多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类内生孢子的非致病性细菌,能产生多黏菌素等抗生素和杀镰孢菌素等抗菌蛋白来抑制革兰氏阴性细菌病原菌或者真菌病原菌的生长,从而起到防控病害的作用^{[1, 2]},并通过固氮和溶磷作用帮助植物获取营养,促进植物生长^[3]。Paenibacillus polymyxa SQR-21为本课题组从黄瓜根际分离、筛选得到的1株具有高效广谱拮抗作用的植物根际促生菌,以菌株SQR-21为主要功能添加菌制成的生物有机肥施用于连作年限较短(3年内)的西瓜土壤上可降低70%的枯萎病发生率^[4]。该生物有机肥已经商品化生产并且广泛用于促进植物生长及防控土传病害,效果明显^{[5, 6]}。

土壤微生物与植物互作提高植物抗逆性和产量等的报道较多,并且对其机制的研究相应也在增加,主要观点是根际沉积(rhizodeposition)的发生使根际积累大量物质,它们在植物与微生物之间发挥着抑制或杀死病原菌、传递信息、活化难溶的营养元素等作用,且自身也能够作为养分物质。Neumann等^[7]研究认为某些条件下可以控制特定化合物的释放从而溶解根际的营养物质,以一种适应调节的响应来提高植物在生态系统中的竞争力;Mandal等^[8]总结酚酸在植物与微生物共生体系中的信号分子作用时,提出酚类化合物诱导了根瘤基因从而使植物和真菌间建立了丛枝菌根系统。根系分泌蛋白在互作关系中的作用虽早有研究^[9],但并不深入,近年来才开始更多地分析蛋白的具体作用。De-la-Peña等^[10]研究了拟南芥、紫花苜蓿与丁香假单胞菌(拟南芥的病原菌)、苜蓿中华根瘤菌(紫花苜蓿的共生菌株)互作下分泌蛋白的异同,发现不同的植物与微生物互作体系下根系的分泌蛋白是不同的,并由此推断植物与微生物能否共生,蛋白可能是其信号传导和相互识别过程的关键因子。

多黏芽孢杆菌SQR-21作为比较理想的拮抗和促生细菌,能够分泌纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶等,用于生物肥料中可以很好地在西瓜根际定殖生长并能保护西瓜根部免受病原菌侵染^[6],降低病害发生率并提高作物生物量和产量^[4]。Ling等^[11]认为西瓜根系分泌的某些有机酸能诱引菌株SQR-21到根表定殖。然而,有关西瓜与菌株SQR-21互作时响应蛋白的研究还未开展,相应的机制并不清楚。因此,本试验采用水培的方法,在西瓜苗期接入菌株SQR-21,通过对照与接菌处理之间的比较,研究SQR-21对西瓜根系分泌蛋白的影响,旨在从蛋白质组学角度分析菌株SQR-21与西瓜互作的规律,以阐明其提高西瓜代谢能力和抗病害能力的机制。

供试西瓜(Citrullus lanatus)品种为‘早佳84-24’,购于新疆哈密瓜种业有限责任公司。

供试菌株为多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SQR-21,由本实验室筛选并保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌株保藏号为:CGMCC No.1544。

挑选相同大小的西瓜种子,用1%(体积分数)次氯酸钠浸泡15 min,无菌水漂洗3~5次,50 ℃浸种30 min,放在垫有湿润滤纸片的平板中于30 ℃催芽,催芽过程中保持种子湿润;将萌发的种子放入灭菌的蛭石中培养,种子出芽子叶变绿后移至水培中,先用1/2改良的霍格兰营养液(PNS)培养,植株长出2片真叶后用原浓度PNS培养至试验结束,每2~3 d更新营养液。改良的霍格兰营养液(PNS):KNO₃ 5 mmol·L^-1,Ca(NO₃)₂ 2 mmol·L^-1,MgSO₄ 2 mmol·L^-1,Fe-EDTA 0.05 mmol·L^-1,磷酸缓冲液(KH₂PO₄-K₂HPO₄) 1 mmol·L^-1,微量元素[(100×):H₃BO₃ 0.434 g,MnSO₄·H₂O 1.762 6 g,CuSO₄·5H₂O 0.079 8 g,ZnSO₄·7H₂O 0.172 g,NaCl 0.585 g,CoCl₂·6H₂O 0.001 29 g]。

