水稻是世界上最重要的粮食作物之一,我国60%以上的人口以水稻为主食,水稻产量的高低对保障我国粮食安全起着重要作用。自20世纪70年代推广利用杂交种以来,我国水稻单产有了大幅提高,杂交粳稻的增产优势在实际应用中一般能达到10%左右^[1]。近年来鉴于籼粳亚种间杂种优势强大,水稻籼粳杂交超高产育种引起了育种部门较多的关注。虽然籼粳亚种一般存在株高偏高、生育期偏迟以及结实率较低等问题,但经过科研攻关,长江中、下游地区已创制了K264806、F5032、K6876、C84等一批籼粳中间型恢复系,并培育了甬优系列、春优系列等籼粳杂交组合在生产上推广应用^{[2, 3]}。

尽管杂种优势利用在水稻生产应用中取得了重大成就,但对水稻杂种优势分子机制的研究并不够深入,显性和超显性假说是杂种优势的两种代表性假说,但不适用于阐述杂种优势的分子机制,而且两种假说均难以概括复杂的杂种优势现象^[4]。目前普遍认为杂种优势是由杂种基因的差异表达所引起,通过比较杂种与亲本基因表达产物的差异并分析差异表达基因的生物学功能和代谢通路,可期望从分子水平上阐明杂种优势形成的机制。mRNA差异显示技术为分析杂种与亲本基因表达质的差异提供了可能,并在不同的作物中开展了大量的研究^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]},但由于该项技术限制了试验规模,不同研究的结论存在很大的矛盾性^[11]。许多研究表明杂种与亲本间的基因表达差异主要体现在量的差异,而不是质的差别上^{[12, 13, 14]}。利用基因芯片等技术开展的基因表达谱研究,具有高通量以及平行性等优点,并能揭示基因表达的数量变化,令大规模平行研究基因表达成为可能。近年来,利用基因表达谱分析了籼型杂交稻‘两优培9’^{[15, 16, 17, 18, 19]}、‘两优2163’^[19]、‘两优2186’^{[15, 19]}以及籼粳杂交稻‘协优9308’^[20]等杂种与亲本之间的基因表达差异,发现差异表达基因多与碳水化合物代谢^{[19, 20]}和能量代谢有关^[19],并在碳固定^{[19, 21]}和光合作用^[21]等代谢通路中显著富集。

目前,利用基因表达谱对水稻杂种优势分子机制的研究多集中于籼稻,籼粳杂交稻的研究较少,而利用基因表达谱技术对水稻籼粳杂种叶片组织开展的基因差异表达分析尚未见报道。Affymetrix表达谱芯片具有重复性好、杂交特异等优点,已经获得了广泛应用。本研究利用Affymetrix水稻表达谱芯片考察了强优势籼粳杂交组合‘申9A/繁31’与其双亲在幼穗分化初期剑叶组织的基因表达差异,并分析了差异表达基因的生物学功能和代谢通路,旨在研究水稻籼粳交杂种优势的分子基础,以期为水稻籼粳交杂种优势分子机制的阐明以及分子标记预测杂种优势奠定基础。

供试材料包括粳稻不育系‘申9A’、籼粳中间型恢复系‘繁31’以及两者配制的强优势籼粳交组合‘申9A/繁31’,均由上海市农业科学院作物育种栽培研究所提供。‘申9A’是以‘寒丰A’为母本,以‘花选-9’为父本杂交后再与‘花选-9’连续回交转育而成的粳稻不育系,表现花时集中,开花习性好,繁制种产量高,以‘申9A’作母本育成了近年来上海市种植面积最大的杂交粳稻组合‘花优14’^[22],该组合的选育与利用获得了2014年度上海市科技进步一等奖。‘繁31’由籼粳中间型恢复系‘C84’的天然突变株选育而成,表现穗型大,优势强。强优势籼粳交组合‘申9A/繁31’在2013年上海市农业科学院庄行综合试验站的水稻生产试验中产量达到11 253 kg · hm^-2,比对照强优势杂交粳稻组合‘花优14’增产8%,2014年在上海市产业体系高产攻关示范中实割产量达到12 051 kg · hm^-2,产量优势特别突出。2014年5月17日,将3份材料播种于上海市农业科学院庄行综合试验站,6月21日移栽,在产量形成的重要时期幼穗分化初期,每个材料选取生长整齐一致的10株调查表型,包括剑叶长、剑叶宽、分蘖和株高(地面到最高叶片叶尖的距离),并剪取主蘖的剑叶迅速放入液氮冷冻,保存在-80 ℃冰箱备用。成熟后每个材料选取10株考察千粒质量和每穗实粒数,并统计生育期。

