgS1诱导HR的能力要强于HrpZ_PsgA1,100 μg·mL^-1的HrpZ_PsgS1蛋白能够诱导烟草HR,而同浓度的HrpZ_PsgA1诱导烟草HR能力则丧失(图 1)。对hrpZ_{PsgS 1}和hrpZ_PsgA1 这2个基因的核酸序列分析表明:其差异区域主要集中在C-端的3个区域,分别是597~690、724~753和829~1 014位(hrpZ_{PsgS 1} 的核苷酸顺序)核苷酸(图 2-A)。这2个基因的这3个区域的同源性最高只有70%,低于全长的80%。3个区域对应的3个差异较大的氨基酸序列区域,分别是199~230、242~251和277~338位(hrpZ_{PsgS 1} 的氨基酸顺序)氨基酸(图 2-B),同源性最高只有66%,低于全长的77%,因此我们推测这3个区域与诱导HR的功能有关。结构预测表明:这2个蛋白都含有1个β折叠和9个α-螺旋,3个差异区域主要集中在第6~9个α-螺旋。α-螺旋对于蛋白的活性发挥非常重要,HrpZ_Pph的第7个α-螺旋与多聚体形成有关,而第8、9个α-螺旋与HR有关^[14]。

	图 1 HrpZPsgA1和HrpZPsgS1诱导HR能力差异检测 Fig. 1 The difference of HR detection of HrpZPsgA1 and HrpZPsgS1
图选项

	图 2 HrpZPsgS1和HrpZPsgA1的核酸序列(A)及蛋白序列(B)分析 Fig. 2 Comparative analysis of the nucleotide sequence(A)and the amino sequence(B)of HrpZPsgS1 and HrpZPsgA1 阴影标示的是序列的3个差异区域。3 differential regions are marked by the shadows.
图选项

根据这2个基因的保守和差异区域,以及对应的蛋白序列特征,设计了4对引物,采用常规和重叠PCR 对这2个基因的这3个差异区域进行了互换,得到了6个差异区域互换的重组载体(图 3和图 4)。以互 换HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1的第1个差异区域为例,首先,第1轮扩增的模板分别为pMHrpZ_PsgA1和pMHrpZ_PsgS1,其中引物F1和F2扩增得到第1对片段hrpZ_{A(F 1)}和hrpZ_{S(F1 )}(泳道1,2),大小为585和588 bp,这2个片段是差异区域1的前端序列;F3与F4扩增得到第2对片段hrpZ_{A(D 1)}和hrpZ_{S(D1 )}(泳道3,4),大小为138、150 bp,这2个片段包含差异区域1;F5与F8扩增得到第3对片段hrpZ_{A(R 1)}和hrpZ_{S(R1 )}(泳道5,6),大小为348和351 bp,这2个片段是差异区域1的后端序列。上述所得的第1、第2对,以及第2、第3对片段之间都有一段相同的序列,利用这些相同的序列,采用重叠PCR进行片段融合。然后,在第2轮PCR中先将第2、第3对片段进行融合,分别以hrpZ_{S(D 1)}+hrpZ_A(R1)以及hrpZ_A(D1)+hrpZ_{S(R1 )}为模板,引物为F3和F8,得到片段hrpZ_{S(D 1)+A(R1)}和hrpZ_{A(D1)+S(R1 )}(泳道7,8),大小为498和489 bp。最后进行第3轮PCR,扩增模板分别为hrpZ_{A(F 1)}+hrpZ_S(D1)+A(R1),以及hrpZ_S(F1)+hrpZ_{A(D1)+S(R1 )},引物为F1和F8,得到的最终差异区域1的互换片段hrpZ_{A(A 1→S1)}和hrpZ_{S(S1→A1 )}(泳道9,10)。采用相同的方法构建差异区域2和3的互换片段(图 3)。将纯化得到的6个重组片段克隆到pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌DH5α 中,转化子经测序等验证正确后,将相应的片段克隆到表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,再经菌落PCR验证正确后,最终得到6个片段互换的表达载体。同时,全长hrpZ_{PsgA 1}和hrpZ_PsgS1 也克隆到该表达载体的相同酶切位点,作为对照。所有表达载体均转化到表达宿主菌BL21中,用于表达重组蛋白。

