工农业以及生活废水大量排入江河和湖泊,造成水体富营养化,有害藻类大量繁殖,导致蓝藻水华频繁发生。微囊藻是我国长江流域湖泊水华蓝藻的优势种,可产生微囊藻毒素,对水环境造成严重污染^[1]。为控制有害藻类的生长,我国进行了大量的科研投入。研究显示,植物多酚具有抑菌抑藻的作用^[2]。Nakai等^[3]研究发现穗花狐尾草的提取物中只有分子质量小于1 000的物质具备抑藻功能。HPLC分析显示,提取物中至少含有4种多酚类物质,分别是蹂花酸、没食子酸、连苯三酚和儿茶素。Nakai等^[3]分别对14种植物多酚抑藻效果进行比较研究,结果显示其中有10种植物多酚对铜绿微囊藻产生抑制作用,儿茶素和对苯二酚的EC₅₀值最小。

在前期工作中,我们从常见农作物及茶叶中筛选抑藻材料时,发现茶叶在低浓度时即可对铜绿微囊藻产生持续而高效的抑制效果^[4]。茶多酚(tea polyphenols)是茶叶中多酚类物质的总称,在茶叶中的含量一般为20%~35%。它包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等,其中以黄烷醇类物质(儿茶素)最为重要,约占多酚类总量的60%~80%。儿茶素中含量最高的几种组分为EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯,50%~60%)、EGC(表没食子儿茶素,15%~20%)、ECG(表儿茶素没食子酸酯,10%~15%)和EC(表儿茶素,5%~10%)。我们从茶叶中分离得到抑藻活性物质——EGCG和ECG^[5]。EGCG是没食子儿茶酚与没食子酸形成的酯,它是绿茶主要的活性和水溶性成分,是儿茶素中含量最高的组分,占绿茶毛质量的9%~13%。EGCG含有多个酚羟基,具有很强的抑藻功能,是一种很有潜力的环保抑藻剂。

本研究从藻细胞生物量、细胞形态、细胞生理生化反应等方面探讨和揭示茶多酚EGCG对铜绿微囊藻抑制的机制及藻细胞对酚胁迫的响应。

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7806购自中国科学院武汉水生生物研究所。EGCG(纯度98%)购自南京中标晨曦化学技术有限公司。微囊藻毒素检测试剂盒为美国Beacon公司产品。超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其他生化试剂为国产分析纯。

将对数生长期的M.aeruginosa PCC7806转接到新鲜的BG11培养基^[6]中,初始浓度为5×10⁵ mL^-1。处理组分别加入终质量浓度分别为8、12和16 mg·L^-1 EGCG,对照组不加EGCG,对照及处理各3个重复,放入光照培养箱中培养。培养条件为:光/暗培养时间为12 h/12 h,光照强度为40 μmol·m^-2·s^-1,温度为25 ℃。每2 d取培养液进行显微计数,计算抑制率。

细胞破碎采用超声波法:离心收集后的菌体用无菌水洗涤2次,加入0.01 mol·L^-1 Tris-HCl(含0.5% Triton)缓冲液,冰浴超声破碎(超声5 s,间隙5 s,共5 min,重复3次)。离心后,上清液用于酶活性和化学物质含量测定。

藻细胞光合作用检测采用叶绿素荧光仪(PHYTO-PAM,Becton-Dickinson,USA)。藻液暗适应15 min后测定F_o(暗适应后最小荧光产量),执行饱和脉冲后测定F_m(暗适应后最大荧光产量),根据F_m和F_o可以计算出PS Ⅱ的最大量子产量(F_v/F_m):F_v/F_m=(F_m-F_o)/F_m,它反映了细胞的潜在最大光合能力。然后打开光化光(光照强度为64 μmol·m^-2·s^-1),在光照下测定F′ _o(光下最小荧光产量)、F′ _m(光下最大荧光产量)和实时荧光值F,根据F′ _m和F可以求出在当前的光照状态下PS Ⅱ的实际量子产量:Y(Ⅱ)=ΔF/F′ _m=(F′ _m-F)/F′ _m,它反映了细胞目前的实际光合效率^{[7, 8]}。根据PS Ⅱ的实际量子产量ΔF/F′ _m和光合有效辐射(photosynthetically active radiation,PAR)还可计算出光合最大电子传递速率(ETR):ETR=ΔF/F′ _m×PAR×0.84×0.5。