1.3 处理设置与接菌方法

水培试验于2013年12月15日至2014年1月25日在人工气候室内进行,共设置4个处理:1)对照A:不接菌,同处理B组同时收集根系分泌物;2)处理B:接菌2 d后收集根系分泌物;3)处理C:接菌2 d后,用无菌水冲洗掉松散附着于根表的SQR-21菌体,然后在灭菌的PNS中继续生长2 d后收集根系分泌物;4)处理D:接菌4 d后收集根系分泌物。单株苗培养,每个处理重复12次。

待西瓜植株长到4片真叶后,移至新鲜营养液中,加入一定量的SQR-21菌悬液,接种浓度为5.3×10⁶ CFU·mL^-1。菌悬液制备方法:预先用250 mL三角瓶配制50 mL NA液体培养基(每升培养基添加3 g葡萄糖),用灭菌牙签的一端在SQR-21单菌落上蘸取少量SQR-21,接种灭菌培养基中。接入SQR-21菌株的培养基于30 ℃、170 r·min^-1恒温摇床培养过夜,菌液的D₆₀₀值约0.8;将菌液于6 000 r·min^-1离心8 min,弃去上清液,用少量无菌水将沉淀菌体重悬,再次离心,无菌水再次洗涤,然后再用少量无菌水将沉淀重悬。NA液体培养基配方:葡萄糖3.0 g,牛肉浸膏3.0 g,氯化钠5.0 g,蛋白胨10.0 g,pH(7.3±0.1),蒸馏水1 000 mL。

接菌时间达到要求后,将西瓜植株取出,用水轻轻冲洗根部30 s以除去附着的菌体,然后用超纯水漂洗2~3次,置于50 mL 0.5 mmol·L^-1的CaCl₂溶液中;24 h后取出植株,将根在少量超纯水中漂洗数秒,将其与CaCl₂溶液混合,即为根系分泌物溶液。

将6株西瓜苗的根系分泌物溶液合并为1个样品,共300 mL,依次用滤纸、水相微孔滤膜(0.45和0.22 μm)抽滤,然后用超滤管(截留蛋白质相对分子质量为3×10³)纯化蛋白,将根系分泌液浓缩至500 μL。

采用BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)测定各样品的蛋白浓度,取1.4 μg蛋白进行一维凝胶电泳(SDS-PAGE),上层浓缩胶浓度为5%,下层分离胶浓度为10%。采用银染方法对PAGE胶染色,扫描染色胶片后,根据软件分析结果切取差异条带进行酶解。差异条带选择的基本原则为:各组保证有对照的样品;条带与对照相同的样品不予选取,处理中与对照不同的样品选择一个作为代表。将选取的差异条带切成碎小粒状,分别置于1.5 mL灭菌离心管中,参照文献[12]进行胶条脱色,然后用乙腈脱水至胶粒完全变白;吸干多余乙腈,真空抽干10 min;各管加入50 μL 10 mmol·L^-1二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT;10 μL 1 mol·L^-1 DTT,用990 μL 25 mmol·L^-1 NH₄HCO₃配制)56 ℃水浴1 h,冷却至室温后吸干DTT,快速加入50 μL 55 mmol·L^-1碘乙酰胺(iodacetamide,IAM;55 μL 1 mol·L^-1 IAM,用945 μL 25 mmol·L^-1 NH₄HCO₃配制),置于暗室45 min;依次用25 mmol·L^-1 NH₄HCO₃、50 mmol·L^-1 NH₄HCO₃/乙腈(体积比为1 : 1)溶液洗涤2次,每次10 min,最后用乙腈脱水到胶粒完全变白,真空抽干10 min;加入50 μL 10 ng·μL^-1的Typsin酶(Promega公司,25 mmol·L^-1 NH₄HCO₃稀释)冰上孵育30 min后,加入100 μL 25 mmol·L^-1 NH₄HCO₃于37 ℃消化过夜;加入甲酸(终浓度为0.2%)以终止酶解反应。

酶解后的样品经ZipTip微量层析柱(Millipore,USA)除盐浓缩后进行质谱鉴定。质谱仪器为高分辨液质联用仪UHPLC-LTQ Orbitrap XL MS/MS。液相色谱体系为nano UHPLC(Sunnyvale,CA,USA);质谱仪为LTQ Orbitrap XL MS(ThermoElectron,Bremen,Germany,配备纳米电喷雾离子源)。

色谱条件:毛细管液相色谱柱Acclain PepMap 100(C18,3 μm,100 Å)(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)(150 mm×300 μm,3 μm);流动相A溶液为0.1%甲酸,B溶液为0.08%甲酸与80%乙腈混合溶液,所用梯度为32 min内流动相B由5%升高至40%,然后1 min内由40%升至95%,整个过程在60 min内完成;流速为300 nL·min^-1;进样体积为5 μL。