RNA用Trizol试剂提取,抽提所得RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies)电泳质检合格后使用RNeasy Micro Kit(Cat#74004,QIAGEN)和RNase-Free DNase Set(Cat#79254,QIAGEN)纯化总RNA。将提取的RNA送上海伯豪生物技术有限公司进行基因芯片分析,采用Affymetrix表达谱芯片配套试剂盒和标准操作流程对总RNA中的mRNA进行放大、标记和纯化,获得带有生物素标记的cRNA。按照Affymetrix表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒进行芯片的杂交和洗涤。芯片结果采用GeneChip Scanner 3000进行扫描,用Command Console Software 3.1读取原始数据,质控合格的数据采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理,所用的算法为MAS 5.0。

以上调和下调2倍为标准筛选差异表达基因和非加性表达基因,即差异倍数≥2或≤0.5。参考许晨璐等^[11]对非加性表达基因进行定义和分类,本研究以杂种表达量与中亲值达到2倍差异的基因作为非加性表达基因,中亲值=(父本表达量+母本表达量)/2。非加性表达基因可以分为4种表达模式:1)超高亲,指杂种表达量显著大于高亲,以杂种表达量>2倍高亲作为筛选标准;2)偏高亲,指杂种表达量显著偏向高亲,以杂种表达量≥2倍中亲值且≤2倍高亲作为筛选标准;3)偏低亲,指杂种表达量显著偏向低亲,以杂种表达量≤0.5倍中亲值且≥0.5倍低亲作为筛选标准;4)低于低亲,指杂种表达量显著低于低亲,以杂种表达量<0.5倍低亲作为筛选标准。

2 结果与分析 2.1 杂种‘申9A/繁31’与双亲农艺性状比较

从表 1可以看出:杂种‘申9A/繁31’的剑叶长介于双亲之间,且与双亲均存在显著差异(P<0.05);杂种株高与双亲存在显著差异(P<0.05),并且具有明显的超亲优势;杂种剑叶宽与母本‘申9A’存在显著差异(P<0.05),杂种分蘖与父本‘繁31’存在显著差异(P<0.05)。可见,幼穗分化初期杂种与双亲的表型已经产生了明显差异(P<0.05),杂种基因与双亲相比表达方式可能发生了改变。从成熟后调查的性状来看,杂种与父本‘繁31’相比,表现超亲晚熟,并且在千粒质量和每穗实粒数2个产量性状上优势突出。

本研究使用的Affymetrix水稻表达谱芯片共包含57 258个探针组,代表着51 279个转录本。芯片杂交结果显示,分别有26 734、27 787和27 409个探针组在父本‘繁31’、杂种‘申9A/繁31’以及母本‘申9A’中检测到杂交信号,各占探针组总数的46.7%、48.5%和47.9%。对57 258个探针组进行统计处理,去除存在重复、对应多个基因等情况的探针组,使探针组对应的基因没有重复,最后发现有20 407个探针组至少在一个材料中检测到杂交信号。

