中药板蓝根与大青叶分别来自十字花科菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的根与叶^[1]。板蓝根具有清热解毒、凉血利咽的功效;大青叶具有凉血消斑、清肝泻火、定惊的功效。作为大宗药材的板蓝根,其化学成分^{[2, 3]}、药理活性^{[4, 5]}和临床应用^{[6, 7]}等方面的研究非常多,并且对于其原植物菘蓝的栽培生产研究也日益增多,尤其是栽培过程中影响其产量的氮素研究受到更多的关注。晏枫霞等^[8]研究表明:铵态氮促进氮、磷的积累,硝态氮促进钾、镁的积累;提高铵态氮的比例有利于菘蓝叶片靛玉红的积累,全硝营养时靛蓝含量最高。郭庆海等^[9]研究表明:菘蓝营养生长各阶段对氮、磷、钾需求不同,营养生长后期氮、磷、钾的共同作用对菘蓝生物量积累有重要影响,且根冠比以低氮水平下较高。温春秀等^[10]研究表明大青叶与板蓝根产量随着氮肥用量的增加而增加,氮的合理用量为150 kg·hm^-2。肖云华等^[11]研究了铵态氮、硝态氮与酰胺态氮3种氮素形态对大青叶成分的影响,结果表明菘蓝生长前期施用适宜组合的氮素是以促生长为主。对3种不同氮素形态及不同的浓度配比对菘蓝生长后期采收入药时的地上与地下生长及活性成分含量的影响尚无研究报道。本文在前期研究的基础上,以铵态氮、硝态氮和酰胺态氮3种形态及其不同浓度配比设计正交试验,以叶和根的生物量、叶片靛蓝、靛玉红与总生物碱含量、根系(R,S)-告依春和多糖含量为指标,研究板蓝根与大青叶对不同形态氮素的响应,探究适合菘蓝生长及药材有效成分积累的最佳氮素形态及其浓度配比,为氮素的高效利用和提高板蓝根与大青叶的经济产量和药用成分积累提供理论依据。

试验材料为十字花科菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的果实。采用盆栽(外口径44 cm,底直径30 cm,高35 cm),栽培基质为蛭石和珍珠岩按2: 1的比例混合而成,于2013年4月26日播种,砂培的基本营养液配方中大量元素和微量元素均采用霍格兰营养液配方,pH6.0。处理营养液是在基本营养液的基础上去除所含氮元素配制而成,pH6.0。处理液中铵态氮(NH⁺₄-N)由(NH₄)₂SO₄提供,硝态氮(NO^-₃-N)由KNO₃提供,酰胺态氮(CO(NH₂)₂-N)由纯脲(CO(NH₂)₂)提供。所有处理液中加入双氰胺(DCD),用量是处理液中纯氮含量的0.4%。所用试剂均为分析纯(AR)。于12月5日采样,分析不同处理下菘蓝地上与地下部分生长状况与有效成分的积累情况。

采用L₂₅(5⁶)三因素五水平实验设计(不考虑各因素之间的互作),各处理重复3次,随机区组排列。待菘蓝幼苗4~5片真叶时间苗,每盆保留长势一致的植株10株,于6月25日第1次浇灌基本营养液,之后每隔10 d浇灌1次基本营养液,每次1 L。7月14日即播种40 d后开始处理,每10 d浇灌1次处理液,每10 d浇灌1次处理营养液,处理液和处理营养液相隔5 d交错进行。各处理水平见表 1,正交设计水平见表 2。

采样后将植株用蒸馏水洗净、擦干,称量单株鲜质量,每个处理取10株,计算其平均单株质量,然后将其分成地上和地下两部分,分别称质量,计算根冠比。在105 ℃条件下杀青5 min,并于60 ℃条件下烘至恒质量,粉碎并过60目筛,备用。

叶中靛蓝与靛玉红含量参照文献^[1]的方法测定。色谱条件:Waters 2695高效液相色谱仪:四元泵,在线脱气,自动进样器,Waters 2998 DAD检测器,Empower 2色谱工作站;柱温箱柱温40 ℃;流动相为甲醇-水(体积比75: 25);检测温度25 ℃;检测波长289 nm。在此色谱条件下,理论塔板数以靛玉红计,不低于4 000。

标准曲线制备:精确称取靛蓝0.001 g、靛玉红0.002 g,分别用甲醇溶解后定容至50 mL,摇匀,微孔滤膜(0.45 μm)滤过。吸取靛蓝、靛玉红标准溶液2、4、8、16和20 μL注入Waters 2695高效液相色谱仪中,记录色谱图。以色谱峰面积(Y)和对应的质量浓度(X,g·mL^-1)作标准曲线,计算得靛蓝的回归方程为Y_靛蓝=123.56X-5 420,r=0.999 8(n=3),线性范围为60~800 μg;靛玉红的回归方程为Y_靛玉红=4 874.7X-25 682,r=0.999 6(n=3),线性范围为12~200 μg。