质谱条件:采用数据依赖性采集技术(data-dependent acquisition)以便于在静电轨道阱质谱(Orbitrap-MS)与线性轨道离子阱质谱(LTQ-MS/MS)自动切换;喷雾电压为2.2 kV;毛细管温度为200 ℃;检测方式为正离子;质荷比(m/z)扫描范围为350~1 800;碰撞能量为35 V。每3 d对轨道阱的外部质量以标准物质(Thermo Scientific)进行一次校准,保证其工作质量精度在5×10^-6以内。

蛋白质鉴定:将获取的蛋白质谱数据与UniProt(http://www.uniprot.org/)蛋白数据库中黄瓜和西瓜2种作物的蛋白质进行比对,采用软件为SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)。比对的错误发现率设定为1%;质谱精度的母离子设定为10×10^-6,碎片离子相对蛋白质分子质量为0.8;全肽段允许漏切位点为2个;静态修饰选择半胱氨酸的尿甲基修饰(carbamidomethylation of cysteines),可变修饰选择甲硫氨酸残基的氧化修饰(methionine oxidation);多肽的电荷:+2、+3、+4或更高;置信度选择99%;每个蛋白至少含有一段特定肽段。数据库地址:黄瓜(http://www.uniprot.org/uniprot/?query=cucumis+sativus&sort=score);西瓜(http://www.uniprot.org/uniprot/?query=citrullus+lanatus&sort=score)。

SDS凝胶电泳图中蛋白条带分析与聚类树形图制作采用Quantity One 4.4.1软件,主成分分析采用Canoco for Windows 4.5软件。

从图 1-a可知:西瓜根系分泌蛋白的相对分子质量大小在小分子质量和大分子质量范围内分布均较多,其中相对分子质量为(40~170)×10³的范围分布较密集,相对分子质量为40×10³以下范围较稀疏。图 1-b清晰地反映了各样品间的差异:对照A与处理B相比,缺少10、17、19、28、33和39号条带,多出26号条带,同时11号条带较B更粗,颜色也更深,表明这两处对应的蛋白中对照A更为丰富;对照A与处理C相比,缺少2、6、10、17、19、28和39号条带,多出34号条带,11号条带同样更粗更深;对照A与处理D相比,缺少2、6、10、17、19、28、33和39号条带,多出26和34号条带。进一步比较可知,接菌生长4 d的样品(处理C、D)与只生长2 d的样品(处理B)相比,增加了2和6号条带,而丢失了34号条带;接菌后(处理B)增加的33号条带在根表菌体被冲洗(处理C)后丢失;对照(A)接菌后(处理B)丢失的26号条带,在根表菌体冲洗(处理C)后又重新获得。该结果表明:各处理样品的蛋白种类比对照更加丰富多样,但不同处理因接菌及生长时间的不同蛋白种类也不相同;某些蛋白会在接菌后丢失,而根表菌体被冲洗后又重新恢复,另一些蛋白又会随生长时间的增加而产生。

	图 1 根系分泌蛋白的凝胶电泳图(a)及条带模式图(b) Fig. 1 SDS-PAGE of root secreted proteins(a)and the diagram of bands(b) 1)M:蛋白分子质量标准Marker;A:对照Control;B:处理B Treatment B;C:处理C Treatment C;D:处理D Treatment D 2) 相同字母代表相同处理的重复样品;Ⅰ~Ⅸ为SDS-PAGE的泳道编号;1~47为蛋白的条带编号。 The same letter refers replicates of the same treatment;Ⅰ-Ⅸ indicate lane number;1-47 indicate band number.The same as follows.
图选项

以对照A(Ⅱ)泳道为基准比较各样品泳道相似度,处理B、C、D与A都有明显的差异,即接菌后根系分泌蛋白的种类大大增加(图 1-b)。其中处理D与对照A的差异最明显,其次为处理C。该结果说明:随着SQR-21作用时间的增加,处理与对照的西瓜根系的分泌蛋白相似度逐渐降低,即SQR-21与西瓜互作的时间越长,西瓜根系分泌的蛋白种类变化越明显;当根表松散附着的菌体被洗去后西瓜根系某些分泌蛋白也会随之改变。

通过各样品聚类分析和主成分分析(图 2)进一步发现:接菌的处理(B、C、D)与对照(A)相比西瓜根系的分泌蛋白发生了较为明显的变化,且这种变化与接菌作用的时间存在一定的关系。处理D与对照A的差异最为明显,处理C和D较为相似,处理B(相对于处理C、D)与对照差异最小。