将12和16 mg·L^-1的EGCG处理2 d后的藻细胞收集,甲醛固定,然后进行电镜制样(由南京农业大学生物学教学实验中心完成)并在透射电子显微镜(transmission electric microscope,TEM)下观测。

藻细胞丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法:细胞破碎后取上清液150 μL,加入0.5% TBA溶液(溶于20%三氯乙酸)250 μL,沸水浴上反应20 min,冷却后离心。取上清液分别于532、600和450 nm波长下测定吸光值(A)。c(MDA)=6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀。

SOD活性的测定采用超氧化物歧化酶测定试剂盒,按说明书进行:在酶标板对照孔和对照空白孔中分别加入20 μL双蒸水,在测定孔和测定空白孔中分别加入20 μL待测样本,然后在对照孔和测定孔中分别加入20 μL酶工作液,在对照空白孔和测定空白孔中加入20 μL酶稀释液,最后在所有孔中加入200 μL底物应用液。混匀,37 ℃孵育20 min,根据公式计算样品浓度。SOD抑制率=[(A_对照-A_对照空白)-(A_测定-A_测定空白)]/(A_对照-A_对照空白)×100%。定义:在反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。

取对数生长期的新鲜铜绿微囊藻培养液,用BG11培养基稀释到5×10⁵ mL^-1。处理组中加入12 mg·L^-1 EGCG,再分别加入质量浓度为0、10、20和50 mg·L^-1 Vc。分别于处理2 、4 、6 、8 和10 d后用流式细胞仪计数。

取对数生长期的新鲜铜绿微囊藻培养液,用BG11培养基稀释到5×10⁵ mL^-1。设对照、低浓度处理组(8 mg·L^-1)和高浓度处理组(16 mg·L^-1),分别处理4 和8 d后取10 mL藻液离心,保存1 mL上清液,并收集藻细胞。用无菌水洗涤藻细胞2次后进行超声波破碎,离心后收集上清液来测定细胞内藻毒素含量。藻毒素含量测定采用微囊藻毒素检测试剂盒,按以下步骤进行:加50 μL酶标记物到微孔板中,然后加入阴性对照,各浓度标准品,稀释好的胞内、外溶液,再加入50 μL抗体后孵育30 min。倒掉孵育液,用清洗液洗涤5次后加入100 μL底物,再孵育30 min后终止反应。测定各孔内450 nm处的吸光值。用标准品作标准曲线,然后计算样品浓度。

试验数据为3次重复平均值,表示为平均数±标准误(SE)。采用t测验比较组间差异。

处理组微囊藻的生长与对照相比受到抑制(图 1-A)。8 mg·L^-1 EGCG胁迫下,藻细胞的生长抑制率为40%左右,12 mg·L^-1 EGCG对藻的抑制率达到80%以上(图 1-B),而在16 mg·L^-1 EGCG中藻基本不能生长,很快黄化死亡。

	图 1 不同质量浓度表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理下铜绿微囊藻 PCC7806生长曲线(A)及抑制率(B) Fig. 1 Growth curves of M.aeruginosa PCC7806(A)and the inhibitory rate(B) under different concentrations of epigalloctechin-3-gallate(EGCG)
图选项

8 mg·L^-1 EGCG对藻细胞的光合作用效率没有显著影响(P>0.05),12 mg·L^-1 EGCG抑制藻细胞的光合作用,抑制率为20%(4 d),16 mg·L^-1 EGCG对藻细胞的光合作用影响非常显著(P < 0.01),光合作用效率仅为对照的40%左右(图 2-A)。

	图 2 不同质量浓度EGCG处理下M.aeruginosa PCC7806的Y(Ⅱ)值(A)及最大电子传递速率(B) Fig. 2 The value of Y(Ⅱ)(A)and ETR(B)of M.aeruginosa PCC7806 under different concentrations of EGCG
图选项

