菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为十字花科菘蓝属2年生草本植物,其干燥叶和根入药分别称大青叶和板蓝根^[1]。大青叶中的化学成分有二十余种,包括有机酸类、黄酮类、生物碱类、苷类、甾体化合物、木质素等^[2]。靛蓝、靛玉红为大青叶中研究较多的活性成分指标,均是植物体内次生代谢通过莽草酸途径合成的吲哚类生物碱。板蓝根主要化学成分包括生物碱类、黄酮类、腺苷、有机含硫化合物、有机酸类等,其中生物碱类、多糖类、黄酮类等成分专属性较强,是近年来研究较多的成分^[3]。板蓝根有清热解毒,凉血利咽的功效,(R,S)-告依春为其活性成分,具有抗流感病毒的作用^[4],药代动力学研究表明(R,S)-告依春单体的口服生物利用度高于总生物碱^[5]。

氮素是植物生长所必需的大量元素,其供应会直接影响植物的生长和次生代谢物的积累。土壤氮素的增加会导致植物中非结构碳水化合物含量下降,从而使单萜类次生代谢产物水平下降,但以氨基酸为前体的次生代谢产物水平提高^[6]。氮素能使植物枝干高大,生长茂盛,而缺氮植物往往表现为植株矮小、叶片发黄,严重缺氮时叶片变褐甚至死亡。也有些植物在缺氮胁迫下仍能生长,如柳枝稷^[7],但长时间缺氮必定影响植物初生及次生代谢过程,对于药用植物而言必定影响其营养状况和活性成分的含量。若施氮过多则不仅会导致肥料的浪费,还会造成环境的污染。在菘蓝栽培的相关研究中,不同形态氮素的适宜组合能有效提高大青叶的活性成分含量和单株生物量^[8]。而在低施肥量的情况下,菘蓝产量和有效成分靛蓝、靛玉红的含量随施肥量的增加而增加,达到极值后,随施肥量的增加而降低^[9]。但氮素盈亏对菘蓝的影响尚无系统的研究,为此本研究通过水培方式对苗期菘蓝进行缺氮和复氮处理,考察菘蓝的营养成分和活性成分对氮素盈亏的响应特征,旨在了解氮素盈亏对菘蓝活性成分积累的影响,为实际生产中获得高品质的板蓝根和大青叶药材,提高氮素利用效率提供理论依据。

试验材料为来自山西的普通栽培菘蓝居群,经南京农业大学王康才教授鉴定为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)。取籽粒饱满、大小均一的菘蓝种子,用10%(体积分数)次氯酸钠溶液浸泡10 min后冲洗干净,置于培养皿内,于人工气候培养箱中催芽72 h。培养条件为:光照时间18 h/6 h(光/暗),光 照度20 000 lx,温度25℃/15℃(昼/夜)。种子萌发后移入穴盘中,用基质(蛭石和有机质的质量比为1∶1)栽培,培养时间为2014年7月10日至9月9日,培养条件为光照时间12 h/12 h(光/暗)、光照度20 000 lx、 温度25℃/20℃(昼/夜)。9月10日将幼苗移入花盆中,用基质(蛭石和有机质的质量比为1∶1)栽培,试验地点设置在园艺学院大棚内。10月12日将幼苗移入自制水培箱中培养,水培基本营养液参照Hoagland营养液配方^[10]。

试验共设置对照、缺氮和复氮3个处理。对照组采用基本营养液;缺氮组采用缺氮营养液,共培养15 d; 复氮组前6 d采用基本营养液,之后4 d采用缺氮营养液,缺氮4 d后采用基本营养液继续培养5 d。每个处理3次重复,每个重复40株苗。处理期间每隔1 d换1次营养液。培养条件为:光照时间12 h/12 h(光/暗)、光照度20 000 lx、温度25℃/20℃(昼/夜)。10月27日取样后105℃杀青15 min,60℃烘干至恒质量,粉碎后过60目筛,用于各项指标的测定。