	图 2 各样品的聚类树形图(a)与主成分分析图(b) Fig. 2 Cluster analysis of each sample by ward method(a)and principal component analyses(PCA)(b)of samples
图选项

基于2.1节的差异分析,从对照和各处理共选择了10处差异条带,分为5组,进行下一步的质谱检测,如图 1-b中红色方框所圈出的蛋白条带(A1-C1、A2-B2、A3-C3、A5-D5、A6-D6)。经SEQUEST软件比对后,共发现18个可信蛋白。鉴定结果表明:对照与处理组相比,蛋白种类普遍偏少。将5组结果进行汇总整理后发现:对照A特有3个蛋白,处理特有9个蛋白,对照和处理拥有6个相同的蛋白(表 1)。

经过对蛋白功能分析发现,对照的3个蛋白中有2个核糖体蛋白具有rRNA结合作用,其参与正常的细胞转录过程,也是核糖体发挥作用所不可或缺的,对植物生长发育过程中形成质体至关重要,而另一个为酰基载体蛋白,其对自然基质有重要的脱氢去饱和作用。33号条带在接菌后(处理B)产生却又在根表菌被冲洗(处理C)后丢失。经质谱检测比对后发现样品D5较A5多3个特征蛋白(表 1),表明33号条带包含的主要蛋白为ATP合成酶亚基、微管蛋白、热休克蛋白。采用Gene Ontology(GO)分析其分子功能(表 2)均与其他蛋白不相同,它们可与ATP或GTP结合,影响ATP酶、ATP合成酶或GTP酶的活性。较对照而言,所有接菌处理均检测到9个特征蛋白(表 2)。除上述已列出的3个蛋白外,目前还不清楚蛋白细胞色素c生物合成FC段[cytochrome c biogenesis FC(D5I3F3)]的作用,其他蛋白有的参与1-氨基环丙烷-1-羟酸合酶或运载体的活性调节,有的参与磷酸吡哆醛或DNA的结合,有的参与核糖体结构组成。

植物根系分泌物已被广泛研究,如:植物与植物之间相互影响而导致分泌物不同^[13];植物依靠根系分泌物识别亲疏关系^[14];植物与微生物通过分泌物进行相互作用^[10];植物根系分泌物诱引微生物到根表定殖^[11]等。其中大多数研究检测有机酸、类黄酮等小分子,然而大分子蛋白的研究较少。

生防菌SQR-21能够提高西瓜抵抗病害的能力并且促进西瓜生长^{[4, 5, 6]}。本试验在前人研究成果基础上,采用室内水培方式收集SQR-21作用不同时间后西瓜的根系分泌物,分析了西瓜在营养生长阶段SQR-21对其根系分泌蛋白的影响。SDS-PAGE结果表明:接种SQR-21后西瓜根系的分泌蛋白发生了较大的变化,且随着接种时间的延长而差异增大。另外,处理C与B、D也存在差异,最为明显的是33号条带只出现于处理B和D中,而对照A与处理C中没有。该现象表明:接菌2 d后,部分SQR-21可能已经定殖在西瓜根表,甚或成膜,与西瓜的互作已经比较活跃,但并不十分稳定,4 d后SQR-21与西瓜的互作趋于稳定;而33号条带中的蛋白则是由西瓜与松散定殖在根系的SQR-21互作的产物,这些菌体被洗去后,SQR-21与根系原有的互作关系被打破,对根系生命活动的影响也随之减弱或消失,导致根系分泌蛋白减少。可见,微生物的定殖状态不同,对西瓜的影响也有差异,牢固定殖的微生物能持续、稳定地改变植物的根际环境,而松散黏附的微生物与植物间的互作容易随环境改变而发生浮动。