样品含量测定:样品溶液的提取参照药典的方法,定容后溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后,用微量进样器吸取20 μL注入高效液相色谱仪测定,以色谱峰面积和标准曲线计算样品中靛蓝、靛玉红的含量。

采用酸性染料比色法^[12]进行测定。

对照品溶液的制备:取靛玉红适量,精确称取,加氯仿制成每1 mL含20 μg的溶液。分别取0、2、4、8、10、15、20和40 mL定容至50 mL容量瓶,即得0、0.8、1.6、3.2、4、6、8和16 μg·mL^-1的供试液。取供试液10 mL至分液漏斗中,依次加入缓冲液5 mL,溴酚蓝1 mL,振摇1 min使充分反应,静置1 h后分取氯仿层,289 nm下测定吸光值。以吸光度(Y)和对应的总生物碱含量(X,μg·g^-1)作标准曲线,计算得总生物碱的回归方程为Y=0.010 2X-0.014 8,r=0.999 2(n=3),线性范围为8~160 μg。

样品溶液的制备与测定：精确称取各样品粉末0.155 0 g,置离心管中,加入浓氨水0.5 mL,充分摇匀,再加入氯仿10 mL,冷浸3 h后超声提取1 h,6 000 r·min^-1离心20 min;取上清液于35 ℃旋蒸去除氯仿,得到总生物碱提取物,以氯仿分次溶解该提取物,并转移至50 mL容量瓶内定容,作为样品溶液;另取分液漏斗依次加入10 mL样品溶液、缓冲液5 mL和溴酚蓝1 mL,振摇1 min使其充分反应,静置1 h后分取氯仿层,于289 nm下比色,根据回归方程计算得到总生物碱含量。

根中(R,S)-告依春含量参照文献^[1]的方法测定。色谱条件:仪器同靛玉红测定,以甲醇和0.02%磷酸溶液(体积比为7: 93)为流动相;检测波长245 nm。在此色谱条件下,理论塔板数以(R,S)-告依春计,不低于5 000。

对照品溶液的制备:精确称取(R,S)-告依春对照品适量,加甲醇制成每1 mL含40 μg的对照品溶液。分别吸取2、4、8、16和20 μL注入高效液相色谱仪中,记录色谱图。以色谱峰面积(Y)和对应的浓度(X,g·mL^-1)作标准曲线,计算得(R,S)-告依春的回归方程为Y=6 952.7X+190 000,r=0.999 2(n=3),线性范围为80~800 μg。

样品溶液的制备:样品溶液的提取参照药典的方法,定容后经0.45 μm微孔滤膜滤过,分别吸取对照品溶液与样品溶液各20 μL,注入液相色谱仪测定,以色谱峰面积和标准曲线计算样品中(R,S)-告依春的含量。

采用苯酚-浓硫酸法^[12]进行测定。

所有数据采用Excel 2007软件和DPS 3.01软件进行处理与分析,差异显著性检验采用Duncan′s新复极差法。

由表 3可见:不施用任何氮素(对照)的菘蓝生长较差,平均单株鲜质量仅8.08 g,而不同形态及不同浓度氮素处理后菘蓝叶与根的单株鲜质量均显著高于对照(P < 0.05),其平均单株鲜质量、叶鲜质量与根鲜质量最大的均为处理8,分别为107.5、66.59和40.91 g,显著高于对照与其他处理。表 4显示:硝态氮对菘蓝叶与根鲜质量影响最显著,其次是铵态氮与酰胺态氮。根冠比分析显示,对照的根冠比最大(1.89),显著高于其他处理,究其原因为长时间缺乏氮素营养,导致其地上的生长势弱。对根冠比影响最显著的氮素形态依次为硝态氮、铵态氮与酰胺态氮。根冠比大于1.0的处理为6、11、12和16,其中处理6、11和16中硝态氮均为0 mmol·L^-1,但其菘蓝单株鲜质量却远远低于处理8,且与处理8差异显著,说明硝态氮对菘蓝地上部分生长有显著的影响,与直观分析结果对根冠比影响最显著的为硝态氮是一致的。

由表 5可见:3种形态氮素处理后菘蓝叶片的靛蓝含量多数都小于对照,仅处理2的靛蓝含量高于对照,为最高。除处理2、12与对照间差异不显著外,其余处理与对照均差异显著,且差异较大的前3位为处理2、12和9。

各处理叶片靛玉红含量均低于对照,差异较大的前3位为处理3、2和9,分别为0.21、0.20和0.17 mg·g^-1;除处理3与对照间无显著差异外,其余处理叶片靛玉红含量与对照间均差异显著。菘蓝叶片总生物碱含量均高于对照,且与对照间差异显著,差异较大的前3位为处理8(34.48 mg·g^-1)、处理9(25.59 mg·g^-1)和处理15(21.48 mg·g^-1)。菘蓝叶片靛蓝、靛玉红与总生物碱含量的分析结果 (表 6)表明,氮素形 态对靛蓝、靛玉红的影响是一致的,即从大到小为铵态氮、硝态氮、酰胺态氮,对总生物碱含量影响最显著的也是铵态氮,其次是酰胺态氮和硝态氮。综上分析发现,处理9(铵态氮为2.5 mmol·L^-1,硝态氮为7.5 mmol·L^-1,酰胺态氮为0 mmol·L^-1)的靛蓝、靛玉红与总生物碱含量均有较高的值,说明菘蓝叶片靛蓝、靛玉红等生物碱类对铵态氮与硝态氮有明显的响应。

