自世界首例体细胞克隆动物-克隆羊“多莉”诞生以来^[1],体细胞克隆技术就成为了生产转基因动物的理想方法,并已经在很多种动物身上获得成功^{[2, 3, 4]}。但是该技术还存在较多问题,生产效率平均不到5%^[5]。为此,许多科学家为提高转基因克隆动物的生产效率,围绕转基因体细胞克隆各个技术环节,如供体细胞处理、体细胞核移植技术改进、融合与激活条件筛选以及胚胎培养体系的优化^[6]等进行了大量的研究工作。

在影响转基因克隆山羊生产效率的诸多因素中,胚胎移植是重要的影响因素之一。虽然第一只转基因克隆山羊诞生已经16年了^[7],但是系统分析胚胎移植技术环节对转基因克隆山羊生产效率影响的研究还很少。因此,本试验拟从不同胚龄、季节及移植胚胎数量来探讨胚胎移植对转人乳铁蛋白基因(hLF)体细胞克隆山羊生产的影响,为进一步提高转基因克隆山羊胚胎移植妊娠率及转基因克隆山羊生产效率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

除另有说明外,本试验试剂均为Sigma产品,液体培养基均为Gibco产品。

1.2 转hLF基因成纤维细胞的培养

用脂质体转染法将本实验室构建的hLF基因乳腺表达载体^[8]转染到奶山羊耳成纤维细胞中,筛选阳性克隆,经鉴定后扩大培养,冷冻保存。体细胞核移植操作前,从液氮中取出转hLF基因的奶山羊成纤维细胞,迅速投入37 ℃水浴中解冻,然后加入含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液,置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。

1.3 卵母细胞获取及体外成熟培养

从屠宰场采集山羊的卵巢,在3~4 h内带回实验室。将卵巢用生理盐水清洗后,剔除结缔组织和附着的输卵管,然后将卵巢转移至玻璃培养皿中,用切剖法切开卵巢上2~6 mm的卵泡,在体视显微镜下分拣出适宜成熟培养的卵丘卵母细胞复合体(COCs),在38.5 ℃、5% CO₂、饱和湿度下培养20~23 h。

1.4 卵母细胞去核

卵母细胞体外成熟培养后,用体积分数为0.3%的透明质酸酶吹打消化去除卵丘细胞,挑选排出第一极体的卵母细胞备用。分批(每批15~20个)将卵母细胞置于含7.5 μg · mL^-1细胞松弛素B、10 μg · mL^-1 Hoechst 33342和体积分数为10% FBS的TCM 199中处理10 min,然后将它们放在荧光显微镜下,用固定吸管吸住1个卵母细胞,将其第一极体调至1~2点钟位置,迅速在紫外线下观察细胞核的位置,吸出第一极体、细胞核及少量胞质,随后在紫外线下检查是否完成去核,将去核完全的卵母细胞用于核移植。

1.5 核移植与电融合

在倒置显微镜下用注核吸管吸取准备好的供体细胞,将其注入到去核卵母细胞的透明带下,用注核吸管在透明带外轻轻挤压,使体细胞贴紧卵黄膜。注核后的重构胚在融合液(0.25 mol · L^-1山梨醇、0.1 mmol · L^-1醋酸钙、0.5 mmol · L^-1醋酸镁、0.5 mmol · L^-1 Hepes和1 mg · mL^-1 BSA)中清洗3次,然后移入加有融合液的融合电极中,拨动重构卵使体细胞与卵黄膜的接触面与电极平行,给予2个融合脉冲(1.2 kV · cm^-1、间隔1 s、脉冲宽度20 μs)进行电融合。电融合后的重构胚放入含FBS的TCM 199中,38.5 ℃、5% CO₂、饱和湿度下孵育,0.5 h后检查融合结果,没有融合的重构卵再融合1次。

1.6 重构胚激活和体外培养

重构胚在含5 μmol · L^-1离子霉素的TCM 199中处理5 min,然后在含2 mmol · L^-1 6-DMAP的TCM 199培养液中培养4 h。激活后的胚胎在胚胎培养液中洗3次,然后转移到胚胎培养液中,在38.5 ℃、5% CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养,每48 h半量换液1次。

1.7 胚胎移植及移植后受体羊的管理

选择自然发情的本地山羊作为受体羊,分别通过手术法将1细胞期(激活后10~12 h)和2~8细胞期(激活后40~44 h)的克隆胚胎植入到同期的受体山羊输卵管内,而将桑椹胚和囊胚(激活后7.5 d)通过手术,用腹腔内窥镜移植到同期受体山羊子宫角。胚胎移植后的受体羊集中饲养,每天早上试情1次,详细记录羊只发情、流产情况。流产或返情的受体羊拉出受体羊群,流产或胚胎移植后连续2个情期未发情的受体羊认定为妊娠。

