水稻种子耐贮藏特性是一个重要的农艺性状,不仅对种子生产和种质资源保存有重要意义,对稻谷作为粮食贮藏时,减缓粮食陈化变质更有现实意义。陈化表现为种子活力下降、发芽率降低、糙米表面色泽变黄变暗、蒸煮和食味品质变差、营养成分破坏,同时气味变得难闻等,导致种子的播种品质和食(饲)用品质下降。具有良好耐贮性的种子在长时间贮藏后仍然表现出较高的潜在萌发与出苗能力以及保持较好的食(饲)用品质^[1]。高温潮湿尤其是潮湿的环境易引起水稻种子衰老劣变的速率加快,导致种子陈化变质,甚至丧失生命力,是水稻产业中一个很严重的问题^[2]。因此,加强水稻种子耐贮性的遗传研究,对培育良好的耐贮性品种,解决因陈化变质引起的严重损失具有重要意义。目前,已有很多研究者利用不同的群体相继开展了水稻种子耐贮性相关QTL分析,除了第8和第10染色体外,在其他10条染色体上都定位到了耐贮性相关QTL,表明种子耐贮性是受多基因控制的复杂的数量性状^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]}。然而,至今还没有种子耐贮性相关基因被克隆的报道。

本实验室Li等^[8]在南京、连云港、金湖3个不同环境下种植Koshihikari/Kasalath//Koshihikari BIL群体,进行种子耐贮性相关QTL分析,在第9染色体标记R10783S与R1751之间检测到qSS-9,可解释表型变异的10.63%~33.10%,并且利用CSSL群体验证了qSS-9的真实性。本研究在此基础上,利用一个以‘Koshihikari’为背景、‘Kasalath’为置换片段的染色体片段置换系SL226与‘Koshihikari’回交,构建次级F₂分离群体,对qSS-9进行精细定位,以期获得与其紧密连锁的分子标记,为该主效QTL的图位克隆和水稻耐贮性分子标记辅助育种提供基础。

1.1 供试材料

‘Koshihikari’‘Kasalath’和一个以‘Koshihikari’为背景、包含qSS- 9 的‘Kasalath’染色体片段置换系SL226(遗传背景图见图 1^[10]),由日本农业生物资源研究所提供。本研究构建了由‘Koshihikari’×SL226衍生的含有272个单株组成的次级F₂分离群体。2012年夏秋,将‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226种植于南京农业大学土桥水稻试验站(南京市江宁区淳化街道土桥社区)。2013年夏秋季继续将‘Koshihikari’‘Kasalath’、SL226及其衍生的272个单株组成的F₂次级群体种植在该基地。

图 1 染色体片段置换系SL226的遗传背景图(Shigemune等[10])Fig. 1 Genetic background of the SL226 derived from a backcross between‘Koshihikari’ and‘Kasalath’(Shigemune et al[10])黑色:‘Kasalath’纯合插入片段;方形框:Li等[8]在Koshihikari/Kasalath//Koshihikari BIL群体中检测到的qSS- 9 位置。 Black square represents the homozygous‘Kasalath’insertion;Hollow square represents the loci of qSS- 9 detected in Koshihikari/Kasalath//Koshihikari BILs by Li et al.[8]

图选项

从F₂分离群体中,用标记Y2-L9-6、Y8-L9-6、RM7390-Y14和RM7390-Y5(标记序列信息见表 1)进行筛选,选择标记片段为Koshihikari/Kasalath杂合基因型的4个不同交换单株,于2013年11月中旬至4月中旬在海南省陵水县南京农业大学南繁基地种植衍生成F₃家系,每个家系种20个单株,利用1个SSR标记和11个Indel标记(表 1)在每个F₃家系中挑选‘Kasalath’纯合置换的单株,于2014年夏秋季在土桥试验站将其种成4个F₄家系,每家系种20个单株,即组成4个不同长度‘Kasalath’置换片段的小片段置换系,分别命名为K-subl1~K-subl4。

水稻种植行距20 cm,株距13.3 cm,每穴一苗,田间水肥病虫管理同常规大田。调查抽穗期(单株第1穗穗尖抽出剑叶超过1 cm时),抽穗35 d后收获种子,在50 ℃烘箱中处理5 d破除种子休眠性,然后在室温小于30 ℃、湿度在40%~60%环境中存放或进行人工老化处理。

自然老化方法参照Li等^[8]的方法。2013年和2012年收获的‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226种子在室温小于30 ℃和40%~60%湿度条件下分别存放1年和2年。

人工老化方法参照Zeng等^[5]的方法,略作修改。将2013年和2014年收获的‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226种子,在智能型种子老化试验箱(型号为LH-300S,南京研奥仪器设备有限公司)中设定40 ℃和85%湿度下分别处理30和35 d。2013年收获的F₂分离群体、亲本和2014年收获的4个小片段置换系、亲本,在同样人工设定的条件下均处理35 d。