分析20 407个探针组对应的基因在父本‘繁31’和母本‘申9A’之间的差异表达情况,以信号差异倍数≥2或≤0.5为标准,发现有2 448个基因在双亲之间具有表达差异,在父本中上调和下调表达的基因数目分别为1 068和1 380个。分析杂种‘申9A/繁31’与亲本之间基因的差异表达情况,在杂种和母本‘申9A’之间筛选到752个差异表达基因,其中474个在杂种中上调表达,278个在杂种中下调表达;在杂种和父本‘繁31’之间筛选到1 833个差异表达基因,其中1 180个在杂种中上调表达,653个在杂种中下调表达。杂种与两亲本之间共检测到2 258个差异表达基因,其中与双亲均显示差异表达的基因有327个(图 1),对327个基因进一步分析,发现有297个基因在双亲之间表达并无显著差异,这297个基因最有可能参与了‘申9A/繁31’杂种优势的形成。

	图 1 杂种“申9A/繁31”与双亲之间的差异表达基因Fig. 1 Differentially expressed genes between Shen9A/Fan31 and its parents
图选项

分析杂种与双亲之间2 258个差异表达基因的表达模式发现,有521个基因明显呈非加性表达,占到总差异表达基因的23.1%,其中超高亲、偏高亲、偏低亲和低于双亲4种表达模式基因的数目分别为120、102、260和39个,偏低亲表达模式的基因数目最多,占到非加性表达基因的49.9%,低于低亲表达模式的基因数目最少,占到非加性表达基因的7.5%。

为了分析杂种与双亲差异表达基因的功能,对2 258个差异表达基因进行了基于生物学过程的GO功能分类。结果发现,差异表达基因主要在碳水化合物代谢、防卫反应等12个生物学过程极显著富集(P<0.01),其中参与磷代谢、运输、防卫反应以及碳水化合物代谢过程的基因数目最多,分别为125、120、93和79个(表 2)。对参与这些生物学过程的基因进行差异表达情况分析,发现了许多呈超亲表达模式的基因,其中参与碳水化合物代谢过程的超高亲表达基因最多(8个),值得注意的是,虽然在磷代谢过程和运输过程呈超高亲表达模式的基因较少,但是却发现了许多呈偏高亲表达模式的基因(表 3)。

为进一步了解哪些代谢通路在杂交组合‘申9A/繁31’中发生了改变,对2 258个差异表达基因进行了代谢通路的分析(表 4)。结果发现:差异表达基因在苯丙素生物合成、苯丙氨酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢3个代谢通路中显著富集(P<0.05),此外,酪氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成2个氨基酸代谢通路也富集了较多的差异表达基因,显示氨基酸代谢可能与杂种优势密切相关。值得注意的是,碳固定和糖酵解/糖原异生2个代谢通路虽然没有达到显著性水平,但是却富集了较多的差异表达基因(10和15个),显示这2个代谢通路极可能也参与了杂种优势的形成。此外,与相关研究^[21]一致的是,本研究也发现有差异表达基因在磷酸肌醇代谢通路富集(5个)。

一般认为,大多数产量及其相关性状受父本的影响较大^{[23, 24]},而本研究从分子水平对强优势籼粳交组合‘申9A/繁31’及其亲本的研究发现,杂种与母本之间差异表达基因远少于父本,说明在幼穗分化初期,杂种基因的表达更倾向于母本,母本对杂种的贡献更大。这可能与杂种基因的时空表达有关,不同组织不同时期基因的表达存在一定差异,父本基因可能对杂种穗部性状的影响较大,而母本基因对杂种幼穗分化初期叶部形态及生理功能的作用更大,同时也说明,在选育强优势杂交水稻新组合时,母本的作用也不容忽视。虽然杂种与双亲相比,上调表达的基因远多于下调表达的基因,但分析基因的非加性表达模式却发现,杂种偏低亲表达的基因占非加性表达基因的比例却最高(49.9%),可见,不仅具有正效应基因的增强表达对杂种优势有贡献,具有负效应基因的抑制表达对杂种优势的形成可能也起到了重要作用。

