高效低耗的甘薯脱毒苗快繁技术研究

http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.04.025

文章信息

闫明明, 徐碧莲, 吴琼, 刘志文. 2015.

YAN Mingming, XU Bilian, WU Qiong, LIU Zhiwen. 2015.

高效低耗的甘薯脱毒苗快繁技术研究

Study on the high efficiency and low-expensive rapid propagation technology in virus-free sweet potato seedling

南京农业大学学报, 38(4): 689-694

Journal of Nanjing Agricultural University, 38(4): 689-694.

http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.04.025

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收稿日期：2014-11-10

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闫明明, 徐碧莲, 吴琼, 刘志文. 2015. 高效低耗的甘薯脱毒苗快繁技术研究[J]. 南京农业大学学报, 38(4): 689-694. 复制到剪切板

YAN Mingming, XU Bilian, WU Qiong, LIU Zhiwen. Study on the high efficiency and low-expensive rapid propagation technology in virus-free sweet potato seedling[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 38(4): 689-694. DOI: 10.7685/j.issn.1000-2030.2015.04.025 复制到剪切板

高效低耗的甘薯脱毒苗快繁技术研究

闫明明, 徐碧莲, 吴琼, 刘志文

大连工业大学生物工程学院, 辽宁大连 116034

收稿日期：2014-11-10

基金项目：大连市科学技术基金项目(2010J21DW015)

作者简介：闫明明,硕士研究生。

通信作者：刘志文,副教授,博士,主要从事植物分子生物学和脱毒技术研究,E-mail:alzw@dlpu.edu.cn。

摘要：[目的]建立一套高效和低耗的甘薯脱毒苗快繁技术,以适应工厂化生产的需要。[方法]以‘甘薯一号’脱毒试管苗为材料,采用单因素和正交试验相结合的方法,设计不同的MS培养基类型、支持物、水源、光源、糖源及糖浓度等处理,分析不同处理和培养条件对试管苗切段新生叶片数、根生长数、新生茎尖数和株高增加值的影响。[结果]单因素结果表明:1/2MS、无支持物、自来水、日光灯和60 g·L^-1绵白糖分别为各自的最佳培养条件,它们新生叶片数分别为4.83、4.67、5.00和5.33;根生长数为2.17、1.67、1.67和1.50;茎尖生长数为6.67、5.33、5.67和5.17;株高增加值为2.17、3.08、2.73和2.50 cm。正交分析表明:各因素的影响从大到小依次为光源、支持物、培养基类型、水源、绵白糖浓度、糖源。[结论]最佳培养条件组合为1/2MS+无支持物(液体浅层培养)+自来水+LED灯+30 g·L^-1绵白糖。在此条件下,脱毒苗表现为繁殖周期短,生长和形态最优,且生产成本降低了81.04%以上。

关键词：甘薯脱毒高效低耗快繁

Study on the high efficiency and low-expensive rapid propagation technology in virus-free sweet potato seedling

YAN Mingming, XU Bilian, WU Qiong, LIU Zhiwen

School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

Abstract: [Objectives]In this research,the objective was to establish an efficient and low-expensive rapid propagation technology for the virus-free sweet potato,to meet the needs of industrial production. [Methods]The virus-free sweet potato‘Ganshu 1’ plantlets were studied by the single factor and orthogonal test methods. The culture conditions(medium type,sustentation,water source,light source,carbohydrate source and sugar concentration)were analyzed. The morphological indices(leaves,roots,stem tip and added value of plant height)were measured and evaluated. [Results]The single factor results revealed that the plantlets cultured on the 1/2MS medium,shallow-layer liquid medium,tap water-fluorescent light and 60 g·L^-1soft sugar accordingly had the optimal indices with new leaves 4.83,4.67,5.00 and 5.33;roots 2.17,1.67 1.67 and 1.50;stem tip 6.67,5.33,5.67 and 5.17;and added value of plant height 2.17,3.08,2.73 and 2.50 cm,respectively. The order and contribution rate of every culture condition on the target index was as follows:light,sustentation,medium type,water,soft sugar concentration,and carbohydrate source. [Conclusions]The optimal culture condition was 1/2MS+shallow-layer liquid medium+tap water+LED lights+30 g·L^-1 soft sugar in virus-free sweet potato seedling rapid propagation. The virus-free sweet potato seedlings showed the best growth performances using the optimal culture condition. Additionally,it can shorten the culture period and furthermore reduce more than 81.04% cultivating cost.