老化处理后种子的发芽率通常作为种子耐贮性的间接评价指标。亲本和每个单株(F₂分离群体272个单株和4个不同F₄家系各单株)随机选取50粒健康饱满的种子,放入铺有2层滤纸的9 cm培养皿中,加入8 mL水,置于30 ℃光照培养箱中培养7 d,以胚根超过半粒种子长和胚芽超过种子长度为发芽标准统计发芽率,3次重复,以发芽率的高低判断种子的耐贮性强弱。将发芽率作反正弦转换[arcsin(x)^1/2]后,用于QTL检测。

于分蘖期取叶片1~2张,将叶片剪碎置于2.0 mL离心管中,用液氮迅速冷冻并将其打碎成粉末。DNA的提取采用Dellaporta等^[11]的方法。

用双蒸水将DNA样品稀释成20 ng · μL^-1的工作液,作为PCR扩增反应的模板,PCR反应采用Chen等^[12]的方法,略作修改。10 μL PCR扩增反应体系包括:10 mmol · L^-1 Tris-HCl pH 8.3,50 mmol · L^-1 KCl,1.5 mmol · L^-1 MgCl₂,50 μmol · L^-1 dNTPs,0.2 μmol · L^-1引物,0.5 U Taq polymerase和 20 ng DNA模板。扩增反应在A100 Thermal Cycler PCR仪上进行:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35个循环;72 ℃ 10 min。

PCR扩增产物用80 g · L^-1的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据Sanguinetti等^[13]的方法银染显色。DNA带型在观片灯上进行观察,读取并记录标记基因型数据。

利用位于标记C1454与R1751之间、亲本间具有多态的1个SSR标记和9个Indel标记,分析F₂分离群体272个单株的基因型,获得每个单株的基因型数据。利用作图软件Mapmaker 3.0确定分子标记连锁关系^[14],绘制该区段的遗传图谱。利用Windows QTL Cartographer 2.5软件^[15],采用复合区间作图法(composite interval mapping,CIM)对F₂群体的种子耐贮性进行QTL检测,以LOD≥2.5为阈值判断QTL是否存在。

根据National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站提供的基因组序列,利用Primer Premier 5.0软件开发Indel标记。SSR和Indel引物由上海英骏生物技术有限公司合成。本研究用于qSS- 9 定位分析的SSR和Indel标记序列见表 1。

利用高温高湿人工老化处理方法鉴定种子耐贮性,结果如图 2所示,2013年和2014年收获的SL226种子在人工老化处理30 d后发芽率分别为(91.1±6.9)%和(90.7±2.3)%,背景亲本‘Koshihikari’的发芽率分别为(36.7±12.0)%和(24.0±8.0)%,两者之间存在极显著差异(P<0.01)。而‘Kasalath’种子仍然保持正常的萌发能力,发芽率均超过98%。人工老化处理35 d后,‘Koshihikari’的发芽率分别为(3.3±3.3)%和0,而SL226的发芽率分别为(80.0±3.3)%和(68.0±1.9)%。

	图 2 人工老化处理后‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226的种子发芽率Fig. 2 Germination rates of‘Koshihikari’‘Kasalath’and SL226 after artificial aging treatments**表示与‘Koshihikari’的发芽率比较,在0.01水平上存在极显著差异。 Two asterisks indicate significant difference at 0.01 probability level between each line and ‘Koshihikari’. The same as follows.
图选项

利用自然老化处理方法鉴定种子耐贮性,结果如图 3所示,收获的新鲜种子发芽率都接近100%。自然老化1年后,‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226的发芽率仍然保持在88%以上,没有显著性差异。然而,自然老化2年后,‘Koshihikari’发芽率降低至(40.0±6.7)%,而‘Kasalath’和SL226的发芽率均在90%以上,与‘Koshihikari’相比,均表现出极显著差异(P<0.01)。结果说明,置换系SL226的种子耐贮性显著高于背景亲本‘Koshihikari’,qSS- 9 真实存在,且稳定表达,‘Kasalath’在qSS- 9 位点上的等位基因表现出增强种子耐贮性的效应。

	图 3 自然老化处理后‘Koshihikari’‘Kasalath’和SL226的种子发芽率Fig. 3 Germination rates of‘Koshihikari’‘Kasalath’and SL226 after natural aging treatments
图选项

如图 4所示:人工老化处理35 d后,‘Koshihikari’发芽率降至3.3%,SL226发芽率为80%,两者之间差异极显著(P<0.01)。F₂群体的272个单株的种子发芽率呈连续性分布,平均值为20.4%,变异范围在0~100%,表现为单峰连续性分布,并出现超亲变异。利用Windows QTL Cartographer 2.5软件,对F₂群体的种子耐贮性进行QTL分析,在位于第9染色体上的标记RM7390与L9-13 之间,检测到了主效QTL qSS- 9 ,与标记Y9距离最近,LOD值为30.94,加性效应为17.25%,对表型变异的贡献率为44.02%,说明qSS- 9 是真实存在并稳定表达的主效QTL。