与对照相比,8 mg·L^-1 EGCG对藻细胞最大电子传递速率的影响不显著(P>0.05)。中、高浓度的EGCG对藻细胞最大电子传递速率存在明显影响(图 2-B):处理4 d时,12 mg·L^-1 EGCG处理下最大电子传递速率为对照的85%,16 mg·L^-1 EGCG处理下最大电子传递速率为对照的23%。由此可以看出,高浓度EGCG对藻细胞的光合作用产生较大的破坏作用,从而起到抑藻的功效。

由于细胞处于对数生长前期,对照中几乎所有的细胞都饱满圆润,结构完整,能清晰地看到细胞内的类囊体结构(图 3-A)。在12 mg·L^-1 EGCG胁迫下的藻细胞,出现了细胞形态特征的变化(图 3-B):类囊体结构变得松散、断裂。高浓度EGCG胁迫下的藻细胞结构遭到很大程度的破坏:细胞壁、细胞膜破损皱缩,类囊体结构严重断裂、破损,已经不再具有完整的细胞结构(图 3-C)。这些破损的细胞不再具有生长和繁殖能力,或者说细胞已经死亡,进一步的培养也不会有子细胞的出现,培养液中的生物量维持在很低的程度,这与细胞计数的结果相吻合。

	图 3 不同浓度EGCG处理下M.aeruginosa PCC7806透射电子显微镜图 Fig. 3 TEM images of M.aeruginosa PCC7806 under different concentrations of EGCG A.对照 Control cells;B. 12 mg·L-1 EGCG 处理 Treated with 12 mg·L-1 EGCG;C. 16 mg·L-1 EGCG处理 Treated with 16 mg·L-1 EGCG CW:细胞壁 Cell wall;PM:细胞膜 Plasma membrane;Thy:类囊体 Thylakoids
图选项

植物多酚在偏碱性条件下具有自氧化特性,会发生自氧化而生成自由基,研究发现在二价或三价离子如Mg²⁺存在下多酚会生成半醌。由于自由基的强氧化作用,可引起藻细胞内的抗氧化反应。当胁迫程度超过细胞耐受极限时,细胞会裂解或死亡。氧化胁迫还会引起藻细胞膜过氧化程度加剧,过氧化反应会产生大量的丙二醛(MDA)和新的氧自由基等^[9]。

由图 4可知:随着EGCG浓度的增大,细胞中MDA的含量在不断上升。4 d时,12和16 mg·L^-1 EGCG处理下,藻细胞内MDA含量分别为对照的4.4和6.4倍;16 mg·L^-1 EGCG处理6 d后,培养液中的藻细胞几乎死亡,已检测不到MDA。MDA具有强交联性,它可使蛋白质、核酸等交联成shchiff碱,使蛋白质分子变性失活^[10]。这是EGCG抑制微囊藻细胞生长的一个重要原因。

	图 4 不同质量浓度EGCG处理下细胞内丙二醛含量的变化 Fig. 4 The changes of MDA content under different concentrations of EGCG
图选项

随着EGCG质量浓度的增大,细胞中SOD活性在不断上升(图 5)。在12和16 mg·L^-1 EGCG作用下,SOD活性显著大于对照。处理4 d时,16 mg·L^-1 EGCG作用下SOD活性为对照的20倍。SOD是生物体内重要的抗氧化酶,当细胞受到氧化胁迫时,细胞内SOD的水平会提高,以减少细胞内的有害的氧自由基。当氧化胁迫超过细胞耐受的极限时,细胞可能会死亡、裂解。

	图 5 不同质量浓度EGCG处理下细胞内 SOD活性 Fig. 5 SOD activity under different concentrations of EGCG
图选项

在12 mg·L^-1 EGCG存在时,藻细胞生长受到抑制。加入Vc 后,藻生长受抑制的程度减轻(图 6)。10和20 mg·L^-1 Vc提高了EGCG胁迫下藻细胞的存活率,20 mg·L^-1 Vc的作用更为显著。Vc是一种抗氧化的有机化合物,能减轻氧化胁迫,因此Vc对EGCG胁迫下藻细胞受损的缓解作用也佐证了EGCG对藻细胞的氧化胁迫损伤。然而过高浓度的Vc也会产生毒害作用。试验结果显示50 mg·L^-1 Vc抑制了藻的生长。10 d时,对藻细胞的生长抑制达到90%以上,同时在培养液内发现了灰色沉淀物。这可能是由于高浓度的Vc与培养基发生反应,或干扰了藻细胞的正常代谢。