1.8 统计分析

试验所得数据用卡方(χ²)分析,确定差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 转hLF基因克隆胚胎移植情况

本次试验将转hLF基因克隆胚胎(图 1)通过手术方法移植到175只受体羊输卵管或子宫角内,得到怀孕受体羊24只,足月生产的受体羊为10只,共生出转hLF基因克隆奶山羊10只(图 2)。

	图 1 不同发育阶段的转基因克隆胚胎Fig. 1 Transgenic cloned embryos at different development stageA:激活后10 h的1细胞期胚胎1 cell stage embryo at 10 h of post-activation;B:激活后40 h的2~8细胞期胚胎2-8 cell stage embryo at 40 h of post-activation;C:激活后7.5 d的桑椹胚Morula at 7.5 d of post-activation;D:激活后7.5 d的囊胚Blastocyst at 7.5 d of post-activation
图选项

	图 2 试验得到的转人乳铁蛋白(hLF)基因克隆奶山羊Fig. 2 Human lactoferrin gene(hLF)tansgenic cloned dairy goats
图选项

本试验在山羊繁殖季节10至11月份进行,分别将1细胞和2~8细胞期的克隆胚胎移植到同期的受体山羊输卵管内,而将桑堪胚和囊胚通过腹腔内窥镜方法移植到受体山羊子宫角。比较移植不同胚龄的胚胎对转hLF基因克隆奶山羊生产的影响,结果(表 1)表明:移植1细胞和2~8细胞期克隆胚胎的受体羊妊娠率(分别是17.95%和28.57%)、产羔率(分别是12.82%和14.29%)要显著高于移植桑椹胚、囊胚阶段胚胎的受体羊(3.70%和0,P<0.05),而移植1细胞期和2~8细胞期克隆胚胎的受体羊妊娠率和产羔率差异不显著。

本试验在10月至次年3月份,将1~8细胞期克隆胚胎移植到同期受体山羊输卵管内,胚胎移植结果(表 2)显示:虽然秋季和春季移植胚胎的受体羊妊娠率(分别是19.57%和18.18%)高于冬季(10.34%),但差异并不显著。秋季移植胚胎的受体羊产羔率(13.04%)显著高于冬季(1.72%,P<0.05),但与春季的受体羊产羔率(6.82%)差异不显著;而春季移植胚胎的受体羊产羔率虽然高于冬季(6.82% vs 1.72%),但两者差异也不显著。

为了探讨转基因克隆胚胎的移植数量对克隆山羊生产效率的影响,本试验将1~8细胞期克隆胚胎移植到同期受体山羊输卵管内,根据移植胚胎的数量分为两组:5~9枚胚胎和10~20枚胚胎。由表 3可以发现:10~20枚胚胎组的妊娠率显著高于5~9枚胚胎组(18.18% vs 7.89%,P<0.05),而两组的产羔率则没有显著差异(7.89% vs 6.36%)。

3.1 移植不同胚龄的克隆胚胎对转基因克隆奶山羊生产的影响

胚胎质量是影响胚胎移植成功率的主要因素,胚胎的发育阶段也会影响胚胎的受胎率。在山羊常规的胚胎移植生产研究中,通常将体内和体外培养的卵裂期或桑椹胚、囊胚期胚胎移植到受体羊的输卵管或子宫角。而在山羊的体细胞克隆研究中,大多数是通过手术法将激活后第2天(卵裂期)^{[9, 10, 11, 12]}甚至第1天(1细胞期)^[13]的胚胎移植到受体山羊的输卵管中,也有个别报道是将克隆囊胚移植到受体羊子宫角^{[14, 15]}。

本研究分别将体外培养至1细胞期、2~8细胞期和桑椹胚、囊胚期的转hLF基因克隆胚胎移植到同期受体羊的输卵管或子宫角内,以研究不同胚龄对转基因克隆山羊生产效率的影响。其中,移植1细胞期和2~8细胞期克隆胚的受体羊产羔率分别达到12.82%和14.29%,得到6只转hLF基因克隆奶山羊;而移植桑椹胚、囊胚的37只受体羊仅有1只妊娠,且并没有得到活的后代。原因可能是由于山羊克隆胚胎对体外培养环境更敏感,随着体外培养时间的延长,克隆胚胎质量下降,影响了胚胎移植的受胎率。