图 3 HrpZPsgA1与HrpZPsgS1互换的重组片段扩增 Fig. 3 Amplification of recombinant framents of HrpZPsgA1and HrpZPsgS1 M.DNA marker DL2000;1.hrpZA(F 1 );2.hrpZS(F 1 );3.hrpZA(D 1 );4.hrpZS(D 1 );5.hrpZA(R 1 );6.hrpZS(R 1 );7.hrpZS(D 1 )+A(R 1 );8.hrpZA(D 1 )+S(R 1 );9.hrpZA(A 1→S1 );10.hrpZS(S 1→A1 );11.hrpZA(F 2 );12.hrpZS(F 2 );13.hrpZA(D 2 );14.hrpZS(D 2 );15.hrpZA(R 2 );16.hrpZS(R 2 );17.hrpZS(D 2)+A(R2 );18.hrpZA(D 2)+S(R2 );19.hrpZA(A 2→S2 );20.hrpZS(S 2→A2 );21.hrpZA(F 3 );22.hrpZS(F 3 );23.hrpZA(R 3 );24.hrpZS(R 3 );25.hrpZA(A 3→S3 );26.hrpZS(S 3→A3 )

图选项

	图 4 HrpZPsgA1与HrpZPsgS1互换的重组质粒菌落PCR验证 Fig. 4 The colony PCR analysis of recombinant expression plasmids of HrpZPsgA1 and HrpZPsgS1 M.DNA marker DL2000;1.hrpZA(A 1→S1 );2.hrpZS(S 1→A1 );3.hrpZA(A 2→S2 );4.hrpZS(S 2→A2 );5.hrpZA(A 3→S3 );6.hrpZS(S 3→A3 );7.hrpZPsgA 1 ;8.hrpZPsgS 1 ;9.Control
图选项

含有相应表达载体的宿主菌BL21,用0.1 mmol·L^-1的IPTG 诱导之后,利用SDS-PAGE电泳进行检测。结果表明:28 ℃下6个重组蛋白及全长对照都能够被诱导表达,融合蛋白大小约为41×10³(图 5-A),与理论值相符。利用HisTrapHP镍柱进行纯化,电泳检测结果表明:在相对分子质量为41×10³处有单一条带,即为纯化的重组蛋白(图 5-B)。纯蛋白经超滤浓缩后,用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质量浓度约为5 mg·mL^-1。

	图 5 SDS-PAGE电泳检测HrpZPsg重组载体诱导蛋白表达(A)及蛋白纯化(B)结果 Fig. 5 SDS-PAGE detection of the expression(A)and purification(B)of the recombinant proteins M.Marker;1.HrpZA(A1→S1);2.HrpZS(S1→A1);3.HrpZA(A2→S2);4.HrpZS(S2→A2);5.HrpZA(A3→S3);6.HrpZS(S3→A3);7.HrpZPsgA1;8.HrpZPsgS1;9.pET30a(+)
图选项

6个重组蛋白及全长对照HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1分别稀释成不同浓度,检测在烟草上诱导HR能力。检测结果表明:全长对照HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1能够诱导HR反应的最低浓度分别是300、100 μg·mL^-1;与全长对照相比,除置换了第1个差异区域的重组蛋白HrpZ_A(A1→S1)过敏反应能力丧失之外,其他重组蛋白均能引起与全长相当或强于全长的过敏反应(图 6)。其中,HrpZ_S(S2→A2)和HrpZ_A(A3→S3)与全长相比,诱导HR的能力增强,并且诱导浓度更低(图 6)。这2个重组蛋白分别为HrpZ_PsgS1和HrpZ_PsgA1置换了第2、3个差异区域,在二级结构预测中,这2个区域包括第7、8、9个α螺旋。这说明,丁香假单胞大豆致病变种的HrpZ_Psg蛋白过敏反应能力调控区域主要为C-端第7、8、9个α螺旋。

	图 6 HrpZPsg重组蛋白在烟草上激发的HR Fig. 6 HR triggered by recombinant proteins in tobacco
图选项