	图 6 不同质量浓度Vc对EGCG胁迫下M.aeruginosaPCC7806生长的影响 Fig. 6 The effects of different concentrations of Vc on the growth of M.aeruginosa PCC7806 under EGCG stress
图选项

对EGCG处理4 和8 d的藻培养液以及藻细胞内的微囊藻毒素进行了测定,结果如表 1。培养4 d时,培养液中的藻毒素含量在对照组和处理组之间没有明显差异,处理组细胞内藻毒素总量比对照组大幅度下降。培养8 d时,高浓度处理组胞外藻毒素与对照相比显著下降(P < 0.05),胞内的藻毒素含量都显著低于对照组。加入EGCG处理后培养液中藻细胞数比对照组明显减少,但培养液中藻毒素浓度无明星差异,可能是因为处理后部分细胞裂解导致胞外藻毒素含量增加。单位细胞内藻毒素的含量在对照组和处理组之间的差异不显著。Lu等^[11]通过荧光定量研究发现EGCG对藻毒素合成酶基因的表达无显著影响,本试验结果与其一致。

目前,对植物多酚抑藻的机制还不完全清楚,其抑制作用可能通过多种方式实现。植物多酚可与细胞膜蛋白结合,破坏生物体细胞膜结构,使植物多酚物质进一步穿过细胞膜,进入细胞体内^[12]。多酚还能影响藻细胞的光合系统。当多酚类物质穿过细胞膜后,将干扰细胞内电子传递过程,对藻细胞的光合系统以及光合作用过程产生干扰,从而抑制藻的活性^{[13, 14]}。还有研究者认为,植物多酚的抑藻作用可能来自植物多酚在环境中的氧化还原产物。在碱性条件下,多酚易被氧化成醌类化合物,而醌类化合物的抑藻作用明显强于植物多酚^[15]。另外植物多酚在偏碱性条件下具有自氧化反应,会发生自氧化而生成自由基,而自由基的强氧化作用会破坏细胞结构^{[16, 17]}。

EGCG是茶叶内含量最丰富的茶多酚,分子共有8个酚羟基,其中6个是处于邻位的,另2个是间位的。EGCG对铜绿微囊藻生长的抑制效果非常明显。本研究结果显示,EGCG处理的藻液生物量增长缓慢,细胞黄化并且聚集成团沉底,说明细胞受到了损伤。在电子显微镜下观测,处理后的细胞细胞壁破损,胞内类囊体结构松散或断裂。高浓度EGCG处理后受损细胞的比例大,且受损严重。光合作用是蓝藻细胞最重要的生命活动过程和特征之一,也是化感物质攻击的主要目标。叶绿素荧光仪检测显示,处理后藻细胞的光合效率显著下降,电子传递速率也显著下降。氧化胁迫也是酚类物质对蓝藻细胞生长抑制的一个常见机制^[18]。EGCG处理后,细胞的MDA含量显著增加,说明藻细胞膜过氧化程度加剧。MDA 具有强交联性,它可使蛋白质、核酸等交联成shchiff 碱,使蛋白质分子变性失活。同样,细胞内SOD活性在受到多酚胁迫时显著提高,是细胞抵御外来胁迫的一个机制,利用提高酶表达量来分解体内的氧化性物质。和其他化感物质一样,EGCG从多个方面对M.aeruginosa的生长和繁殖产生影响,主要表现在破坏细胞结构、产生氧化胁迫和对光合作用的抑制。

在后续试验中,我们已尝试将茶多酚抑藻应用到湖泊水体中。结果显示,对于湖泊水体中的蓝藻同样具有良好的抑制作用(资料未发表)。茶多酚投入水体,会加深水体颜色。但随着其代谢分解,水体颜色会逐渐恢复。茶多酚在水中的代谢途径还有待进一步研究。