大围山微型鸡是2006年在云南屏边大围山地区发现的原始鸡种,体型较小,成年公鸡平均857 g,母鸡平均682 g,是我国地方鸡种中体质量较轻的地方鸡种之一。该鸡外观秀丽,斗性强,具有一定的观赏性,可作为宠物鸡或观赏类鸡的育种素材。因其胸肌、腿肌发达,骨细,肉味香,肉质细嫩,被当地群众称之为“香鸡”;又因其具有耐粗饲、适应性及抗病力强等特点,是培育高档优质鸡不可多得的育种素材^[1]。20世纪初,当地就有饲养该鸡的历史,主要分布在屏边县城以及4~5个乡镇,由于其生长缓慢,种群数量慢慢减少,发现时种群数约3 000只^[2]。由于分布的地理环境较为封闭,了解其自然群体的遗传结构及其遗传多样性状况,能为大围山微型鸡有效保种和选育利用提供理论依据和遗传背景资料。

线粒体DNA(mtDNA)是细胞质内的遗传物质,群体内变异大、分子结构简单,在世代传递过程中极少发生DNA重组,较核DNA突变率高及进化速率快。根据其序列构建的系统发育树能很好地反映物种的母系迁徙历史。利用mtDNA序列差异来研究物种的起源和进化,也有助于了解物种的驯化经历^[3]。D-loop为mtDNA上最重要的非编码区,进化速率较编码区更快,是适合亲缘关系较近的群体进行遗传分化研究的理想分子标记,已被广泛用于家禽的起源与进化、群体遗传结构、品种间的系统发育关系等方面的研究^{[4, 5]}。为此,笔者测定了大围山微型鸡mtDNA D-loop区的全序列,并结合GenBank已登录红色原鸡(Gallus gallus)的D-loop区全序列,从分子水平上探讨大围山微型鸡的起源和遗传多样性。

30只(10♂,20♀)大围山微型鸡,来自国家地方禽种资源基因库。随机取样,翅静脉采血,柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝,采用常规的酚/氯仿法提取血液基因组DNA,8 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳检测。

选取红色原鸡5个亚种印尼亚种(Gallus gallus bankiva,GGB)NC007237,指名亚种(G.gallus gallus,GGG)AB007725、NC007236,印度亚种(G.gallus murghi,GGM)HE793430、GU261707~GU261709,海南亚种(G.gallus jabouillei,GGJ)GU261674、GU261696,滇南亚种(G.gallus spadiceus,GGS)NC007235、GU261690、GU261692、GU261693、GU261695、GU261702~GU261704、GU261706、GU261716等已经测出mtDNA D-loop区全序列的19条序列,从GenBank数据库中下载其mtDNA D-loop区全序列,与大围山微型鸡进行系统发育分析。

以红色原鸡(G.gallus)线粒体基因组的已知DNA序列(NC_007235)作为参考序列,用Primer Premier 5.0软件设计1对引物扩增大围山微型鸡mtDNA D-loop区。引物对序列: 5′-AAACACCCAAACTCACTAAC-3′/5′-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3′,送上海生工生物工程有限公司合成。

PCR扩增体系(50 μL):PCR Mix(南京博尔迪公司)25 μL,10 μmol · L^-1引物各1.5 μL,模板2 μL,灭菌水20 μL。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 4 min。15 g · L^-1低溶点琼脂糖(Promega公司)凝胶电泳检测PCR产物,用试剂盒回收纯化,然后交由上海英骏生物技术公司进行测序。所有序列采用双向测序,以便比对核实。

将得到的序列与GenBank中红色原鸡参考序列进行比对,剪掉引物及多余的序列,DNA序列片段经DNAStar 5.02软件的SeqMan程序拼接。用DnaSP 5.10软件统计多态位点数、单倍型数、核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)和核苷酸平均差异数(K)^[6]。用MEGA 4.0进行转换与颠换数目的统计和碱基组成分析,并采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树。发育树选用Kimura 2模型,1 000次重复^[7]。

设计的引物在大围山微型鸡基因组中得到了较好的扩增,测序结果显示:大围山微型鸡mtDNA D-loop区全长1 231~1 232 bp,1 231 bp单倍型在859 bp处存在C碱基缺失。T、C、A和G 4种碱基含量分别为33.6%、26.4%、26.7%和13.3%,其中A+T含量(60.3%)明显高于G+C含量(39.7%)。mtDNA D-loop区为非编码区,富集A/T碱基,能被RNA聚合酶等特异分子识别而作为转录的起始序列。

大围山微型鸡mtDNA D-loop区Pi为0.004 43±0.000 14,Hd为0.685±0.079,K为5.448。变异区在167至1 215 bp间,共发现18处多态位点。除391 bp处发生C-A颠换外,其余全部为转换,其中T-C转换13处,A-G转换4处。

