随着生活水平的不断提高,人们对猪肉品质的要求也越来越高^{[1, 2]}。脂肪沉积是影响猪肉品质和营养价值的一个关键因素^[3],因为脂肪沉积可以影响很多重要的肉质性状,如背膘厚、肌内脂肪含量、瘦肉率等^{[4, 5]}。另外,猪作为一个良好的动物模型,在研究人类肥胖候选基因的研究中发挥重要的作用^[6]。因此,开展猪的脂肪沉积机制研究具有重大意义。

随着定位克隆、物理作图和候选基因等分子生物学技术的发展,研究人员已成功发现许多影响猪脂肪性状的主效基因,如过氧化物酶体增殖物活化受体基因(PPARs)^[7]、肥胖易感基因(FTO)^{[5, 6, 7, 8]}、脂蛋白脂肪酶基因(LPL)^[9]等。瘦素受体(LEPR)是一种跨膜受体,属于Ⅰ类细胞因子受体家族,由细胞外的配体结合区、跨膜区及胞内区3部分组成^{[10, 11]}。瘦素受体与瘦素(LEP)相互结合发挥着广泛作用,如机体体质量平衡控制^{[12, 13]}。

在小鼠上,前人研究发现LEPR mRNA在越来越多的组织上有表达,包括心、肝、肾、肺、小肠、卵巢和脂肪组织等^[14]。在猪上,LEPR mRNA在脂肪组织、脑、肌肉、脂肪、肝、下丘脑、垂体^{[11, 15, 16, 17]}和繁殖组织(子宫内膜、卵巢)^[17]上均有表达。但是,关于中国高脂肪含量猪和低脂肪含量猪LEPR的表达差异及表达量、编码序列单核苷酸多态(cSNP)与肉质性状关联分析的报道还很少。

苏钟猪是以太湖猪为亲本培育的优质瘦肉型猪,肌间和肌内脂肪丰富,本试验通过实时荧光定量PCR方法、免疫印迹和直接测序等技术,从mRNA表达、蛋白表达、cSNP挖掘和性状关联等方面分析了LEPR对脂肪沉积的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在江苏洪泽鑫象公司,用背膘仪活体测定背膘厚度大小选取了10头6月龄、(95±3)kg体质量的半同胞健康苏钟猪(高脂猪和低脂猪各半),这些猪均在同一天被电击昏后屠宰,之后参照屠宰程序^{[18, 19]}采集猪的心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘等组织样,迅速置于液氮冷冻保存。同时,测定了这些试验猪的脂肪沉积相关性状,包括背最长肌横切面积(求积仪,Haguang)、瘦肉率(SFK,Denmark)、背膘厚(游标卡尺,MNT)等,并根据背膘厚度和试验猪左半边胴体的前躯、中躯和后躯脂肪质量进一步确定了高脂猪和低脂猪(表 1)。另外本实验室保存有51头苏钟猪肌肉样或血样,并有这些猪的耳号、出生日期和背最长肌性状(横切面积、pH值、肉色、大理石花纹评分和系水力)等记录,笔者采用高盐法^[20]提取这些猪组织样中的基因组,进行LEPR基因的cSNP研究。

猪LEPR基因的cDNA(GenBank:NM_001024587)全长4 050 bp,其编码序列为第16~3 513 bp。LEPR_1引物用于RT-qPCR,LEPR_2引物用于LEPR第18外显子(2 726~3 464 bp)的cSNPs检测。所有引物序列均用Oligo 6.0软件设计,由上海英潍捷基(Invitrogen)生物公司合成(表 2)。

利用Trizol(Invitrogen,USA)/氯仿方法^{[5, 21]}从猪组织样中提取总RNA,以上述提取的总RNA为模板,利用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录,合成cDNA第一链(Fermentas,Lithuania),25 μL反应体系,试验步骤参考说明书进行。

利用实时荧光定量PCR仪(ABI Stepone plus,USA)进行PCR扩增。反应体系如下:2×real-time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL,上下游引物(10 μmmol · L^-1)各1 μL,模板(cDNA稀释10倍)1 μL,Taq DNA Polymerase 0.3 μL,加DEPC水到20 μL(ABI,USA)。反应条件如下:95 ℃ 2 min热启动HotStar Taq酶活性;94 ℃ 10 s,60 ℃ 40 s,共40循环;45~95 ℃,读板时按0.1 ℃ · s^-1进行熔解曲线分析。内参基因为GAPDH。