经300 μg·mL^-1纯化的HrpZ_Psg重组蛋白及全长对照HrpZ_PsgA1、HrpZ_PsgS1及清水对照预先喷雾处理的烟草叶片,接种TMV后的发病统计结果表明,与清水处理相比,全长对照HrpZ_PsgA1、HrpZ_PsgS1及所有6个重组蛋白都能有效提高烟草对TMV的抗病效果,病斑数明显减少。并且6个重组蛋白的诱导抗病效果明显高于全长对照,诱导效果分别能达到72.64%、59.9%、67.5%、58.02%、85.38%和83.02%,与全长对照29.7%、21.5%存在显著性差异(图 7)。其中,置换了第3个差异区域(负责编码第8、9个α螺旋区域)的重组蛋白HrpZ_A(A3→S3)和HrpZ_S(S3→A3),诱导抗病效果最显著,可达到80%以上,说明C-端第8、9个α螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关,C-端此区域改变后,显著增强了植物的防卫反应。

	图 7 HrpZPsg重组蛋白在烟草上诱导抗TMV能力检测 Fig. 7 The detection of induction effects of tobacco resistance to TMV 不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。The different small letters mean significant difference at 0.05 level.
图选项

本试验以丁香假单胞大豆致病变种HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1蛋白为研究基础,序列比对发现两者核苷酸及氨基酸存在3个差异区域,并设计试验将此3个差异区域在HrpZ_PsgA1和HrpZ_PsgS1之间分别进行互换,最终获得相应的6个重组蛋白。烟草上激发HR能力检测结果表明:置换了C-端第2、3个差异区域(二级结构中负责编码第7、8、9个α-螺旋)的重组蛋白HrpZ_S(S2→A2)和HrpZ_A(A3→S3),HR能力较全长相比都有不同程度的增强。在烟草上诱导抗TMV结果表明:置换了C-端第3个差异区域(负责编码第8、9个α-螺旋)的重组蛋白HrpZ_A(A3→S3)和HrpZ_S(S3→A3)诱导抗病效果显著高于全长对照。因此,本试验证明丁香假单胞大豆致病的HrpZ_Psg蛋白C-端与诱导非寄主植物HR能力及防卫反应密切相关,为研究丁香假单胞菌harpin类蛋白的结构和功能关系提供基础。

关于HrpZ蛋白HR能力和抗病相关功能域研究最透彻的是HrpZPph,Li等^[13]及Haapalainen等^[14]认为过敏反应活性是由C-端区域决定的,Haapalainen等推测第254~298位氨基酸(二级结构中编码第7、8个α-螺旋)可能形成C-端的核心,303~335位氨基酸(二级结构中编码第8个α-螺旋)足以引起明显的HR反应,并且这一段序列在丁香假单胞不同致病变种中高度保守。序列分析发现,HrpZ_PsgS1与HrpZ_Pph蛋白相似性为99%。本研究中互换了C-端第2、3段差异区域后,HR能力均表现不同程度增强,证明了HrpZ_Psg的C-端第7、8、9个α-螺旋确实与HR密切相关,其内在机制值得进一步的研究探讨。同时,防卫反应与HR能力密切相关,分别是植物抵抗病原菌侵染的两种应激策略,在时间上表现出一定的先后性,并且在信号通路研究上,harpin作为激发子同时能够激活HR信号通路和SAR通路,相关标志基因都能显著上调表达^{[16, 17, 18, 19]}。后续试验将从转录水平检测HR、SAR信号通路相关基因的表达情况,从分子机制方面解释HrpZ_Psg重组蛋白在植物上产生的多种有益表型。

互换了第1段差异区域之后,HrpZ_A(A1→S1)丧失诱导HR产生的能力,但诱导烟草抗TMV能力较全长相比仍明显增强,表明诱导HR能力和抗TMV能力是可以分割开来的两部分,但在烟草上对其识别机制并不清楚。下一步工作将单独克隆表达此段差异区域,对其功能进行分析。如若此短肽片段具有激发HR能力及其他抗病或促生等有益生物学表型,将有望开发为有功能的高效多肽,相对全长,短肽片段节约成本,更利于微生物蛋白农药的产业化。