酸雨是我国主要的环境问题,《中国环境状况公报》显示,2013年全国污染总体稳定,但程度依然较重,酸雨区面积约占国土面积的10.6%,酸雨分布区域主要集中在长江沿线及中下游以南^[1]。长江中下游地区冬小麦种植广泛,其开花灌浆期是酸雨发生较严重的时期^[2],容易遭受酸雨危害。同时我国南方地区春季雨水较多^[3],导致该区小麦容易遭受酸雨和渍水双重胁迫。酸雨会直接破坏植物叶片,改变叶肉细胞的内在结构,导致叶片产生肉眼可见伤斑^[4],叶绿素含量降低,影响植株的光合能力和物质合成^{[5, 6]}。渍水胁迫造成土壤缺氧使小麦根系吸收能力下降,削弱植株光合产物的合成与积累,缩短籽粒灌浆期,促进植株早衰,粒质量降低,导致小麦明显减产^{[7, 8]}。酸雨或渍水逆境对作物品质也有明显影响,前人研究表明,酸雨会使小麦籽粒中淀粉含量和支链淀粉含量降低,导致支/直比下降,酸雨也可使谷蛋白含量降低,并导致谷/醇比下降^[2];花后渍水会导致籽粒中蛋白质含量及组分含量下降,使湿面筋含量下降,进而影响面粉的加工品质,渍水也会使面粉亮度下降,灰度显著增加^{[3, 9]}。

随着生活水平的不断提高,人们对粮食品质的要求也越来越高。蛋白质是小麦籽粒的主要组成部分之一,也是决定小麦品质的主要因素。小麦籽粒中蛋白质及其组分含量、各组分比例对面粉加工品质十分重要^[3],较高的谷蛋白含量、谷/醇比和湿面筋含量有利于提高小麦的加工品质^[10]。目前国内外学者对酸雨或渍水单一胁迫研究的较多,但就二者复合胁迫对小麦生长及品质的影响研究较少,而过多的酸沉降往往容易引起渍水胁迫。小麦开花期至成熟期是植株生长发育最易受不良环境条件影响的时期,而此期也是长江中下游地区酸雨发生概率和强度较大的时期^[11],同时也是涝渍害高发的时期^[12],易发生酸雨和渍水的双重胁迫。为此,本试验以小麦为材料,研究了不同酸度酸雨、渍水和酸雨渍水复合胁迫对小麦籽粒蛋白质品质的影响,并从酶学的角度来研究其形成机制,以期为小麦抗逆调优栽培提供理论依据。

根据苗期酸雨品种筛选试验,以‘汶农17’和‘扬麦16’为材料。‘汶农17’由泰安市汶农种业有限责任公司培育,对酸雨抗性较弱,生育期较迟;‘扬麦16’由江苏里下河地区农业科学研究所培育,对酸雨抗性较强,生育期较早。

试验于2013年至2014年在南京农业大学牌楼试验站进行。所用土壤为黄棕壤,自然风干后过筛,装入直径25 cm、高20 cm的聚乙烯塑料盆。每盆装土8 kg,播种前每盆土施用尿素3.1 g,KH₂PO₄ 1.7 g,K₂SO₄ 4.1 g,使土壤与肥料充分混匀。由于两小麦品种生育期不同,为使其花期相遇,‘汶农17’于10月18日播种,‘扬麦16’于11月3日播种。每盆播种12粒,3叶1心期间苗至7株,于拔节期施追肥,每盆追肥尿素2.1 g,KH₂PO₄ 1.2 g,KH₂PO₄ 2.7 g。生育期管理同大田生产。

试验共设6个处理,分别是:pH5.6酸雨(CK)、pH5.6酸雨+渍水(WL)、pH4.0酸雨(pH4.0)、pH4.0酸雨+渍水(pH4.0+WL)、pH2.5酸雨(pH2.5)、pH2.5酸雨+渍水(pH2.5+WL)。试验为随机区组设计,3次重复。

酸雨喷施采用电动水泵式喷施装置模拟自然降雨,该装置由抽水泵、管道和喷头三部分组成,开动水泵即可使酸雨喷施连续自动地进行,酸雨呈花洒式落到植株上,流量大小或喷洒强度可以调节。根据流量大小和水滴落至地面形成的圆形面积来计算喷施时间。