通过DnaSP 5.10软件进行单倍型统计分析,在大围山微型鸡群体D-loop区序列中共检测到18个多态位点,并由此界定了6个单倍型(Hap1~Hap6,图 1)。Hap2均为公鸡,Hap5均为母鸡,其余公母均有。Hap3有16个个体,为优势单倍型。经序列比对发现,除Hap3以外,其余单倍型均在859 bp处存在C碱基缺失。参照Liu等^[8]划分标准可以分为A、B、D和E 4个分支。A分支有2种单倍型,7个个体,占23.3%(7/30);B分支有2种单倍型,19个个体,占63.3%(19/30);D分支有1种单倍型,3个个体,占10%(3/30);E分支有1种单倍型,1个个体,占3.3%(1/30)。

	图 1 大围山微型鸡mtDNA D-loop区的多态位点分布 Fig. 1 Alignment of variable nucleotide sequence positions among the five haplotypes observed in Daweishan Mini Chicken
图选项

根据大围山微型鸡mtDNA D-loop区全序列分出的6种单倍型,采用NJ法构建了大围山微型鸡与红色原鸡的系统发育树(图 2)。Hap1和Hap2与原鸡滇南亚种GGS7聚为一类;Hap3和Hap4与原鸡滇南亚种GGS1、GGS4聚为一类;Hap1~4与原鸡海南亚种(GGJ1、GGJ2)聚为一类。Hap5与原鸡指名亚种(GGG1、GGG2)、滇南亚种(GGS2、GGS8)、印度亚种(GGM4)、原鸡印尼亚种(GGB)聚为一类;Hap6与原鸡印度亚种GGM1、GGM2、GGM3聚为一类。

	图 2 基于mtDNA D-loop区序列采用NJ法构建的系统发育树 Fig. 2 Neighbor-joining tree based on populations mtDNA D-loop sequences GGS:Gallus gallus spadiceus滇南亚种;GGJ:G.gallus jabouillei海南亚种;GGG:G.gallus gallus指名亚种;GGB:G.gallus bankiva印尼亚种;GGM:G.gallus murghi印度亚种
图选项

群体mtDNA变异程度的2个重要指标是单倍型多样度和核苷酸多样度,二者值越大,遗传多样性越丰富,群体的多样性程度越高。大围山微型鸡mtDNA D-loop区Pi为0.004 43,Hd为0.685。与同样用mtDNA D-loop区研究茶花鸡(Hd=0.750、Pi=0.013 36)^[4]、瓢鸡(Hd=0.883、Pi=0.015 03)^[9]、西畴乌骨鸡(Hd=0.884、Pi=0.014 52)^[10]等云南其他品种得出的结果相比偏低。推测可能因为大围山微型鸡是一个较封闭的原始鸡种,未受其他外来鸡种的侵入,因而变异程度较低。大围山微型鸡生长缓慢,体型矮小,种群数量慢慢减少,群体数量不大也是变异程度较小的原因之一^[11]。

mtDNA在遗传过程中,通过卵细胞质传递,较少发生DNA重组,其野生祖先的mtDNA类型一般能得以保持。这种遗传方式,一个个体就能代表一个母性集团,因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构,研究者可以从复杂的遗传背景中分辨不连续的母系血统,即使经过几千年的杂交繁育,系统关系依然明晰^[12]。

Fumihito等^[13]研究表明红色原鸡(G.gallus)为家鸡的野生祖先,并且由多个母系在中国南部、南亚和东南亚地区独立驯化而来^[14]。本研究结果显示大围山微型鸡可分为A、B、D和E 4个分支,由于mtDNA呈母系遗传,提示大围山微型鸡在遗传来源组成上具有4个血统。A分支与原鸡滇南亚种GGS7(GU261695)聚为一类,B分支与原鸡滇南亚种GGS1(NC_007235)、GGS4(GU261704)为一类;大围山微型鸡群体主要(90%,26/30)分布于分支A和B中,说明原鸡滇南亚种(G.gallus spadiceus)在大围山微型鸡形成过程贡献最大。E分支仅有1个个体,与原鸡印度亚种聚为一类,提示母系可能起源于原鸡印度亚种(G.gallus murghi)。D分支与原鸡指名亚种(GGG1、GGG2)、滇南亚种(GGS2、GGS8)、印度亚种(GGM4)、印尼亚种(GGB)聚为一类,推测D分支有多个母系起源。这与Niu等^[15]和Liu等^[16]报道的中国家鸡多个母系起源的研究结果一致。因大围山微型鸡可划分为4个支系,可以考虑按不同母系来源进行保种。