近年来,动物转基因技术不断发展,已成功培育出转基因小鼠、兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊等20多种转基因动物^{[1, 2, 3]},也伴随着产生了转基因动物产品。2006年,欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)批准首个利用转基因山羊乳腺生物反应器生产的药物ATryn上市。目前,美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)正在考虑批准携带有生长激素基因的转基因鲑鱼上市。随着越来越多的转基因动物及产品进入商品化生产阶段,其安全性也受到了人们的广泛关注,核心问题集中于环境安全、动物健康与福利、人类健康与食品安全等方面^[4],建立快速准确的转基因产品检测技术成为研究的热点。

转基因动物的检测体系尚未完善。目前,主要从DNA水平、转录水平^[5]、翻译水平^[6]和整体表型^[7]进行检测,其中DNA水平的检测主要是PCR技术,它具有简单、快捷的特点。转基因动物的某些导入基因可能与内源性基因同源,而PCR具有高灵敏度的特点,利用单一PCR检测时常常出现假阳性结果。多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的反应,可检测转基因样品中多种基因,尽可能地排除了假阳性或假阴性结果,目前已广泛应用于转基因动物 检测^{[8, 9]}。肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN),又称生长分化因子8(growth and differential factor-8,GDF-8),属于TGF-β家族,是骨骼肌生长和发育的负调控因子。MSTN基因的敲除有助于提高动物酮体的瘦肉率,达到提高饲料利用率、降低饲养成本的目的。目前国内外尚未见MSTN基因敲除猪检测方法的相关报道。本研究以MSTN基因敲除猪为研究对象,对β2-微球蛋白(β2-microglobulin,B2M)基因、标记基因新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferaseⅡ,NPTⅡ)基因和测定的边界序列建立多重PCR检测方法,以确定检测样品的种属,并检测是否为含有标记基因的转基因样品,也是对MSTN基因敲除猪检测方法的一种探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用MSTN基因敲除的猪组织样本由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。牛、羊及非转基因猪样品购自北京朝阳区物美超市及周边市场,小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs及缓冲液均购自TaKaRa公司;pGEMT载体购自Promega公司;琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、微量质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司;QIAGEN DNA Mini Kit购自QIAGEN公司。

1.3 引物

根据GenBank中B2M基因序列(AF452448.1)设计猪内源基因B2M引物,以生产基因敲除猪的质粒设计 NPTⅡ基因引物,根据边界序列设计MSTN的品系特异性引物。用Beacon Designer 7.0设计引物,由Invitrogen公司合成。引物序列见表 1。

利用QIAGEN公司QIAGEN DNA Mini Kit试剂盒提取样品的DNA,严格按照说明书进行操作。

1.5 内源基因和转基因成分的单一PCR验证

PCR反应体系(25 μL)为:10×PCR Buffer(含25 mmol·L^-1 MgCl₂)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol·L^-1)2 μL,上、下游引物(10 pmol·μL^-1)各1 μL,Taq DNA聚合酶(5 U·μL^-1)0.3 μL,基因组(100 mg·L^-1)1 μL,ddH₂O 17.2 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用15 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后回收目的片段。将已纯化的目的基因片段连接到pGEMT载体,转化至E.coli DH5α中,挑取单克隆,PCR鉴定后送北京诺赛基因有限公司测序。

1.6 反应体系的优化

多重PCR反应体系(25 μL)为:10×PCR Buffer(含25 mmol·L^-1 MgCl₂)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol·L^-1)2 μL,B2M上、下游引物(10 pmol·μL^-1)各0.45 μL,NPTⅡ上、下游引物(10 pmol·μL^-1)各1.15 μL,MSTN上、下游引物(10 pmol·μL^-1)各0.9 μL;Taq DNA聚合酶(5 U·μL^-1)0.3 μL,基因组(100 mg·L^-1)1 μL,ddH₂O 14.2 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,分别于56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃各30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用15 g·L^-1的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7 特异性和敏感性试验

用上述方法对牛、羊、小鼠和非转基因猪样品进行检测,验证方法的特异性。

将MSTN基因敲除猪(100%)的基因组与非转基因猪的基因组进行配比混合,得到含20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样品,然后进行多重PCR检测,验证方法的敏感性。

1.8 样品检测

随机选择猪的肺(8个样本)和脾脏(24个样本),共计32个样本,利用QIAGEN DNA Mini Kit提取组织样品基因组后,用建立的方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 内源基因和转基因成分的单一PCR验证结果

检测MSTN时,仅MSTN基因敲除猪扩增出条带;检测NPTⅡ时,仅MSTN基因敲除猪和转植酸酶基因猪扩增出条带,非转基因猪、牛和空白对照均未扩增出目的条带;检测B2M时,MSTN基因敲除猪、转植酸酶基因猪和非转基因猪均扩增出条带,牛基因组和阴性对照均未扩增出目的条带,与预期结果一致(图 1)。 将测序结果与GenBank序列进行BLAST比对,B2M与GenBank中猪B2M基因序列(AF452448.1) 相似性为100%,NPTⅡ基因与生产基因敲除猪的质粒序列相似性为100%,MSTN与测定的边界序列相似性为100%。

	图 1 B2M、MSTN和NPTⅡ基因PCR扩增结果Fig. 1 The results of PCR amplification using primers of B2M,MSTN and NPTⅡ1~4.MSTN基因敲除猪MSTN knockout pigs samples;5.转植酸酶基因猪Recombinant salivary phytase transgene pig sample;6.非转基因猪Untransgenic pig sample;7.牛基因组Bovine genome sample;8.阴性对照Negative control;9.DNA分子质量标准DNA marker
图选项