光合作用是作物生产最基本的生理过程之一,也是重要的生物合成过程,植物干物质90%以上是通过光合作用合成的^[25]。碳固定作为光合作用的重要步骤,可以影响光合效率进而影响到作物产量。Bao等^[15]利用SAGE技术对‘两优培九’及双亲的稻穗、叶片及根系进行了表达谱研究,表明大多数上调表达的基因与碳、氮同化有关;Song等^[21]对杂交水稻‘两优2186’差异表达基因的代谢通路分析以及Peng等^[19]对‘两优2163’‘两优2186’和‘两优培九’3个杂交水稻组合的分析,均表明差异表达基因在碳固定代谢通路显著富集。本研究也发现10个差异表达基因参与了碳固定代谢通路,并且多数基因呈中亲(杂种表达量与中亲值没有显著差异)、偏高亲或超高亲表达模式,如具有核酸结合功能的Os 10g0390600 表达量是父本的5.03倍,母本的3.06倍,说明杂种碳同化能力提升可能是杂种优势产生的重要原因。此外,本研究还发现差异表达基因在磷代谢过程显著富集,磷是磷脂分子的重要组成元素,可以影响叶绿体膜的结构和功能,相关研究表明,磷参与了光合作用的各个环节,包括光能吸收、同化力的形成以及对一些关键性酶活性的影响等^[26],与光合效率密切相关^[27]。在本研究中,许多参与磷代谢过程的基因呈偏高亲表达模式,如具有含磷基团转移功能的Os 12g0460800 表达量是父本的62.89倍,显示参与磷代谢基因的差异表达引起的叶片磷水平的改变可能对光合效率的提高产生了重要影响。可见,参与碳固定和磷代谢的基因同杂种优势密切相关,由这些基因表达方式改变所引起的杂种光合效率提高可能是杂种优势产生的重要原因。不同水稻组合均检测到差异表达基因在碳固定代谢通路富集,说明碳同化能力提升对不同水稻组合杂种优势的影响具有普遍性。

植物叶片通过光合作用形成同化产物,光合同化产物向各个器官的运输与分配直接关系到植物体的生长和经济产量的高低。Song等^[21]发现超级杂交稻品种‘两优2186’和‘两优培九’在生物量和收获指数上都超越了双亲,并且收获指数高于普通杂交稻品种‘SY63’,据此推测超级杂交稻的产量优势不仅和光合效率提高有关,还涉及到光合产物的分配效率等其他因素。本研究利用表达谱芯片分析了杂种同双亲之间的基因表达差异,并对差异表达基因进行了基于生物学过程的GO功能分析,发现差异表达基因在运输过程显著富集,并且许多基因呈偏高亲表达模式,如Os 10g0552700和Os11g0485200 表达量分别是父本的16.96倍和24.12倍,说明除了光合效率提高之外,杂种‘申9A/繁31’光合产物运输分配效率的提高可能也是杂种优势产生的主要原因。

此外,‘申9A/繁31’杂种优势的产生可能还受其他多种因素的影响,如本研究发现杂种差异表达基因在多个氨基酸代谢通路富集,氨基酸代谢与植物的生长发育有关,如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成对植物蛋白质、信息素、抗氧化剂和木质素等生物质的合成非常重要^[25],氨基酸代谢有可能通过影响作物光合同化潜力从而对杂种优势产生影响。另外,本研究还发现有较多的差异表达基因在糖酵解/糖原异生以及磷酸肌醇代谢通路富集,磷酸肌醇代谢在植物的生长、发育和细胞信号转导方面发挥着重要作用^[21]。尽管碳同化能力提升对杂种优势的影响具有普遍性,但是不同组合杂种优势的形成机制又存在一定差异,从而产生了不同的杂种优势水平,体现了杂种优势分子基础的复杂性。