Keywords: sweet potato virus-free high efficiency low-expensive rapid propagation

甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam.]是我国重要的粮食、饲料和工业原料作物,具有营养丰富、稳定性好和产量高等优点,在社会经济中发挥着重要作用^{[1, 2]}。甘薯属于无性繁殖作物,在长年的种植过程中很容易感染病毒,一旦感染病毒,其病毒就会在植株体内不断积累,并代代相传,使病情逐代加重,最终导致甘薯品种种性退化,产量和品质下降。我国每年种植甘薯约660万hm²,由于病毒病的危害,使甘薯减产达20%以上,造成的经济损失约40亿元^{[3, 4]}。鉴于国内外迄今尚未育出高抗病毒病的优良甘薯品种,也无防治病毒病的高效农药,因此利用茎尖分生组织培养技术培育脱毒甘薯苗是目前国际上防治甘薯病毒病、提高甘薯产量和品质的最有效方法,并已得到了广泛研究与应用^{[5, 6, 7, 8, 9]}。

近年来,已有学者在植物生长调节剂、MS培养基组成、试管苗的培养容器及光波等方面对茎尖培养脱毒技术进行了大量的研究。例如:孟德璇等^[10]以MS为基本培养基,研究了6-BA和NAA配比对4个甘薯品种茎尖培养的影响;Huang等^[11]探讨了铁皮石斛种子萌发、芽增殖和生根适宜的培养基类型和培养条件;张恒^[12]为降低草莓脱毒苗的生产成本,简化了草莓脱毒苗的组织培养过程,将传统组织培养模式中壮苗培养和生根培养合并为壮苗生根一步完成,都达到了一定的效果。但这些研究还普遍存在两方面的问题:第一,他们都采用单因子试验且考察的因素比较少,而试管苗的组培快繁是由多种因素共同作用的;第二,组培成本偏高,还没有达到工厂化生产的要求。这两方面的问题不仅影响着原种的快速繁殖,而且直接决定着商品的价格、用户经济承受能力、甘薯的普及程度和生产单位的经济效益。因此,本试验在借鉴前人经验的基础上,采用单因素试验对影响甘薯脱毒苗快繁的培养基类型、支持物、水源、光源、糖源和糖浓度的多个水平分别筛选出两个较优水平,再采用正交试验对6个因素的较优水平进行正交试验研究^[13],以探索甘薯脱毒试管苗高效低耗快繁的最佳方法。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试甘薯品种为脱毒‘甘薯一号’,由大连工业大学生物实验室提供。试验所用主要仪器有:超净工作台(SW-CJ-IF,洁净度为百级,上海一恒科技有限公司)、立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX-40SBI型,上海申安医疗器械厂)、光照培养箱(HPG-280B,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;L6-150,北京易盛泰和科技有限公司)。

1.2 试验设计

试验采用完全随机单因素试验和L₈(2⁷)正交试验设计甘薯脱毒苗的快繁,培养基类型(A)设置3个处理:MS、1/2MS和1/4MS;支持物(B)设置4个处理:琼脂粉、脱脂棉、滤纸片和无支持物;水源(C)和光源(D)的组合设置9个处理:将蒸馏水、自来水和井水与LED灯、日光灯及普通光照(5—6月)进行两两组合得到;糖源(E)设置5个处理:蔗糖、绵白糖、白砂糖、冰糖和红糖(均为市售);糖浓度(F)设置:0、10、20、30、40、50和60 g · L^-1共7个处理。各个处理在超净工作台中进行切段快繁,接种材料为长度1.5 cm左右不带展开叶片的甘薯茎尖组培苗。之后置于光照度为2 000 lx,温度25 ℃/22 ℃的光照培养箱中进行培养,每天光照13 h(部分光照处理的除外)。