对退火温度、引物相对浓度、缓冲液浓度和Mg²⁺浓度进行优化的结果表明:引物浓度对扩增效率影响较大。反应体系为25 μL时,B2M引物(10 pmol·μL^-1)为0.9 μL,NPTⅡ引物(10 pmol·μL^-1)为2.3 μL,MSTN引物(10 pmol·μL^-1)为1.8 μL时,MSTN基因敲除猪扩增出3条特异性条带,而非转基因猪仅扩增出B2M条带,空白对照未扩增出任何条带;退火温度对扩增效率影响较小,在56、58、60和62 ℃均能得到较好的扩增(图 2),最终选择56 ℃作为最优的退火温度。

	图 2 多重PCR检测方法的温度梯度扩增结果Fig. 2 The results of multiplex PCR amplified from gradient annealing temperature1~4.MSTN基因敲除猪温度梯度Gradient annealing temperature of MSTN knockout pig samples(56 ℃,58 ℃,60 ℃,62 ℃);5~6.非转基因猪 温度梯度Gradient annealing temperature of untransgenic pig samples(60 ℃,62 ℃);7.阴性对照Negative control;8.空白对照Blank control;9.DNA分子质量标准DNA marker
图选项

用上述方法对牛、羊、小鼠和非转基因猪的基因组进行扩增,仅非转基因猪的基因组扩增出B2M条带,检测样品均无NPTⅡ和MSTN的扩增条带(图 3),说明该方法特异性较好。

	图 3 多重PCR检测方法的特异性结果Fig. 3 The specificity test results of multiplex PCR1.DNA分子质量标准DNA marker;2~4.猪基因组Pig genome samples;5.牛基因组Bovine genome sample;6.羊基因组Sheep genome sample;7.小鼠基因组Mouse genome sample;8.阴性对照Negative control
图选项

用上述方法对含20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样品进行检测,结果(图 4)显示:含20%、10%、5%和1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样品扩增出3条特异性条带,而含0.5%和0.1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样品仅扩增出B2M的条带,说明本方法最低可检测出含1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样本。

	图 4 多重PCR检测方法的敏感性结果Fig. 4 The sensitivity test results of multiplex PCR1~6.含20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1% MSTN基因敲除猪基因组成分的样品Including 20%,10%,5%,1%,0.5% and 0.1% MSTN knockout pig genome samples;7.阴性对照Negative control;8.DNA分子质量标准DNA marker
图选项

用上述方法对32份随机选择的猪肺和脾脏样品进行检测,结果(图 5)显示仅扩增出B2M条带,均无MSTN和NPTⅡ的扩增条带。

	图 5 市售猪肺和脾脏样品的多重PCR检测结果Fig. 5 Detection on spleen and lung tissue samples of pig by multiplex PCR1,37.DNA分子质量标准DNA marker;2~21,23~26.猪脾脏组织样品Spleen tissue samples of pig;22.阴性对照Negative control;27~34.猪肺脏组织样品Lung tissue samples of pig;35.空白对照Blank control;36.阳性对照Positive control
图选项

多重PCR是转基因动物检测中常用的技术,马馨等^[9]和朱振营等^{[8, 10]}建立了针对转基因牛和猪的多重PCR检测方法。本试验针对B2M、标记基因NPTⅡ和测定的边界序列设计引物,对退火温度、缓冲液浓度和Mg²⁺浓度等进行了优化,发现其均对多重扩增效率影响较小,而引物浓度对PCR反应的影响较大。本试验在反应条件摸索阶段,在PCR反应体系中加入相同摩尔的引物,MSTN扩增条带较弱,而B2M的扩增条带与单一PCR反应的扩增条带无明显差异。对各种引物的量进行优化,对于扩增条带较弱的引物,增加了引物量;对于扩增条带强的内参基因,降低它的引物量,得到了3条特异性条带,与朱振营等^[10]对多重PCR的缓冲液浓度、退火温度和引物浓度的优化结果一致。

B2M基因是仔猪研究中常用的内参基因^[11],王继英等^[12]对β肌动蛋白(β-actin,ACTB)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、B2M、TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)、核糖体蛋白L4(ribosomal protein L4,RPL4)和肽基脯氨酰异构酶A(peptidylprolyl isomerase A,PPIA)共6个常用的内参基因进行筛选,结果发现B2M是最稳定表达的内参基因。研究过程中可通过检测B2M基因的有无鉴定基因组提取的优劣,同时避免了检测过程假阴性结果的出现。NPTⅡ^[13]是转基因技术中常用的标记基因,正常动物自身不携带这种基因,对其进行检测可初步筛查是否为携带这种标记基因的转基因动物。研究过程中,对转植酸酶基因猪进行检测时,扩增出NPTⅡ基因的目的条带,说明此品系转基因猪中携带NPTⅡ标记基因。

MSTN作为骨骼肌中一种主要的肌肉生长负调控因子^[14],其通过调节靶基因的表达,改变肌肉的纤维组成(红、白肌的比例)及引起肌肉质量的变化。随着转基因技术的不断发展,国内外在载体构建方面做了大量的研究工作,获得了MSTN基因敲除细胞系^{[15, 16, 17]}。应用建立的多重PCR方法对市售猪组织样品进行检测,仅扩增出内参基因B2M的条带,MSTN和NPTⅡ均未扩增出条带,与预期的结果一致,表明抽取样品的市场中无此品系转基因猪流通。

目前国内外尚未见MSTN基因敲除猪检测方法的报道,本试验针对具有商品化前景的MSTN基因敲除猪建立多重PCR检测方法,为此品系转基因猪的检测提供了技术储备,同时也为相关检测标准的建立提供了参考。