样品消解:采用微波消解法。所有器皿均在10%(体积分数)硝酸中浸泡24 h后用去离子水洗净,烘干备用。精密称取样品0.100 0g置于内插管中,加入2 mL HNO₃,轻摇使其混合均匀,盖好内插管盖后放入微波消解罐中消解30 min,冷却后开罐,用去离子水将消解液定容至25 mL,混匀后备用。

采用ICP-MS法测定混合标准液及菘蓝叶片样品中各矿质元素的含量。测定条件:Optimal 2100DV电感耦合等离子体发射光谱仪。射频功率1 300 W,辅助气流量0.2 L·min^-1,等离子体气流量15 L·min^-1,雾化气压器压力0.8 L·min^-1,蠕动泵转速1.5 mL·min^-1。

精密称取0.200 0g样品,加5 mL 0.02 mol·L^-1 HCl超声波振荡1.5 h,过滤,定容至5 mL。加入等体积的40g·L^-1磺基水杨酸混匀,10 000 r·min^-1离心20 min,取上清液过水系0.45 μm的微孔滤膜,备用。测定方法:采用标准分析方法(pH法)。测定条件:日立L-8900型氨基酸分析仪。泵1流速0.4 mL·min^-1,泵2流速0.35 mL·min^-1,分析柱柱温53℃,反应柱柱温135℃,进样体积20 μL。

采用苯酚-硫酸法^[11]测定可溶性糖含量。

精密称取0.100 0g样品,加入10 mL 70%(体积分数)乙醇,超声波振荡1 h后过滤,将滤液定容至25 mL,混匀。取2 mL滤液于试管内,加入0.5 mL 50g·L^-1 NaNO₂,摇匀后静置6 min,再加入0.5 mL 100g·L^-1 Al(NO₃)₃,摇匀后静置6 min,然后加入4 mL 40g·L^-1 NaOH,最后用70%(体积分数)乙醇定容至10 mL。摇匀后静置15 min,于510 nm波长下比色,测定吸光值。以芦丁为对照品绘制标准曲线,计算其含量。

精密称取0.100 0g样品,加入0.5 mL浓氨水、8 mL三氯甲烷,冷浸3 h后超声波振荡1 h,6 000 r·min^-1离心20 min,弃沉淀。将上清液转移至分液漏斗中,加入5 mL 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.4),1 mL 1g·L^-1溴百里酚蓝,振荡1 min后静置1 h。取下层氯仿液体于289 nm波长下比色,测定吸光值。以靛玉红为对照品绘制标准曲线,计算其含量。

参照文献^[1]的方法提取菘蓝叶片中的靛蓝、靛玉红,采用超高效液相色谱法 测定其含量。测定条件:Agilent超高效液相色谱仪1290。分析柱:Acclaim RSLC120 C18(3.0 mm×100 mm,2.2 μm)。流动相甲醇和水的体积比为71∶29,流速0.400 mL·min^-1,柱温30℃,检测波长289 nm,进样体积5 μL。靛蓝标准曲线为Y_靛蓝=36.791X_靛蓝+2.577 5,r=0.992 8(n=3),线性范围0.1~1.2 μg·mL^-1;靛玉红标准曲线为Y_靛玉红=160.08X_靛玉红-1.639 8,r=0.999 9(n=3),线性范围0.1~8.0 μg·mL^-1。

参照文献^[1]的方法提取菘蓝根中的(R,S)-告依春,采用超高效液相色谱法测定其含量。测定条件:Agilent超高效液相色谱仪1290。分析柱:Acclaim RSLC120 C18(3.0 mm×100 mm,2.2 μm)。流动相甲醇与0.2g·L^-1磷酸溶液的体积比为7∶93,流速0.400 mL·min^-1,柱温30℃,检测波长245 nm,进样体积5 μL。标准曲线为Y=71.562X+9.877 1,r=0.999 8(n=3),线性范围1~20 μg·mL^-1。