1.4 Western blot检测蛋白表达

组织样用蛋白裂解液裂解^{[5, 22]},提取出的总蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(Invitrogen,USA)检测。Western blot过程参照Patel等^[23]和付言峰等^[24]的方法,一抗用小鼠抗人LEPR抗体(mAb,sc-8391,Santa Cruz,USA),二抗用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(A0216,Beyotime,中国)。利用灰度分析软件(Gel-Pro32)分析电泳条带灰度比值(以GAPDH为内参)。

1.5 直接测序法检测cSNPs

首先进行LEPR基因目的片段(cDNA第2 726~3 464 bp,位于CDS区)的PCR扩增。反应体系(15 μL):7 μL Premix Taq(TaKaRa,China),6 μL ddH₂O,0.5 μL各种引物(10 pmol · L^-1)和1 μL DNA。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共30循环;72 ℃ 7 min。利用ABI 3730XL DNA测序仪(Applied Biosystems,USA)对上述PCR产物进行直接测序,每个样品测序2次,即正向和反向各测1次。测序序列和NCBI序列通过DNAMAN 5.2进行比对,最终得到LEPR的cSNPs。

1.6 数据处理与统计

实时荧光定量PCR的数据利用2^-ΔΔC_T法^{[25, 26]}分析,得到LEPR mRNA的相对表达量。用SAS 8.2统计软件包的GLM程序进行LEPR mRNA、蛋白表达量、cSNP与脂肪沉积性状之间的关联分析。结果均以最小二乘均值±标准误(LS means±SE)表示。

2 结果与分析

2.1 LEPR mRNA表达对脂肪沉积的影响

组织样中提取的总RNA利用分光光度计测定出的A₂₆₀/A₂₈₀结果大都处于1.8~2.1的区间,总RNA含量为1.60~2.22 μg · μL^-1,说明提取的RNA质量较高,可以进行后续的RT-qPCR试验。

RT-qPCR结果表明:LEPR mRNA在猪心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘中均有表达,且不同组织样中的表达量差异显著(P<0.05)。其中背膘的表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.05),其次为背最长肌的表达量,且高脂猪的表达量显著高于低脂猪(P<0.05)(图 1)。由于高脂猪的眼肌(背最长肌)面积和瘦肉率显著低于低脂猪(表 1),即高脂猪的脂肪沉积量显著高于低脂猪,结合文献报道^{[12, 13]},笔者推测猪脂肪沉积增加,引起LEPR mRNA表达量升高,促进脂肪分解,控制猪只体质量的平衡。

	图 1 苏钟猪不同组织样的LEPR mRNA表达量(GAPDH为内参基因)Fig. 1 The mRNA expression level of LEPR in different tissues of Suzhong pigs(GAPDH was used as an internal gene)柱形图上不同的小写字母或“*”表示在0.05水平差异显著。 The“muscle”was abbreviation of“longissimus dorsi muscle”. Values with different low case letters or“*”show significant difference at 0.05 level. The same as follows.
图选项

Western blot结果表明:猪LEPR蛋白(NCBI Protein:NP_001019758)在苏钟猪的心脏、肝脏、肾脏、背最长肌和背膘组织中均有表达,且不同组织间表达量差异显著(P<0.05),其中背膘中的表达量最高,显著高于其他组织样,其次为背最长肌,而肾脏中的LEPR蛋白表达量最低(图 2)。

	图 2 LEPR在苏钟猪不同组织样中蛋白表达量的Western blot分析结果(β-actin为内参)Fig. 2 Western blot results of LEPR protein expression in different tissues of Suzhong pigs(β-actin was used as an internal protein)A:电泳条带Western blot bands;B:LabImage分析得到的电泳条带灰度值比值Gray value of scanned western blot lane images by LabImage software
图选项

笔者对LEPR基因cDNA序列第2 726~3 464 bp(位于CDS区,覆盖了第18外显子92.65%的序列)进行了直接测序扫描,结果发现3个cSNPs,即c.2856 C>T,c.2935 C>T和c.3155 C>T。3个位点的突变均为C→T的突变。这3个cSNPs中,只有c.2856 C>T位点有3种基因型,呈现多态性,分别为CC、CT和TT基因型(图 3)。

	图 3 LEPR基因部分编码序列的测序结果Fig. 3 The PCR-sequencing results for the LEPR partial CDS sequenceA:测序序列与NCBI序列比较结果Comparison results of sequencing results and NCBI results;B:测序峰值及基因分型图Peak value figure using sequencing and genetype
图选项