由于体内外胚胎发育环境的差异,体外培养的胚胎质量尚不及体内胚胎。所以,为了提高体外生产胚胎质量,在早期的胚胎移植研究中,会采用中间受体培养法^[16]。它是将体外生产的胚胎移入中间受体的输卵管内,经过几天的培养后再回收囊胚进行胚胎移植。而早前体细胞克隆研究中,移植山羊克隆囊胚获得活的后代就是采用这种方法^{[14, 15]}。但是中间受体的方法培养克隆囊胚技术太复杂,成本较高,不适合用于转基因克隆动物的大规模生产。本研究的结果可以认为,克隆胚胎经过1~2 d的短时间体外培养,移植到受体羊输卵管后,跟中间受体法相当,胚胎质量好,能得到较高的胚胎移植受胎率,比较适合用于克隆山羊研究和生产。

3.2 季节对转基因核移植奶山羊生产的影响

动物繁殖是一个复杂和消耗能量的活动,一些内部和外部的条件(能量负平衡,应激,恶劣的季节)都会影响动物繁殖的成功,使繁殖活动受到抑制^[17]。不同季节气候条件的不同,对克隆胚胎的质量和受体羊的妊娠也会造成影响。

本研究结果显示,秋季对于转基因克隆胚胎的移植来说是最好的季节。与秋季相比,虽然春季妊娠率跟秋季相近,但是春季有更多的怀孕受体羊流产。在许多物种中,繁殖活动被限制在一年的某个时期,使后代出生在春季或夏季,确保能在最佳的环境条件下,得到更容易存活的生产条件^[18]。山羊属短日照动物,虽然一年四季均可发情,但在某些季节的繁殖率较低,最佳自然繁殖季节在9至11月份。山羊这种季节性繁殖活动是受内源性生理节律调节的,对内源性生理节律影响最大的是光周期^[18],而光周期主要是通过调节体内激素水平来影响动物繁殖活动^[19]。由于春季日照时间是逐渐增加,所以本试验认为,春季移植转基因克隆胚胎的受体羊流产率高可能是由于其对光周期造成的体内激素水平的变化更为敏感造成的。

在所有的3组中,冬季的妊娠率较低,且由于多数怀孕受体流产,产羔率极低,而在实际生产中,自然交配的山羊则没有发现这种差异。因此我们可以假定,转基因克隆胚胎在冬季繁殖效率低的原因是由于体外操作程序造成的。因为,与山羊正常繁殖相比,转基因克隆胚胎在胚胎移植手术时会直接暴露在冷的气温下,而这可能影响克隆胚胎的发育。而Bilton等^[20]研究中也发现,胚胎暴露在低温环境下会降低胚胎的发育潜能及其产羔率。因此,本研究认为,冬季转基因克隆胚胎移植的受体山羊受胎率和产羔率低是由胚胎的生产和移植过程中暴露在低温中造成的。

3.3 植入胚胎的数量对怀孕羊流产的影响

在本试验中,受体羊选用当地的黄淮山羊,该品种的产羔率在250%左右。在山羊受精胚胎的移植中,一般会植入1~4枚胚胎^[21]。目前,大多数活的克隆山羊都来自移植1~8细胞胚胎到输卵管的受体,每一个受体通常植入7~10枚胚胎,妊娠率为17%~50%^{[9, 10, 13, 14]},显然这是由于克隆胚胎发育能力较差。为了提高克隆山羊的生产效率,一些研究者提高了植入的胚胎数量^{[11, 22, 23]}。

本试验结果显示,虽然植入10~20枚胚胎组妊娠率要显著高于5~9枚胚胎组,但由于10~20枚胚胎组流产率高,最终的产羔率并没有显著差异。相似研究也发现,增加移植克隆胚胎数量可以提高受体羊妊娠率,甚至移植胚胎数量提高到40枚,可以得到73%的妊娠率,但是其受体流产率也高达63%^[24]。体细胞克隆研究发现,如果核重编程中表观遗传修饰标志清除或重建失败,就会导致重构胚全能性消失,从而影响后期的分化和发育^[25],使移植胚胎的受体流产。因此,本研究推断,植入克隆胚胎数量过多时,着床的胚胎也会增加,这样会大大增加受体流产的概率,反而降低克隆动物的生产效率。

综上所述,转基因体细胞克隆山羊胚胎移植的最佳方案是在秋季植入激活后体外培养2 d内的胚胎。由于各个胚胎实验室条件的差异,在体细胞克隆山羊生产试验前,可以使用中间受体法检测得到克隆胚胎囊胚发育率,根据克隆胚胎体内发育情况确定每只受体植入克隆胚胎的数量。