由表 5可见:处理8、24、12、25的根系(R,S)-告依春含量均大于对照,其中处理8含量最大(2.26 mg·g^-1),而其他处理的(R,S)-告依春含量均低于对照。表 7显示:硝态氮对(R,S)-告依春的影响最大,其次为铵态氮、酰胺态氮。各处理根系多糖含量对氮素的响应则与(R,S)-告依春的不同,所有处理根系多糖含量均高于对照,其中前3位为处理24、20和22,多糖含量分别为152.85、150.88和150.26 mg·g^-1。表 7还显示:铵态氮对根内多糖含量的影响最大,其次是硝态氮、酰胺态氮。

综合分析表明:处理8根系的(R,S)-告依春累积量最大(92.46 mg),显著高于处理4;处理4虽然叶片靛玉红累积量最大,但与处理8差异不显著,因此认为处理8为最佳组合(铵态氮为2.5 mmol·L^-1、硝态氮为5.0 mmol·L^-1、酰胺态氮为10.0 mmol·L^-1)。该处理组合下既能获得较高的大青叶与板蓝根的生物量,又能获得更高的药用成分含量。

氮素作为一种植物生长必需的营养物质,对植物代谢和生长有重要作用^[13]。目前有许多研究涉及到不同氮素形态及不同浓度的配比对作物的生长发育、有效成分含量及作物产量的影响。研究表明:硝态氮、铵态氮、酰胺态氮及硝态氮与铵态氮配施均可在一定程度上促进川芎的生长,延长其根长,增加茎蘖数和干物质积累,从而显著提高川芎的产量^[14];张朋等^[15]研究表明:NH⁺₄-N和NO^-₃-N质量比为25: 75时较利于杭白菊的生长及品质提升;在总氮水平为15 mmol·L^-1下,适量增加硝态氮比例,有利于促进夏枯草苗期生长、提高干物质积累和净光合速率^[16]。本研究中,硝态氮对菘蓝叶片与根系的鲜质量、根冠比影响最显著,NH⁺₄-N、NO^-₃-N和CO(NH₂)₂-N的浓度比为1: 2: 4(处理8)的叶片和根系鲜质量最大,这与张朋等^[15]的研究结果类似,说明硝态氮更易为菘蓝吸收利用,同时配合施用有机氮(纯脲)更有利于菘蓝叶片与根系鲜质量的积累,从而提高了其作为大青叶与板蓝根的药用产量。而菘蓝生长前期酰胺态氮对叶片的生物量影响最大^[11],说明菘蓝在生长过程中不同阶段对氮素形态的需求是不同的,在生产中,还需要结合氮素对其功能叶片的叶绿素和光合效率等生理指标开展进一步的研究,以明确氮素对其生长调节的机制。

在菘蓝栽培生产中,药农更多关心药材产量,在栽培管理过程中多注重增施氮肥以增加产量,但对其活性成分指标关注不足。目前有许多研究涉及到了药用植物栽培生产中氮素营养对其生理及活性成分的影响。胡龙娇等^[17]研究发现,在全硝态氮营养下,块茎中半夏总生物碱和鸟苷质量分数最高;李霞等^[18]研究表明:高比例的NO^-₃-N更有利于黄连根与茎中小檗碱的积累;何忠俊等^[19]研究表明:综合考虑滇重楼的生长、根茎质量、总皂甙产量,建议滇重楼施氮以CO(NH₂)₂-N和NO^-₃-N的质量比为6: 4较为适宜。本研究中,不同形态氮素配合施用明显地提高了菘蓝叶片与根系鲜质量,能满足生产上增产的基本要求,但是其叶片和根系活性成分指标则与鲜质量增加不一致,少数组合能增加活性成分含量,多数组合降低了靛蓝、靛玉红与(R,S)-告依春含量。究其原因可能与菘蓝对氮素的需求水平相关。靛蓝、靛玉红等生物碱类成分为菘蓝的次生代谢产物,在低于或高于菘蓝正常生长所需氮营养水平的逆境条件下,其体内次生代谢得以强化,由此出现缺氮的对照靛蓝、靛玉红及(R,S)-告依春含量均高于多数氮素处理组合。而在菘蓝生长幼苗期的处理中,菘蓝对氮素需求相对较高,表现为氮素处理后靛蓝、靛玉红含量均高于对照^[11]。这说明菘蓝生长过程中,不同阶段的代谢有很大差异,对氮素需求也不同,前期需要足量的氮素,后期为保证药用活性成分含量,需要适当地减少氮素营养。而氮素对菘蓝促生长与活性成分积累的影响如何达到最佳,还需要进一步的研究。