于开花期进行酸雨和渍水处理,酸雨处理设3个酸度梯度:pH5.6酸雨、pH4.0酸雨和pH2.5酸雨,酸雨配制参照卞雅姣等^[2]的方法。酸雨喷施量参照刘梅等^[11]关于南京地区酸雨降水量的月际变化情况而定,从开花期开始至成熟期每5 d喷施1次,每次喷施量相当于5 mm降雨量,喷施时间为17:00左右。从每种酸雨处理中取一半盆钵开展渍水处理(保持1 cm左右的水层),处理时间为盛花期至花后12 d共处理14 d,另一半正常水分管理。开花期选择同天开花、大小均匀的穗挂牌标记,从花期至成熟每隔7 d取1次样,按器官分开后,80 ℃下烘干至恒质量,密封袋保存,用于蛋白质及组分含量等指标测定。同时,在田间取穗和旗叶鲜样,迅速置于液氮中快速冷冻,然后转移至-40 ℃冰箱保存,用于酶活性测定。

硝酸还原酶(NR)活性测定参照《现代植物生理学实验指南》^[13]。称取0.5 g新鲜旗叶,加25 mmol·L^-1 pH8.7的Tris-HCl缓冲液5 mL(含0.1 mmol·L^-1 EDTA-Na₂、1 mmol·L^-1半胱氨酸)和少量石英砂冰浴研磨,4 ℃下15 000 g离心15 min,上清液即为粗酶液。酶反应体系由以下组分组成:0.1 mol·L^-1 KNO₃ 1.2 mL,2 mg·mL^-1 NADH(用pH7.5磷酸缓冲液溶解)0.4 mL,0.2 g·L^-1酶液1.5 mL(对照管为Tris-HCl缓冲液)。混合反应液25 ℃水浴30 min,立即加10 g·L^-1磺胺1 mL,0.2 g·L^-1萘基乙烯胺1 mL,显色15 min,4 000 g离心5 min,用分光光度计在570 nm下测吸光值。

谷氨酰胺合成酶(GS)和谷丙转氨酶(GPT)活性测定参照《现代植物生理学实验指南》^[13]。称取0.5 g新鲜旗叶或籽粒,加50 mmol·L^-1 pH8.0的Tris-HCl缓冲液6 mL(含2 mmol·L^-1 MgSO₄、0.5 mmol·L^-1 EDTA、10 mmol·L^-1 β-巯基乙醇)和少量石英砂冰浴研磨,4 ℃下15 000 g离心20 min,上清液即为粗酶液。采用实验指南上的方法测定旗叶GS和籽粒GS与GPT活性。

内肽酶活性测定参照Wittenbach的方法^[14]。取1 g新鲜叶片加50 mmol·L^-1 pH7.5的Tris-HCl缓冲液5 mL(含4 mmol·L^-1 DTT,1 mmol·L^-1 EDTA,1% PVP)和少量石英砂冰浴研磨,然后4 ℃下15 000 g离心30 min,上清液用于内肽酶活性的测定。酶反应体系由以下组分组成:100 mmol·L^-1 pH4.8醋酸缓冲液0.4 mL,0.05 mol·L^-1牛血红蛋白(用pH4.8醋酸缓冲液溶解)0.2 mL,酶液0.4 mL。混合反应液于38 ℃保温1 h,然后加1 mL 10%的三氯乙酸终止反应(对照管则在反应前加入三氯乙酸),4 ℃静止30 min,4 000 g离心10 min,上清液与75 mmol·L^-1水合茚三酮反应,沸水浴15 min,用分光光度计在570 nm下测吸光值。

蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法^[13]。氮的含量乘以5.7即为蛋白质含量。蛋白质组分采用连续提取法,提取后采用微量凯氏定氮法进行测定^[15]。

采用Excel 2007软件处理试验数据,并用SPSS 18.0软件对试验数据进行两因素的方差分析,处理间均值的多重比较用Duncan′s 新复极差法,试验结果是3次重复的平均值。