1.3 测定指标及方法

本试验每个处理6个样本,每个处理设置5个重复,外植体接种30 d后统计试管苗的形态指标,包括新生叶片数、根生长数、茎尖新生数和株高增加值(cm)。

1.4 数据处理与分析

用Microsoft Excel 2003软件进行数据处理和制表,利用新复极差分析法进行显著性比较。

2 结果与分析 2.1 培养基类型对甘薯试管苗快繁的影响

由表 1可知:1/2MS的新生叶片数、根生长数、茎尖生长数和株高增加值均最高,分别为4.83、2.17、6.67和2.17 cm,比MS和1/4MS分别高出70.67%、161.45%、54.04%、14.21%和189.22%、44.67%、149.81%、17.29%。方差分析表明:1/2MS的新生叶片数与1/4MS差异显著,根生长数与MS差异显著,茎尖生长数与MS和1/4MS均显著,说明1/2MS不仅没有抑制试管苗的生长,而且对其生长起到了促进作用,因此选定1/2MS为最佳培养基类型。

表 1 培养基类型对甘薯试管苗快繁的影响 Table 1 Effect of medium type on propagation of sweet potato seedling

类型 Type	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height
MS(CK)	2.83±0.94^ab	0.83±0.19^b	4.33±0.88^b	1.90±0.63^a
1/2MS	4.83±1.06^a	2.17±0.43^a	6.67±1.28^a	2.17±0.59^a
1/4MS	1.67±0.20^b	1.50±0.22^ab	2.67±0.66^b	1.85±0.59^a
注:不同小写字母表示在0.05水平差异显著。The different small letters mean significant difference at 0.05 level.The same as follows.

表选项

2.2 支持物对甘薯试管苗快繁的影响

从表 2可以看出:不同支持物对试管苗的各种形态指标均有不同程度的影响。琼脂粉的4个指标均最低,无支持物的新生叶片数、根生长数、茎尖生长数和株高增加值均最高,分别为4.67、1.67、5.33和3.08 cm,表明液体培养的效果优于固体培养。方差分析表明:无支持物与琼脂粉和脱脂棉的新生叶片数及根生长数差异显著,与琼脂粉、脱脂棉和滤纸片的茎尖生长数差异显著,与琼脂粉的株高增加值差异显著。因此选定无支持物(液体浅层培养)为最佳支持物。

表 2 支持物对甘薯试管苗快繁的影响 Table 2 Effect of sustentation on propagation of sweet potato seedling

支持物 Sustentation	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height
琼脂粉(CK)Agarose	1.83±0.47^b	0.33±0.11^b	2.17±0.75^b	1.30±0.45^b
脱脂棉Cotton wool	2.00±0.69^b	0.33±0.11^b	3.33±0.75^b	2.62±0.85^ab
滤纸片Filter paper	2.83±0.74^ab	1.00±0.29^ab	2.67±0.82^b	2.30±0.56^ab
无支持物Without support	4.67±1.21^a	1.67±0.41^a	5.33±1.26^a	3.08±0.61^a

表选项

2.3 水源和光源组合对甘薯脱毒苗快繁的影响

水源和光源的组合试验结果表明:C_ckD₂、C₁D₁和C₂D₂的新生叶片数较高,分别为4.83、5.00和4.67。C_ckD₂和C₂D_ck的根生长数较高,分别为2.33和2.00。C_ckD₂、C₁D₁和C₂D₂的茎尖生长数较高,分别为5.50、5.67和5.67。C_ckD₂、C₁D₁和C₂D₂的株高增加值较高,分别为2.65、2.73和2.92 cm(表 3)。方差分析表明:C₁D₁与C_ckD₁和C₂D₁的新生叶片数差异显著,C_ckD₂与C_ckD₁和C₁D₂的根生长数差异显著,C_ckD₂、C₁D₁和C₂D₂与C_ckD_ck、C_ckD₁、C₁D_ck、C₁D₂和C₂D₁的茎尖生长数差异显著。

