先期抽薹一直是影响蔬菜类作物产量和品质的因素,近年来晚抽薹育种已逐渐成为热门。张波^[1]和纪小红等^[2]发现不结球白菜和大白菜抽薹性遗传均符合加性-显性-上位性模型,抽薹前后多种酶和内源激素呈规律性变化,通过各种分子标记对晚抽薹性状进行了QTL定位。晚抽薹不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)在我国长江中下游地区对缓解蔬菜春淡季市场具有重要作用。目前生产上仍采用‘四月慢’和‘五月慢’等传统品种作为主栽品种,这些品种品质远不及‘二月白’和‘三月白’等品种。李娜^[3]研究表明芸薹属作物抽薹性与品质呈负相关,采用常规育种方法选育晚抽薹高品质品种难度很大。前人选育的四倍体不结球白菜具有抗逆、优质、高产等特性^{[4, 5]},而以晚抽薹为目标的四倍体不结球白菜育种鲜有报道。

研究发现拟南芥的开花受到4条路径的调控。FLC(FLOWERING LOCUS C)基因是春化途径和自主途径中重要的开关基因,能够编码MADS-box的转录调控因子,从而抑制植物开花。FRI(FRIGIDA)通过促进开花抑制子FLC基因的表达,抑制开花^[6]。VIN3(VERNALIZATION-INSENSITIVE 3) 基因能够通过对FLC基因位点组蛋白的修饰作用,从而维持FLC基因的抑制状态,进而促进拟南芥开花^[7]。研究不结球白菜FLC、FRI和VIN3这3个基因的特异表达,可以对抽薹开花机制进行初步研究。

本试验利用秋水仙素诱导技术,创制优质晚抽薹不结球白菜新种质,并利用RT-PCR技术初步研究四倍体晚抽薹特异基因表达,为选育四倍体优质晚抽薹不结球白菜提供理论基础和种质资源。

二倍体不结球白菜品种‘五月慢’(2n=2x=20),为我国晚抽薹主栽品种。试验于2012年9月25日至2014年12月25日在南京农业大学园艺学院及江浦园艺站进行。

2012年9月25日播种,幼苗子叶完全展开时用秋水仙素处理茎尖生长点。秋水仙素质量浓度为1.5和2.0 g·L^-1,分别点滴处理4次和6次,共4个处理,每个处理 4个穴盘(72孔),每天早晚各处理1次,每株0.2 μL,以蒸馏水为对照。倍性鉴定采用苗期形态学鉴定、解剖学(叶绿体数目、气孔大小、花器大小、花粉粒大小、角果及种子形态)鉴定、流式细胞仪DNA含量鉴定和染色体鉴定^{[4, 5]}方法。

2013年4月选取抽薹比二倍体晚4~6 d的M₀代四倍体植株自交留种,2013年9月25日播种得M₁代,2014年4月2日,参照余阳俊等^[8]的方法调查M₁代抽薹性,筛选晚抽薹株系。

分别于2013年12月4日、21日和2014年1月8日,取大田中二、四倍体心叶外第3片功能叶,检测VIN3、FRI和BcFLC3这3个基因的特异表达,3次重复。用Beacon Designer 7软件设计引物并比对,引物由南京金斯瑞生物公司合成(表 1)。RNA提取后经核酸蛋白仪和琼脂糖凝胶电泳检测,用PrimeScript^TM RT-PCR Kit(TaKaRa)进行反转录。按照SYBR^® Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)试剂盒内说明书加板。RT-PCR所用仪器为Bio-Rad My-IQ5。反应程序:95 ℃ 1 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40个循环。每个样品重复3次,以actin基因作为内参基因。试验数据采用Excel 2010软件进行相对定量分析。

2014年2月24日,各选取5株二、四倍体,取心叶外第3片功能叶,测定可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、硝态氮、游离氨基酸、有机酸、硒和纤维素含量^{[9, 10]}。2014年3月5日,各选取10株二、四倍体,测量农艺性状并进行产量比较^{[4, 5]}。

试验所得数据均采用SPSS 11.5软件进行统计分析。

秋水仙素处理后,不结球白菜植株生长势明显受到抑制,叶片增厚皱缩,颜色加深,并呈近圆形。由表 2可见:1.5和2.0 g·L^-1秋水仙素4次和6次诱导均获得同源四倍体,同时有嵌合体产生,所占比例分别为13.53%、21.43%、17.43%和18.85%。随着秋水仙素质量浓度和处理次数的增加,四倍体诱变率呈上升趋势,但是存活率逐渐降低。在4个处理中,2.0 g·L^-1秋水仙素处理6次的诱导效果最佳,四倍体诱变率最高,达5.90%。

由表 3可见:从叶片解剖结果来看,与二倍体相比,四倍体的叶片宽度、气孔长、气孔宽和叶绿体数目分别增加26.92%、60.59%、46.92%和114.46%;从花器官解剖结果来看,四倍体的花蕾长、花蕾宽、长雄蕊长、短雄蕊长、花粉粒长和花粉粒宽分别比二倍体增加20.62%、23.28%、27.79%、61.40%、16.43%和39.68%;从角果和种子角度来看,四倍体角果宽、种子直径和种子千粒质量分别比二倍体增加21.20%、16.57%和88.43%,而角果长和单荚果平均种子数分别减少38.60%和55.23%。以上形态指标均达到极 显著差异,其他性状如花瓣长和角果喙长呈显著性差异,而叶片长和雌蕊长无显著差异(表 3、图 1-A~F)。 流式细胞仪DNA含量鉴定表明四倍体的峰值在400附近,二倍体的峰值在200附近,呈二倍关系(图 2)。二倍体根尖有丝分裂中期染色体数目2n=2x=20,四倍体染色体数目为2n=4x=40(图 1-G)。四倍体表观形态与二倍体产生明显差异,并且染色体数目加倍,可以作为鉴别的参考标准。