采用Excel 2003和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析,处理间差异显著性比较均采用LSD方法。

由表 1可见:缺氮组菘蓝叶中的K、Ca、Mg、Mn、Fe、Na、B、Ti、Se含量均高于对照组和复氮组,其中K、Ca、Mn、Na、Ti显著高于对照组和复氮组(P<0.05)。复氮组叶中的Al、Ba、Hg含量均高于对照组和缺氮组,其中Al的含量显著高于对照组,但与缺氮组间的差异不显著(P>0.05)。P、Zn、Cu、Ni、Cr、Sr的含量在对照组中最高,并且Sr的含量与复氮组间的差异显著(P<0.05),但与缺氮组间的差异不显著。这说明不同的氮素盈亏处理对菘蓝叶片积累矿质元素的影响不同。对于大量元素(K、Ca、Mg),缺氮更能促进菘蓝对其的吸收和积累,这可能是在氮素缺乏的条件下,菘蓝通过对其他元素的大量吸收来调整自身的营养利用情况。而对于微量元素,Zn、Cu和Ni的含量在持续供氮的情况下积累更多,持续缺氮或者中途缺氮都不利于菘蓝叶对其的吸收和积累,说明氮素盈亏对菘蓝吸收矿质元素的影响存在很大的差异,适当的缺氮处理能促进菘蓝吸收大部分矿质元素。

由表 2可知:在苗期菘蓝叶中,除苯丙酸外,其余14种氨基酸均在缺氮组中含量最高。其中,缺氮组菘蓝叶中丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸含量与对照组和复氮组差异显著。缺氮组叶中酪氨酸、苯丙氨酸含量与复氮组差异显著,但与对照组无显著差异。复氮组叶片脯氨酸含量最低,与对照组和缺氮组间均差异显著。叶片游离氨基酸总量在缺氮组中最高,在复氮组中最低。缺氮组叶片精氨酸含量最高,占总量的26.22%,对照组和复氮组的谷氨酸含量最高,分别占总量的19.76%和21.01%。

菘蓝根中12种氨基酸的含量均在复氮组中最高,且除精氨酸含量在对照组最低外,其余氨基酸含量均在缺氮组中最低。根中丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸含量在各处理间均差异显著。缺氮组根中谷氨酸和苯丙酸含量与对照组和复氮组存在显著差异。复氮组根中精氨酸含量与缺氮组和对照组存在显著差异。根中游离氨基酸总量在复氮组中最高,在缺氮组中最低。其中精氨酸含量在缺氮组、复氮组和对照组均最高,分别占总量的38.66%、35.40%和27.01%。

各处理组菘蓝叶片的丝氨酸、苯丙酸含量明显高于根系,而亮氨酸和精氨酸的含量则相反。对照组和复氮组根系谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸含量高于叶片,而缺氮组根系这些氨基酸的含量低于叶片。这说明缺氮条件不利于游离氨基酸在根中的积累,而持续供氮过程中缺氮则不影响这些氨基酸在根中的积累。半胱氨酸、蛋氨酸和脯氨酸在菘蓝根中未检出。

苗期菘蓝根中可溶性糖含量在3个处理间差异显著(图 1)。其中,根中可溶性糖含量在缺氮组中最高(22.31 mg·g^-1),分别比对照组和缺氮组高11.49%和23.93%。复氮组根中可溶性糖含量最低(18.01 mg·g^-1),比对照组降低10.03%。说明缺氮处理对苗期菘蓝根系可溶性糖含量的影响较大,而复氮条件反而使可溶性糖含量更低,难以达到持续供氮时的水平。

	图 1 缺氮和复氮处理对苗期菘蓝根中可溶性糖含量的影响 Fig. 1 Effect of N deficiency and N recovery on soluble sugar content in roots of I.indigotica at seedling stage
图选项