表 3 水源和光源的组合对甘薯试管苗快繁的影响 Table 3 Effect of the combination with water and light on propagation of sweet potato seedling

组合 Group	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height
C_ckD_ck	2.67±0.86^ab	1.00±0.38^abc	3.33±0.88^b	1.92±0.85^a
C_ckD₁	2.17±0.99^b	0.50±0.12^c	3.00±0.73^b	1.27±0.64^a
C_ckD₂	4.83±1.14^ab	2.33±0.63^a	5.50±0.34^a	2.65±0.75^a
C₁D_ck	2.67±0.75^ab	0.67±0.15^bc	3.00±0.69^b	1.57±0.61^a
C₁D₁	5.00±1.39^a	1.67±0.36^abc	5.67±0.65^a	2.73±0.99^a
C₁D₂	3.00±0.22^ab	0.50±0.14^c	3.33±0.82^b	1.93±0.16^a
C₂D_ck	2.67±0.66^ab	2.00±0.41^ab	4.17±1.25^ab	1.78±0.95^a
C₂D₁	2.33±0.74^b	1.00±0.29^abc	2.83±0.57^b	1.82±0.40^a
C₂D₂	4.67±1.06^ab	1.33±0.33^abc	5.67±0.55^a	2.92±0.79^a
注: C_ck:蒸馏水Distilled water;C₁:自来水Tap-water;C₂:井水Well water;D_ck:LED灯Lamp of LED;D₁:日光灯Fluorescent lamp;D₂:普通光照Ordinary light

表选项

以上综合分析表明C₁D₁和C₂D₂较优。为了进一步验证这2个方案,11—12月在相同的地点及相同的条件下进行了两者的比较,结果发现:C₁D₁的形态指标与前一次试验的结果差别很小,而C₂D₂则出现生长缓慢甚至生长停滞。最后选定C₁D₁(自来水日光灯)为较优水源和光源的组合。

2.4 糖源及糖浓度对甘薯脱毒苗快繁的影响

将试管苗接入5种不同糖源的培养基中培养30 d,由表 4可知:绵白糖、白砂糖、冰糖和蔗糖之间的差异不大,方差分析结果差异也不显著,这说明绵白糖、白砂糖和冰糖均可替代蔗糖作为试管苗快繁的培养基糖源。但红糖与冰糖和蔗糖的新生叶片数差异显著,在茎尖生长数上与其他糖源的差异均显著。结合成本后选定最佳糖源为绵白糖。

表 4 糖源对甘薯试管苗快繁的影响 Table 4 Effect of carbohydrate source on propagation of sweet potato seedling

糖源 Carbohydrate source	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height
蔗糖(CK)Saccharose	4.83±0.82^a	1.50±0.73^a	5.67±0.61^a	2.25±0.19^a
绵白糖Soft sugar	4.67±0.51^ab	1.00±0.00^a	5.50±0.76^a	2.22±0.52^a
白砂糖White sugar	3.83±0.75^ab	1.00±0.26^a	4.50±0.85^a	2.33±0.81^a
冰糖Crystal sugar	5.17±0.85^a	1.67±0.21^a	6.00±0.22^a	2.38±0.53^a
红糖Brown sugar	2.17±0.61^b	0.83±0.13^a	2.33±0.97^b	1.35±0.40^a

表选项

随着绵白糖质量浓度升高,各形态指标的值也随之升高,且在60 g · L^-1时达到最大(表 5)。方差分析表明:新生叶片数,60 g · L^-1除与50 g · L^-1不显著外,与其他5个质量浓度的差异均显著;根生长数,60 g ·L^-1 与0 g · L^-1的差异显著;茎尖生长数,60 g · L^-1显著多于其他处理,以上结果表明组培苗在较高糖浓度的培养基中生长会更健壮,因此选定最佳糖浓度为60 g · L^-1。