	图 1 二、四倍体不结球白菜形态学和细胞学比较Fig. 1 Comparison of morphology and cytobiology between diploid and tetraploid in non-heading Chinese cabbage A.植株;B.花器官;C.花粉粒(×400);D.角果;E.种子;F.气孔(×400);G.染色体(×600);H.抽薹情况 A.Plant;B.Floral organ;C.Pollen grain(×400);D.Silique;E.Seed;F.Stoma(×400);G.Chromosomes(×600);H.Condition of boilting
图选项

	图 2 不结球白菜叶片DNA相对含量Fig. 2 DNA relative content of leaf of non-heading Chinese cabbage 2x:二倍体Diploid;2x+4x:嵌合体Chimetric;4x:四倍体Tetraploid Count值代表测定细胞数的相对值;FL3值代表荧光通道。 Count value represents the relative number of determined cells;FL3 value represents fluorescence channel value.
图选项

由表 4可见:二倍体在4月4日开始抽薹,四倍体通过调查筛选出6个株系,其中37-9和37-8在4月6日抽薹,属于中抽薹株系;37-4、37-6和37-19在4月8日和9日开始抽薹,属于晚抽薹株系;37-3(图 1-H)在4月11日抽薹,属于极晚抽薹株系。四倍体比二倍体抽薹晚2~7 d。

由图 3可见:在二、四倍体中,BcFLC3和FRI基因的表达随着春化时间的延长,都呈现逐渐降低的趋势,但四倍体的表达量比二倍体高,最终四倍体BcFLC3和FRI的表达量分别比二倍体上调了1.93和1.83倍。VIN3表达量随春化时间的延长呈上升趋势,四倍体的表达量高于二倍体。

	图 3 3个抽薹相关基因春化前后相对表达情况Fig. 3 Relative expression levels of three bolting genes before and after vernalization 春化前二倍体FRI基因的相对表达量为1.0。The relative expression levels of FRI gene in diploid before vernalization are set to 1.0. *P < 0.05;* *P < 0.01.
图选项

由表 5可见:四倍体可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸、硒含量分别比二倍体提高了75.63%、66.93%、47.47%和53.79%,达极显著差异。而硝态氮和维生素C含量分别增加了23.84%和44.60%,呈显著性差异。纤维素和干物质百分比分别比二倍体显著减少17.56%和12.5%,其他指标如有机酸百分比也有变化,但差异不显著。

由表 6可见:在所有农艺性状中,四倍体的最大功能叶宽、单株叶质量和十叶厚分别比二倍体极显著增加27.09%、16.05%和43.63%,短缩茎质量极显著减少36.84%;单株质量和叶柄长比二倍体显著增加12.37%和13.13%;其他农艺性状差异不显著。四倍体小区产量比二倍体增加11.13%,差异显著。四倍体植株整体出现矮化、营养器官增大的趋势。

植物抽薹开花有4个调控途径,其中春化途径是研究最多的途径。FLC编码MADS域转录因子,抑制花期转变。春化过程中FRI及其同源基因通过自主途径正调控FLC^[11],而春化作用会抑制FLC表达。延长低温春化处理,会使VIN3 基因表达逐渐上调,维持FLC表达的稳定抑制^[12]。RT-PCR结果表明:在二、四倍体中,随着春化时间的延长,BcFLC3和FRI的表达量逐渐减少,而VIN3的表达量上升,而且各基因在四倍体的表达量都比二倍体高。对M₁代进行抽薹调查筛选出了3个晚抽薹株系37-4、37-6、37-19和1个极晚抽薹株系37-3。四倍体比二倍体抽薹时间晚2~7 d,有可能是剂量效应使BcFLC1表达增加,从而延迟抽薹。也可能是加倍后四倍体生长迟缓,抽薹延迟,具体原因有待进一步研究。

多倍体植株在产量、品质、抗性等方面优于二倍体^{[13, 14, 15]}。通过测定,不结球白菜的四倍体的可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、游离氨基酸和硝态氮含量都比二倍体高,而纤维素和干物质百分比降低,原因可能是二倍体加倍后,由于基因剂量的增加和核质互作的影响,多倍体生理生化活性显著增强,次级代谢产物增加。本试验比较了在大田自然生长条件下,二、四倍体不结球白菜对硒的富集作用,发现四倍体硒含量比二倍体提高53.79%。该四倍体在农艺性状上表现出植株矮化、束腰性好、叶色鲜亮、产量增加和抽薹晚等优势。四倍体单株质量、单株叶质量和叶柄质量分别比二倍体增加12.37%、16.05%和1.69%,株高、头粗和短缩茎质量比二倍体下降了3.44%、9.97%和36.84%,小区产量增加11.13%,表现出较明显的优势。本试验获得了优质晚抽薹四倍体不结球白菜,为多倍体育种提供了种质资源。