不同处理对苗期菘蓝叶与根中总黄酮含量的影响不同(图 2),且菘蓝叶片总黄酮含量明显高于根系。叶片总黄酮含量在对照组最高(10.42 mg·g^-1),缺氮组和复氮组略有降低,分 别降低1.97%和1.14%。根中总黄酮含量在不同处理间存在显著差异,在复氮组中含量最高(4.44 mg·g^-1),在缺氮组中含量最低(2.36 mg·g^-1)。这说明缺氮条件不利于总黄酮的积累,即使复氮条件其含量也难以达到持续供氮时的水平。

	图 2 缺氮和复氮处理对苗期菘蓝叶与根中总黄酮含量的影响 Fig. 2 Effect of N deficiency and N recovery on total flavonoids content in leaves and roots of I.indigotica at seedling stage
图选项

由图 3可知:缺氮组叶片总生物碱含量显著高于对照组和复氮组,分别高17.99%和16.68%,且对照组和复氮组间无显著差异。这说明缺氮能促进苗期菘蓝叶片总生物碱含量的增加,且持续缺氮比持续供氮途中缺氮对总生物碱的影响更大。

	图 3 缺氮和复氮处理对苗期菘蓝叶中总生物碱含量的影响 Fig. 3 Effect of N deficiency and N recovery on alkaloids content in leaves of I.indigotica at seedling stage
图选项

缺氮和复氮对苗期菘蓝叶片靛蓝与靛玉红含量的影响不同(图 4)。对照组叶片靛蓝含量最高(208.74 μg·g^-1),缺氮组最低(170.28 μg·g^-1),且两组处理间存在显著差异。复氮组靛蓝含量为182.40 μg·g^-1,与其他2个处理组之间不存在显著差异。缺氮组叶片靛玉红含量最低(40.68 μg·g^-1),显著低于对照组和复氮组,分别降低20.39%和14.89%,但对照组和复氮组间无显著差异。叶片靛蓝含量明显高于靛玉红含量。这表明,持续缺氮不利于靛蓝与靛玉红的积累,复氮条件会使其含量有所升高,但难以达到持续供氮时的水平。

	图 4 缺氮和复氮处理对苗期菘蓝根中(R,S)-告依春、叶中靛蓝与靛玉红含量的影响 Fig. 4 Effect of N deficiency and N recovery on epigoitrin content in roots,indigo and indirubin content in leaves of I.indigotica at seedling stage
图选项

苗期菘蓝根系(R,S)-告依春含量在对照组、缺氮组和复氮组间无显著性差异,其中(R,S)-告依春含 量在复氮组中最高(125.23 μg·g^-1),分别比缺氮组和对照组高0.58%和6.22%;对照组最低(117.89 μg·g^-1),且比缺氮组低5.31%。这说明苗期菘蓝根系的(R,S)-告依春含量对缺氮与复氮处理的响应差异较小,但缺氮和复氮处理能使其含量略微增加。

矿质元素主要通过主动运输的方式进入根的表皮细胞,进而被运输至植物各部分。唐晓清等^[12]研究表明:不同氮素处理明显促进菘蓝对大量元素P、K、Ca、Mg的吸收,从而有效地促进了菘蓝的生长。本研究结果表明:缺氮使菘蓝叶中大量元素K、Ca、Mg的含量均升高,而复氮则使其含量均降低,可能的原因是持续缺氮导致氮素与其余大量元素发生拮抗作用,而复氮促进菘蓝对氮的吸收,从而对其余元素的吸收作用相对减弱,不如对照组植物正常的吸收。对于其他元素,缺氮提高了Mn、Fe、Na、B、Ti、Al、Ba、Se的含量,复氮提高了Mn、Fe、B、Ti、Al、Ba、Hg的含量,说明矿质元素对氮素盈亏的响应不同,研究其含量也为菘蓝活性成分的积累提供参考依据。