表 5 绵白糖质量浓度对甘薯试管苗快繁的影响 Table 5 Effect of the soft sugar concentration on propagation of sweet potato seedling

绵白糖质量浓度/(g·L^-1) Soft sugar concentration	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height
0	0.67±0.09^b	0.16±0.04^b	1.17±0.39^c	1.27±0.18^a
10	0.83±0.13^b	0.17±0.03^ab	1.17±0.23^c	1.47±0.26^a
20	1.50±0.87^b	0.50±0.18^ab	2.50±0.62^bc	1.71±0.18^a
30	1.33±0.68^b	0.50±0.13^ab	1.50±0.23^bc	1.67±0.34^a
40	2.17±0.47^b	0.67±0.18^ab	2.67±0.98^bc	1.73±0.67^a
50	2.50±0.47^ab	0.83±0.09^ab	2.83±0.43^b	1.88±0.43^a
60	5.33±0.39^a	1.50±0.25^a	5.17±0.39^a	2.50±0.39^a

表选项

2.5 各因素的较优水平组合对甘薯脱毒苗快繁的影响

根据2.1~2.4节单因素试验的结果,从A、B、C、D、E和F 6个因素中分别筛选出了1个最佳水平,再加上各个因素的对照水平,进行L₈(2⁷)正交试验,研究它们的最佳组合,试验方案及试验结果见表 6。

表 6 L₈(2⁷)正交试验方案及其对甘薯试管苗快繁的影响 Table 6 The methods of L₈(2⁷)orthogonal experiment and its effect on propagation of sweet potato seedling

编号 Code	因素Factors						结果Result
编号 Code	A	B	C	D	E	F	新生叶片数 No.of leaves	根生长数 No.of roots	茎尖生长数 No.of stem tip	株高增加值/cm Added value of plant height	总值 Total
①	A_ck	B_ck	C_ck	D_ck	E_ck	F_ck	3.00±0.78^c	1.00±0.33^de	3.33±0.71^c	2.25±0.84^c	9.58
②	A₁	B₃	C_ck	D_ck	E_ck	F₆	6.80±0.65^a	5.60±1.18^a	5.60±0.80^a	4.84±0.25^ab	22.84
③	A_ck	B₃	C_ck	D₁	E₁	F_ck	2.95±0.89^c	2.27±0.66^cd	3.12±0.92^c	3.33±0.93^bc	11.67
④	A₁	B_ck	C_ck	D₁	E₁	F₆	3.12±0.92^bc	2.93±0.78^bc	3.44±0.12^bc	3.87±0.33^bc	10.24
⑤	A₁	B_ck	C₁	D₁	E_ck	F_ck	3.24±0.99^bc	0.80±0.09^e	3.37±1.02^bc	2.41±0.89^c	6.58
⑥	A_ck	B₃	C₁	D₁	E_ck	F₆	3.09±0.43^bc	2.02±0.42^cde	3.00±0.79^c	3.26±0.15^bc	8.28
⑦	A₁	B₃	C₁	D_ck	E₁	F_ck	6.33±0.76^a	3.67±0.09^b	6.83±0.23^a	6.03±0.17^a	16.53
⑧	A_ck	B_ck	C₁	D_ck	E₁	F₆	5.67±0.09^ab	2.00±0.45^cde	5.33±0.54^ab	4.42±0.72^ab	11.75
X₁	41.28	38.16	54.32	60.72	47.28	44.36
X₂	56.19	59.32	43.16	36.76	50.20	53.12
R	7.46	10.58	5.58	11.98	1.46	4.38
注: A_ck:MS;A₁:1/2MS;B_ck:琼脂粉Agarose;B₃:无支持物Without support;E_ck:蔗糖Saccharose;E₁:绵白糖Soft sugar;F_ck:30 g · L^-1;F₆:60 g · L^-1