本研究中,对照中有3种蛋白,分别为S4、S18和acyl-ACP Ds。其中:核糖体蛋白S4是核糖体小亚基上的蛋白,有研究发现S4蛋白是一种抗转录终止因子,在正常的细胞转录过程中与RNA聚合酶相结合,也参与rRNA操纵子抗转录过程^[15];S18蛋白也是核糖体30S小亚基上的一个重要蛋白,在S15的协助下,S6与S18能快速且牢固地结合进而与16S rRNA-蛋白有效结合^[16]。对烟草质体核糖体蛋白S18的研究^[17]发现敲除S18的编码基因rps 18 可对烟草(叶片)造成毁灭性伤害,S18是核糖体发挥正常作用必不可少的蛋白,对植物生长发育过程中形成质体至关重要;酰基-[酰基载体蛋白]去饱和酶(acyl-[acyl-carrier-protein]desaturases,acyl-ACP Ds)是可溶性双铁酶中的一类功能蛋白质^[18]。acyl-ACP Ds一般只对自然基质有脱氢去饱和作用,阻碍物质可能的相互交联^{[18, 19]}。从这些分泌出体外的蛋白可以推测,这3种蛋白可能是西瓜植株在没有外源环境刺激下进行正常的生命活动的结果,而当有益菌定殖时会减少分泌或被有益菌利用,但其具体机制还有待进一步研究。

本研究中,处理组西瓜更多地分泌了与ATP酶、ATP合酶、GTP合酶以及运载体和磷酸吡哆醛等相关的蛋白。质体内在蛋白(plasma intrinsic protein)位于细胞质膜上,参与细胞物质的转运。研究较多的质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)具有许多生理功能,包括水分运输、气孔开放、光合作用等^{[20, 21, 22]},通过不同的调控机制,水通道蛋白能够通过各种细胞到细胞的运输途径来响应生物胁迫和非生物胁迫^[23]。泛素延伸蛋白(ubiquitin extension protein)在核糖体上,提高核糖体出入细胞核的效率^[24],也有研究发现其与植物防卫反应有一定关系^[25]。组蛋白(histone)是真核生物染色体的基本结构蛋白,主要与DNA结合,构成核小体。组蛋白作为碱性物质应该在细胞核中与核酸结合,由于本试验主要分析根系分泌的蛋白,其被分泌到根外的具体原因有待于蛋白质转录水平的研究予以解释。ATP酶与ATP合酶是催化生物体合成、分解ATP调节生命活动所需能量的蛋白质酶,而ATP为几乎所有生命活动提供能量,随着生命活动更加旺盛,需要更多的能量供应,ATP酶、ATP合酶的活力势必增强,数量增大。GTP酶或G-蛋白是对能够结合或水解鸟嘌呤核苷酸GTP的蛋白的统称。G-蛋白通过偶联受体(GPCR)调节酶、离子通道等各种能产生胞内信号的效应器进而导致特定细胞反应。小分子GTP酶包括多个家族,分别有不同作用,如细胞信号转导、细胞骨架建成以及物质转运等,在GTP酶类中自成一个超家族^[26]。SQR-21处理4 d的样品(D6)中的蛋白1-氨基环丙烷-1-羧酸盐合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)被认为是乙烯合成速率的限制酶^[27]。乙烯是非常重要的植物激素,参与植物很多重要的生命过程^[28],而植物需要ACS催化乙烯前体物质ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)才可以生成乙烯^[27]。ACS的增加很可能是由于植物根系生长的需要或与SQR-21建立一种互利的关系。D6中的原叶绿素酸酯还原酶(protochlorophyllide reductase),是催化原叶绿素酸酯D环双键还原^[29],进而形成叶绿素酸酯的重要酶,对叶绿素合成十分重要。该酶出现在根系分泌物中很可能是植物光合作用增强的体现,但这是否是因为植物供过于求,还是SQR-21吸收利用,或者作为某种信号物质等,目前还不清楚。

由于质谱鉴定依赖于蛋白质一级结构,即氨基酸序列信息的比对,蛋白质合成到分泌至体外的修饰与可能的物质结合会造成从序列推测的蛋白与实际表达的蛋白不完全符合。Liu等^[30]的研究发现β-葡糖 苷酶的相对分子质量为91.47×10³,但其表达至体外的SDS-PAGE分析结果中的相对分子质量可达130×10³。 本研究中鉴定的蛋白也有分子质量不符合的现象,并非试验操作过程的疏漏与错误。从对照与处理的蛋白种类变化与其作用可以看出,接种SQR-21的西瓜苗增强了自身细胞骨架的构建及物质转运和信号传导,促使根系生长、光合作用等生命活动更加旺盛,同时也能够将更多蛋白分泌至体外,从而为机体响应外界刺激(如与细菌的互作)、促进生长发育等提供物质和能量保障。这可能也意味着SQR-21处理的前4 d是其促生的触发期,使西瓜在细胞水平的活动更加活跃,并产生更多更丰富的物质,为之后生物量的提升、增强抵抗环境胁迫的能力做好准备。然而该时间段内SQR-21的定殖状态还不稳定,容易随环境改变而发生浮动,其促生机制需要进一步探究。