武永军等^[13]研究玉米幼苗根系在缺氮和复氮处理下17种游离氨基酸,发现缺氮后只有7种氨基酸的含量下降,其他氨基酸含量则不变或轻微上升,复氮后只有半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸含量高于正常处理,除蛋氨酸外,这些氨基酸含量也低于缺氮处理。本研究中,缺氮使苗期菘蓝叶片除苯丙酸外的其余氨基酸含量均有所增加,且氨基酸总量最高,复氮条件使苗期菘蓝根中游离氨基酸含量均最高,说明适宜的缺氮能促进游离氨基酸的积累,且游离氨基酸含量在菘蓝根和叶内对氮素盈亏的响应不同。

刘维智等^[14]研究表明:缺氮条件显著增加了烟株叶片的还原糖、总糖、蔗糖和淀粉含量。本研究结果表明:缺氮显著提高了苗期菘蓝根系的可溶性糖含量,而复氮条件则使其含量低于对照组,这可能是由于植物碳和氮代谢紧密结合,氮素的亏缺促进菘蓝叶片进行光合作用,合成可溶性糖,并促使其向根系分配,增强根系吸收氮素的能力,去应对氮素养分缺失的环境条件。而缺氮后恢复供氮则使根系在进行各项生理代谢活动时消耗了自身的能量,因而降低了可溶性糖的含量。

一般认为,限制氮肥的施用有利于黄酮类物质的积累,过量的氮肥会降低苯丙氨酸解氨酶的活性,从而影响下游黄酮类化合物的合成^[15]。缺氮处理能够提高山楂根系分泌液中总黄酮的含量^[16]。但康建宏等^[17]对枸杞的研究认为,随着施氮量的增加,黄酮含量有增加的趋势。本研究中,苗期菘蓝叶片总黄酮含量高于根系,这可能的原因是总黄酮在菘蓝叶片的合成能力比根系强或其在叶片较易积累。持续供氮途中缺氮有利于总黄酮在根中的积累,而持续供氮使总黄酮在叶中积累更多,说明氮素盈亏对黄酮类化合物在根与叶内的影响不同。若要在生产中获得总黄酮含量较高的菘蓝根与叶,需要保证氮肥的施用量。

大部分植物的生物碱含量随氮素供应水平增加而增加,过剩的氮素则贮存起来用于生物碱的合成^[18]。然而,本研究中缺氮条件使菘蓝叶片总生物碱含量显著提高,复氮条件下总生物碱含量迅速下降,与对照差异较小,说明缺氮更有利于菘蓝生物碱类次生代谢产物的积累,故在生产中可以考虑缺氮胁迫的方式来获得总生物碱含量更高的菘蓝。

靛蓝与靛玉红、(R,S)-告依春分别作为大青叶和板蓝根中重要的活性成分,均属于生物碱类化合物。氮素营养是影响这些活性成分合成的重要环境因子。晏枫霞^[19]研究表明:砂培方式下菘蓝叶片在缺氮条件下靛蓝的含量较高,而靛玉红达到最大含量时氮素水平为15 mmol·L^-1。段飞等^[20]研究发现,适当的逆境胁迫有利于菘蓝中的靛玉红积累。本研究中苗期菘蓝叶片靛蓝与靛玉红含量均在缺氮条件下最低,在持续供氮条件下含量最高,可能的原因是靛蓝与靛玉红都是含氮生物碱,合成过程中需要氮素参与,氮素的亏缺使次生代谢过程变化,从而导致其含量的降低。(R,S)-告依春含量在各处理组没有显著差异,这与肖云华等^[21]的研究结论菘蓝根中(R,S)-告依春的含量与氮肥施用量的关系不太明显基本一致,但复氮条件更有利于其含量积累。在生产中若要同时获得活性成分含量较高的菘蓝叶和根,可以考虑复氮的施肥方式。若要提高活性成分含量,还需深入优化氮素施用条件。