LEPR的cSNPs(c.2856 C>T)基因型与脂肪沉积相关肉质性状的关联分析结果表明:对于背最长肌面积/体质量、瘦肉率、pH值和肉色评分,CC基因型显著大于TT基因型(P<0.05);相反,对于肉色L^*值、肉色a^*值和大理石花纹评分,CC基因型显著小于TT基因型(P<0.05)。

考虑到背最长肌面积/体质量、瘦肉率和肉色a^*值,低脂猪极显著大于高脂猪(P<0.01)。笔者推测,TT基因型猪关联的肉质性状中,背最长肌肉色更亮、大理石花纹更丰富、瘦肉率和眼肌面积更低,与高脂 猪的肉质性状结果类似,即TT基因型更有利于猪的脂肪沉积,T等位基因是脂肪沉积有利等位基因(表 3)。

脂肪沉积可以影响猪的肉质性状,如背膘厚、背最长肌面积和肌内脂肪含量等^{[3, 5]},这些肉质性状又进一步影响猪肉的品质,如适口性、香气、嫩度等,直接决定了猪肉的品质和价格,所以猪育种工作者对其越来越重视^[24]。关于影响脂肪沉积的基因有肥胖易感基因(FTO)^[5]、氟烷基因(halothane)^[27]、激酶插入域受体(Kinase insert domain receptor,KDR)基因^[28]等。而本文的瘦素受体(LEPR)基因与瘦素(leptin)相互结合后,在体质量平衡、脂肪沉积过程中发挥着重要的作用^{[12, 13]}。关于其在中国本地猪种不同脂肪含量猪中的研究还鲜有报道,所以本试验开展了LEPR的mRNA和蛋白表达及cSNPs对猪脂肪沉积的影响研究。

RT-qPCR结果表明:LEPR mRNA在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘5种组织中均有表达,且背膘中的表达量显著高于其他组织,这与前人报道的LEPR在其他品种猪的表达结果一致^[29]。苏钟猪高脂猪的脂肪沉积高于低脂猪,且高脂猪LEPR mRNA表达量显著高于低脂猪,说明脂肪沉积越高,LEPR mRNA表达量越高。推测原因可能是脂肪沉积增加引起LEPR表达量增加,从而促进脂肪分解,控制猪只体质量平衡^{[12, 13]}。有研究对波兰5个品种猪分别添加能量饲料后,LEPR在各品种猪肌肉组织的表达量均随着年龄增长而显著升高^[30]。

Western blot结果表明:LEPR蛋白在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘中均有表达,其中背膘中的表达量最高,且高脂猪的蛋白表达量显著高于低脂猪(P<0.05),这与LEPR mRNA表达趋势相同。高脂猪比低脂猪的脂肪含量高、瘦肉率低,而LEPR mRNA和蛋白的表达量都更高,前人对LEPR配体leptin也有类似的研究结果,其发现瘦肉率高的猪leptin mRNA表达量更低,说明瘦肉率与leptin的表达量也成反比^[31]。另有报道,LEPR在高肌内脂肪含量猪背最长肌的表达量显著高于低肌内脂肪含量猪^[32]。

PCR-sequencing和关联分析结果表明,LEPR部分编码序列中检测到3个cSNPs多态位点,其中c.2856 C>T多态位点对瘦肉率、肉色、大理石花纹评分等肉质性状影响显著,T等位基因为脂肪沉积的有利等位基因。这个SNP突变不直接引起氨基酸的改变,但其可以通过与其他SNP的连锁不平衡间接引起氨基酸的改变^{[20, 33]}。有研究表明,LEPR多态性显著关联着杜洛克×长白×大白三元杂交猪的脂肪含量、脂肪分布和脂肪组成^[34],LEPR多态性显著关联韩国本地猪×大白二元杂交猪的系水力、肌内脂肪、胆固醇和风味评分^[32]。

综上所述,LEPR mRNA和蛋白在苏钟猪的背膘和背最长肌中均有高表达量,且高脂猪的LEPR表达量显著高于低脂猪,可能是脂肪沉积的增加引起LEPR的表达量增加,从而使LEPR更好得发挥其“促进脂肪分解,控制猪只体质量平衡”的作用;LPER多态位点c.2856 C>T中T为脂肪沉积的有利等位基因。上述结果表明LEPR基因对猪的脂肪沉积有一定影响,可以作为苏钟猪肉质改良育种中重要的候选基因。