如表1所示:酸雨降低了‘汶农17’蛋白质及组分含量、蛋白质产量和谷/醇比,且酸雨酸度越强下降的幅度越大。pH4.0和pH2.5酸雨处理的蛋白质含量分别较对照降低了6.56%和9.96%。酸雨提高了‘扬麦16’蛋白质及各组分含量和蛋白质产量,且酸雨酸度越强增加的幅度越大。pH4.0和pH2.5酸雨处理的蛋白质含量分别较对照提高了5.20%和6.09%,酸雨降低了‘扬麦16’籽粒的谷/醇比。渍水对两小麦品种蛋白质及各组分含量与产量的影响相同,均显著降低了两小麦品种蛋白质及各组分含量、蛋白质产量和谷/醇比,WL处理使‘汶农17’和‘扬麦16’籽粒的蛋白含量较对照分别降低了9.47%和9.13%。酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种蛋白质含量及产量和谷/醇比(‘扬麦16’的pH4.0+WL的处理除外),pH4.0+WL和pH2.5+WL处理分别使‘汶农17’的蛋白质含量降低了20.40%和25.80%,分别使‘扬麦16’的蛋白质含量提高了3.27%和2.82%。

如图1所示:两小麦品种旗叶中NR活性随灌浆进程的推进呈逐渐下降趋势。酸雨降低了‘汶农17’旗叶中NR的活性(除花后7 d时pH4.0处理),花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘汶农17’较对照分别降低了15.20%和23.53%。酸雨提高了‘扬麦16’旗叶中NR的活性,花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘扬麦16’较对照分别提高了21.16%和6.35%。WL处理降低了两小麦旗叶中NR的活性,花后14 d时WL处理使‘汶农17’和‘扬麦16’较对照分别降低了37.25%和14.29%。酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种旗叶中的NR活性,花后14 d时pH4.0+WL和pH2.5+WL处理‘汶农17’旗叶中的NR活性较对照分别降低了45.59%和47.06%,‘扬麦16’旗叶中的NR活性较对照分别降低了15.87%和13.23%。

	图 1 花后酸雨和渍水对小麦品种‘汶农17’(A、C)和‘扬麦16’(B、D)旗叶中硝酸还原酶(NR) 和谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响 Fig. 1 Effects of simulated acid rain and waterlogging on nitrate reductase(NR)and glutamine synthetase(GS) activity of ‘Wennong17’(A,C)and‘Yangmai16’(B,D)in leaves after anthesis
图选项

两小麦品种旗叶中GS活性随灌浆进程的推进呈先升后降趋势,峰值出现花后7 d。酸雨降低了‘汶农17’旗叶中的GS活性(除花后7 d时pH4.0处理),提高了‘扬麦16’旗叶中的GS活性,花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘扬麦16’旗叶中的GS活性较对照分别提高了13.04%和7.25%。WL处理降低了两小麦品种旗叶中GS的活性,花后14 d时WL处理‘汶农17’和‘扬麦16’较对照分别降低了17.46%和15.94%。酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种旗叶中GS活性,且不同复合胁迫组合对‘汶农17’旗叶中GS活性的影响程度表现为pH2.5+WL处理大于pH4.0+WL处理,对‘扬麦16’旗叶中GS活性的影响程度表现为pH4.0+WL处理大于pH2.5+WL处理。

由图2可见:两小麦品种旗叶中内肽酶活性均随灌浆进程的推进呈先升高后降低的变化趋势,峰值出现在花后21 d。酸雨降低了‘汶农17’旗叶中内肽酶活性(花后7 d除外),花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘汶农17’旗叶中内肽酶活性较对照分别降低了0.27%和5.38%;酸雨提高了‘扬麦16’旗叶中内肽酶活性,花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘扬麦16’旗叶中内肽酶活性较对照分别提高了5.46%和1.72%。WL处理提前了旗叶中内肽酶活性的峰值,使峰值出现在花后14 d,花后14 d时WL处理使‘汶农17’和‘扬麦16’旗叶中内肽酶的活性较对照分别提高了14.25%和21.11%。酸雨渍水复合胁迫同样提前了旗叶中内肽酶活性的峰值,使峰值出现在花后14 d。

	图 2 花后酸雨和渍水对小麦品种‘汶农17’(A)和‘扬麦16’(B)旗叶中内肽酶(EP)活性的影响 Fig. 2 Effects of simulated acid rain and waterlogging on endopeptidase(EP)activity of ‘Wennong17’(A)and‘Yangmai16’(B)in leaves after anthesis
图选项