	图 4 ‘Koshihikari’/SL226 F2分离群体在人工老化处理35 d后的种子发芽率次数分布图Fig. 4 Frequency distribution of germination rates in the F2 population derived from‘Koshihikari’ and SL226 after artificial aging for 35 days箭头分别代表‘Koshihikari’、SL226和F1的发芽率。The arrowheads represent germination rates of‘Koshihikari’,SL226 and F1,respectively.
图选项

2.3 4个不同的近等基因系种子耐贮性表型及qSS- 9 的精细定位

将4个小片段置换系和亲本的种子在人工老化处理35 d后测定发芽率,各家系内所有单株发芽率的平均值代表该家系的表型值,并与‘Koshihikari’的表型值进行差异性t测验。如图 5-A和5-B所示:这4个小片段置换系在包含标记Y9的Y8和Y14区间都存在纯合的‘Kasalath’替换片段,老化处理后发芽率均大于79%,而‘Koshihikari’发芽率低至0%,与‘Koshihikari’相比,均存在极显著差异(P<0.01)。结果说明,在RM7390与L9-13之间确实存在控制种子耐贮性的QTL qSS- 9 。同时,将qSS- 9 定位在标记Y7与Y13的缩小区间范围,该区间在‘Nipponbare’基因组上的物理距离约为478 kb。

	图 5 4个携带‘Kasalath’不同长度置换片段的小片段置换系和‘Koshihikari’的基因型绘图及表型值Fig. 5 Genotypes and phenotypes of four sub-NILs with different inserted‘Kasalath’segments and‘Koshihikari’A:黑色表示‘Kasalath’基因型,白色表示‘Koshihikari’基因型;B:人工老化处理35 d后的发芽率。 A:The black regions indicate‘Kasalath’alleles and the white regions indicate‘Koshihikari’alleles. B:Germination rates after artificial aging for 35 days.
图选项

种子耐贮性是一个复杂的数量性状,受种子发育期间环境条件、贮藏条件和遗传基因等因素的共同影响。劣变种子通常会给农作物生产造成巨大的经济损失。因此,水稻种子耐贮性的遗传改良已成为水稻育种的重要目标之一。目前,已有大量研究定位了多个水稻种子耐贮性相关QTL,其中在第9染色体上存在一个主效QTL,它在多个不同遗传背景下均被检测到。Miura等^[3]利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare BIL群体最先检测到1个主效QTL qLG- 9 ,定位于第9染色体标记G103与R1751之间,该区间在‘Nipponbare’的基因组上的物理距离约为3.6 Mb,贡献率高达59.5%。随后,Sasaki等^[4]、Xue等^[6]、Jiang等^[7]利用不同的遗传群体在第9染色体上均检测到位置与qLG- 9 重叠的主效QTL,分别为RC9- 2、qRGR-9、qMT-SGC9.1和qDT-SGC9.1 。本实验室Li等^[8]利用Koshihikari/Kasalath//Koshihikari BIL群体检测到qSS- 9 ,位于标记R10783S与R1751之间,该区间在‘Nipponbare’的基因组上的物理距离约为8.0 Mb,与qLG- 9位点位置一致,说明qSS-9 确实是一个稳定表达的控制耐贮性的主效QTL,普遍存在于水稻中,其在育种实践中具有广泛的应用前景。因此,完成qSS- 9 的精细定位和克隆,对提高稻谷的耐贮藏特性和保持种子高活力具有重要的现实意义。

本研究利用染色体片段置换系SL226与‘Koshihikari’回交,然后自交,构建次级F₂分离群体,同时,利用分子标记筛选4个不同的F₂交换单株,构建成4个携带不同大小的‘Kasalath’纯合插入片段的F₄家系对qSS- 9 进一步定位分析,结果将qSS- 9 定位在Indel标记Y7与Y13之间,该区间在‘Nipponbare’的基因组上的物理距离约为478 kb,与Miura等^[3]定位的3.6 Mb和Li等^[8]定位的8.0 Mb相比,大大缩小了定位区间。本研究结果有助于该主效QTL的图位克隆。与qSS- 9 紧密连锁的标记为开展水稻耐贮性分子育种提供分子标记依据。

水稻耐贮性在籼粳之间存在变异。Rao等^[16]指出,水稻亚种间的耐贮性从强到弱顺序为indica、javanica、japonica。利用多个不同遗传背景的群体,在多年多点条件下充分挖掘籼稻中更多的耐贮性相关QTL,结合分子标记辅助选择聚合多个QTL,可以有效改良种子耐贮性。

农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室、长江流域杂交水稻协同创新中心、江苏省现代作物生产中心给予资助,谨致谢意。