表选项

经过6因素2水平正交试验,发现各种组合对甘薯脱毒苗快繁的影响差异很大。通过对表 6的直观分析得出各因素内各水平的极差(R)。极差的大小反映了该因素的影响程度,极差大的因素对试验结果的影响也大,从R的大小可知,对甘薯脱毒苗快繁影响从大到小依次为光源、支持物、培养基类型、水源、绵白糖浓度和糖源。从表 6可见:甘薯脱毒苗快繁的最优水平组合为A₁ B₃ C_ck D_ck E₁ F₆,即1/2MS+无支持物+蒸馏水+LED灯+60 g · L^-1绵白糖。编号②的形态指标总值最高,为22.84。②和⑦与①③④⑤⑥的新生叶片数差异显著,②⑤⑦三者之间根生长数两两差异显著,②和⑦与①③④⑤⑥的茎尖生长数差异显著,⑦与①③④⑤⑥的株高增加值差异显著,⑦的成本低于②,因此选定⑦(1/2MS+无支持物+自来水+LED灯+30 g · L^-1的绵白糖)为最佳快繁方案。

2.6 优化前后甘薯脱毒苗生长情况及成本对比

在其他条件相同的情况下,将甘薯脱毒试管苗置于优化前(MS+琼脂粉+蒸馏水+LED灯+30 g · L^-1蔗糖)和优化后的条件下恒温培养30 d,从图 1可以看出:优化后的培养较优化前生长好,表现在叶片新生数、根生长数、茎尖生长数及株高增加值均具有明显优势。根据董淑英等^[14]的研究报道核算成本,由表 7可知优化后1 L培养基的成本降低了1.358元,成本降低了81.04%,此外,自来水代替蒸馏水和LED节能灯的使用,能使成本进一步降低。

	图 1 优化前后甘薯脱毒苗生长情况比较 Fig. 1 The growing performances comparison of the optimization and un-optimization in sweet potato seedling
图选项

表 7 甘薯试管苗优化前后成本 Table 7 The cost accounting of the optimization and un-optimization in sweet potato seedling

元 · L^-1
培养成本Culture cost	MS	琼脂粉Powdered agar	蔗糖Sucrose	总成本Total cost
优化前Un-optimization	0.245	0.680	0.750	1.675
优化后Optimization	0.123	0.000	0.195	0.318
成本降低量Cost reduction	0.123	0.680	0.555	1.358

表选项

3 结论与讨论

植物组织培养技术一般采用固体培养,但其成本高,操作复杂,壮苗效果不理想。本研究发现液体培养效果明显优于固体培养,其中液体浅层培养(无支持物)又优于滤纸片和脱脂棉,这是因为棉纤维中的纤维素将培养基中运动的分子吸附并停留在其表面一段时间,滤纸片则使试管苗不能较好地与培养基中的分子结合,均影响了植株对养分的吸收,这与韩仰海等^[15]对马铃薯的研究结果相同。液体浅层与固体培养相比省去了琼脂粉,使培养成本得到了降低;营养成分更易被植物的茎吸收,有利于植物的快繁;培养基制作和接种过程方便快捷。LED灯作为一种新型的光源,国内已经有学者将其应用到了脱毒试管苗的组培快繁中^[16],但在脱毒甘薯的组培快繁中却没有报道,本试验将这种新型的光源应用到甘薯中,取得了较好的效果,这是因为植物光合作用主要吸收波长为400~500 nm的蓝光和600~700 nm的红光。而日光灯的波长为520~610 nm,被植物色素吸收的比率相对较低^[17]。

我国植物组织培养快繁近几年已取得显著进展,并在一些植物上建立了一套比较完善的快繁体系,实现了产业化。但还有许多因素限制了甘薯脱毒苗的快繁及产业化生产。本试验首次应用单因素与正交相结合的方法,研究发现在甘薯脱毒种苗生产过程中,1/2MS可替代MS、液体浅层培养替代固体培养和自来水替代蒸馏水,并使用LED灯和30 g · L^-1的绵白糖,试管苗具有萌芽性好、叶片生长数多、易生根、叶片浓绿和生长良好等生长优势,也降低了生产成本,必将对甘薯的产业发展有极大的促进作用。

参考文献(References)

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