如图3所示:两小麦品种籽粒中GS活性随灌浆进程的推进呈逐渐下降趋势。酸雨降低了‘汶农17’籽粒中GS 的活性,花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘汶农17’籽粒中的GS活性较对照分别降低了4.79%和9.59%;酸雨提高了‘扬麦16’籽粒中GS的活性,花后14 d时pH4.0和pH2.5酸雨处理‘扬麦16’籽粒中的GS活性较对照分别提高了5.30%和0.66%。WL处理降低了两小麦品种籽粒中GS的活性,且有随灌浆进程的推进下降幅度越大的趋势,花后14 d时WL处理‘汶农17’和‘扬麦16’的GS活性较对照分别降低了20.55%和10.60%。酸雨渍水复合胁迫降低了两小麦品种籽粒中GS的活性,且不同复合胁迫组合对‘汶农17’籽粒中GS活性的影响程度表现为pH2.5+WL处理大于pH4.0+WL处理,对‘扬麦16’籽粒中GS活性的影响程度表现为pH4.0+WL处理大于pH2.5+WL处理。

	图 3 花后酸雨和渍水对小麦品种‘汶农17’(A、C)和‘扬麦16’(B、D)籽粒中GS和谷丙转氨酶(GPT)活性的影响 Fig. 3 Effects of simulated acid rain and waterlogging on GS and glutamic pyruvic transaminase(GPT)activities of ‘Wennong17’(A,C)and‘Yangmai16’(B,D)in grains after anthesis
图选项

两小麦品种籽粒中GPT活性变化趋势和GS变化趋势一致,随灌浆进程的推进呈逐渐下降趋势,其中在花后7~21 d缓慢下降,花后21 d以后迅速下降。酸雨降低了‘汶农17’籽粒中GPT的活性,提高了‘扬麦16’籽粒中GPT的活性。WL处理降低了两小麦品种籽粒中GPT的活性。酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种籽粒中GPT的活性,且不同复合胁迫组合对‘汶农17’籽粒中GPT活性的影响程度表现为pH2.5+WL大于pH4.0+WL处理,对‘扬麦16’籽粒中GPT活性的影响程度表现为pH4.0+WL处理大于pH2.5+WL处理(花后7 d除外)。

小麦籽粒中蛋白质及组分含量是决定小麦籽粒品质的重要指标。蛋白质既是必要的营养成分^[16],同时也是氮代谢途径的重要产物。目前就酸雨对小麦籽粒中蛋白质及组分含量的影响结果不尽相同,麦博儒等^[6]认为酸雨会降低小麦籽粒中蛋白质含量。卞雅姣等^[2]指出酸雨处理会提高小麦籽粒中总蛋白质含量及清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量。本研究结果表明,酸雨处理降低了‘汶农17’籽粒中蛋白质及组分含量和蛋白质产量,提高了‘扬麦16’籽粒中蛋白质及组分含量和蛋白质产量。说明酸雨对不同品种影响不同。前人研究表明,渍水会降低小麦籽粒中蛋白质含量^{[3, 9]}。本试验中,渍水处理和酸雨渍水复合胁迫均降低了‘汶农17’和‘扬麦16’籽粒中蛋白质及组分含量和蛋白质产量,说明渍水和酸雨渍水复合胁迫均对小麦的营养品质有负面影响。各种胁迫(除‘扬麦16’的pH4.0和pH4.0+WL处理)对小麦总蛋白产量的影响相比较可知,单一胁迫下渍水对小麦的影响大于酸雨,而酸雨渍水复合胁迫加重了危害,但不是简单的叠加效应。

小麦由根部吸收的NO^-₃经旗叶中的NR还原成NH⁺₄,NH⁺₄在旗叶中GS的作用下与谷氨酸结合生成谷氨酰胺,所以NR和GS活性高,有利于植株维持较高的氮素同化力,为旗叶及籽粒蛋白质的积累从氮素供应上提供保障^[17]。前人研究表明,酸雨胁迫下杜仲叶片中NR、GS活性降低^[18],渍水逆境会降低小麦旗叶中GS活性,使氮素同化能力降低^[12]。本研究结果表明,酸雨处理降低了‘汶农17’旗叶中NR和GS活性,提高了‘扬麦16’旗叶中NR和GS活性,酸雨处理对不同品种小麦的影响不同说明酸雨对小麦的影响与小麦品种有关,这可能是由于酸雨中含有氮元素,导致酸雨在对植物具有酸度胁迫的同时,在一定程度上对植物也有着营养效应进而影响植物的氮代谢。酸雨提高了‘扬麦16’的氮素同化能力,进而影响植物体内蛋白质的合成。渍水处理和酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种旗叶中NR和GS活性,说明渍水和酸雨渍水复合胁迫均抑制了小麦对氮素的同化能力。

内肽酶(EP)是促进可溶性蛋白水解生成游离氨基酸的关键酶,其活性大小对小麦花后叶片中氮素向籽粒中的运转十分重要^[19]。本试验结果表明,与对照相比,酸雨使‘汶农17’前期旗叶中内肽酶活性升高,原因可能是植株通过内肽酶活性的增加来加速可溶性蛋白水解使叶片中游离氨基酸含量增加,维持较高的叶片水势,提高叶片的渗透调节能力和保水性能^{[20, 21]},从而减轻逆境引起的损伤,这与张明生等^[22]就干旱对甘薯叶片中的游离氨基酸含量影响的研究结果一致。酸雨使后期‘汶农17’旗叶中内酞酶活性降低,说明酸雨抑制了‘汶农17’中氮素从叶片向籽粒转运。酸雨提高了‘扬麦16’的内肽酶活性,说明酸雨促进了‘扬麦16’叶片中氮素向籽粒转运。灌浆中后期是籽粒中醇溶蛋白和谷蛋白的合成高峰期,内肽酶活性的高低直接影响着籽粒中氨基酸来源是否充足,进而影响籽粒中蛋白质的合成。‘汶农17’最终籽粒总蛋白含量、醇溶蛋白和谷蛋白含量的下降可能与后期内肽酶活性的降低有关。渍水处理和酸雨渍水复合胁迫均提高了两小麦品种前期旗叶中内肽酶的活性,这同样是植株对外界逆境的一种适应。渍水处理和酸雨渍水复合胁迫使两小麦品种后期旗叶中内肽酶活性降低,影响了叶片中的氮素向籽粒中运转,导致最终籽粒中总蛋白含量显著下降。

GPT在将氮从其主要载体谷氨酸转移到组成蛋白质的其他种类氨基酸的过程中起关键作用^[23]。有研究表明,小麦籽粒中GS和GPT活性与籽粒蛋白质含量呈正相关,灌浆后期较高的GS活性有利于蛋白质含量的升高^[24]。Solomonson等^[25]研究表明,GPT活性随酸雨时间、雨量及强度的增加而减弱。范雪梅等^[12]研究表明,渍水逆境降低了籽粒中GS和GPT活性,使蛋白质合成能力降低。本试验结果表明,酸雨降低了‘汶农17’籽粒中GS和GPT活性,提高了‘扬麦16’籽粒中GS和GPT活性,表明酸雨降低了‘汶农17’籽粒中蛋白质合成能力,提高了‘扬麦16’籽粒中前中期的蛋白质合成能力,最终影响了成熟期籽粒中总蛋白含量及蛋白组成。渍水处理和酸雨渍水复合胁迫均降低了两小麦品种籽粒中的GS和GPT活性,影响了籽粒中蛋白质的合成能力,导致最终籽粒中总蛋白含量显著下降。

综上所述,酸雨、渍水和酸雨渍水复合胁迫对两小麦品种氮代谢关键酶的影响不同,导致了最终籽粒中蛋白组成的不同。

花后酸雨、渍水及其复合胁迫对氮代谢关键酶活性和蛋白质组成有明显影响。酸雨对不同小麦品种影响不同,酸雨抑制了‘汶农17’的氮代谢过程,导致最终籽粒中总蛋白及其组分含量降低;酸雨促进了‘扬麦16’的氮代谢过程,进而使最终籽粒中总蛋白及其组分含量提高。渍水和酸雨渍水复合胁迫抑制了两小麦品种的氮代谢过程,导致最终籽粒中总蛋白及其组分含量、蛋白产量降低。