禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的一种常见的重要细菌性传染病,且易与其他病原性细菌、病毒并发或混合感染,给养禽业造成了巨大的经济损失^[1]。研究发现,与禽大肠杆菌毒力相关的致病因子主要有:菌毛、摄铁系统、温度敏感性血凝素、抗血清存活因子、毒素等^[1]。在上述大肠杆菌诸多致病因子中,菌毛可帮助病原性大肠杆菌在易感动物机体内入侵、定居、增殖或释放毒力因子,在感染和致病过程中起着重要作用^{[2, 3]}。在革兰氏阴性菌中存在许多不同类型的菌毛,其中CU类菌毛最多^[4]。CU菌毛是杆状结构,有柔韧易弯曲的纤丝状顶端,顶端是黏附素^[5]。根据CU进化树将革兰氏阴性菌的CU菌毛按usher蛋白序列种系进化分为6个进化支(α、β、γ、κ、π、σ)和5个进化亚支(γ¹、γ²、γ³、γ⁴、γ^*)^[6]。auf菌毛属于γ进化支^[7],auf菌毛基因编码功能隐藏的表面细胞器,因此它对细菌定殖的具体功能尚不明确^[8]。

笔者在前期试验中对大肠杆菌DE205B株进行了全基因测序,发现了auf基因操纵子,文献^[7]报道其在大肠杆菌中的分布广泛,且较保守,但功能尚不明确。本试验用PCR方法检测了auf基因在大肠杆菌中的分布,构建了auf基因缺失菌株,并通过测定其生长曲线、致病力、体内感染力、黏附及侵袭能力、环境耐受力、抗血清杀菌能力,比较野生菌株和缺失菌株的生物特性差异,从而推测auf基因在禽致病性大肠杆菌致病过程中的作用。

禽致病性大肠杆菌菌株DE205B是2007年在安徽蚌埠从具有神经症状的鸭的脑部分离,试验用质粒pKD4、pKD46和pCP20均由南京农业大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

胰蛋白胨(tryptone)、酵母抽提物(yeast extract)为OXOID公司产品。PrimeSTAR^® HS、DNA Marker为TaKaRa公司产品。PCR Master Mix为诺唯赞公司产品。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为Omega公司产品。

参照Datsenko等^[9]建立的λ噬菌体Red同源重组技术构建auf基因缺失菌株。

制备DE205B电转感受态细胞,取1 μL pKD46质粒溶液加入感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30 min后进行电击转化。电击参数如下:电压2 300 V,电容25 μF,电阻200 Ω。电击后加入预热的LB培养基,28 ℃ 100 r · min^-1培养1 h,涂布含氨苄青霉素(Amp)的LB平板,28 ℃培养过夜,筛选阳性克隆。

以pKD4为模板,用缺失引物对qsauf-F/R(表 1)扩增两端带有60 bp目的基因同源臂、内部含有FRT位点的卡那霉素(Kan)抗性片段。PCR反应体系:PrimeSTAR^ HS 25 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,最后加灭菌超纯水至50 μL。反应参数:98 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35个循环。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的条带,即获得线性打靶DNA。

制备DE205B-pKD46电转化感受态细胞,将纯化的线性打靶DNA片段转化入感受态中。电击参数见1.3.1节。电击转化后加入预热的SOC培养基中,37 ℃ 100 r · min^-1培养2 h;涂布于含Kan的LB平板,37 ℃培养过夜,挑取单克隆进行PCR鉴定。

将pCP20电转入含外源Kan基因缺失菌株的感受态中。电击后加入LB培养基,28 ℃ 100 r · min^-1培养1 h;取培养液涂布含Amp的LB平板,28 ℃过夜。挑取无Kan抗性的克隆,42 ℃培养过夜,涂平板。挑单克隆,用引物对pKD46-F/R、pCP20-F/R分别鉴定pKD46、pCP20,无目的条带者即为目的菌,表明缺失菌株构建成功。

利用Trizol法提取LB培养基培养条件下DE205B和DE205BΔauf的总RNA,并使用RNase-free DNaseⅠ除去基因组DNA污染。用PrimeScript^TM Reagent Kit反转录合成cDNA。根据auf基因序列,设计荧光定量PCR引物(表 1)。以看家基因dnaE为内参,用荧光定量PCR检测各菌株auf基因的表达水平。

将野生菌株及auf缺失菌株新鲜培养菌液以1 ∶ 100的浓度转接至50 mL LB中,37 ℃ 180 r · min^-1培养,每1 h取1次样,测A₆₀₀值,绘制各菌株的生长曲线。

将野生菌株及缺失菌株的新鲜培养菌液转接于LB培养基中,培养至对数期后收集菌体,用预冷的PBS洗涤3次,重悬菌体,稀释至5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵和5×10⁴ CFU · mL^-1,每个梯度的细菌分别腹腔接种4周龄ICR小鼠和肌肉注射7日龄雏鸭,每只0.2 mL,每组各10只;攻毒后观察7 d,记录小鼠、雏鸭存活情况,计算各菌对小鼠和雏鸭的半数致死剂量(LD₅₀)。

根据1.6节方法,接种雏鸭,每只5×10⁷ CFU,每组8只;感染24 h后处死雏鸭,无菌条件下分别取心、肝、肺、脑,称质量后加入PBS匀浆,倍比稀释,用平板计数法进行细菌计数,统计脏器中的细菌含量,分析各菌的定殖能力。

将野生菌株及缺失菌株新鲜培养菌液转接于LB培养基中,培养至对数期后收集菌体,用DMEM培养基洗涤3次,调整菌液至适当浓度;将处理好的菌液加入细胞孔中;将细胞板800 r · min^-1离心20 min,置于37 ℃ 5% CO₂细胞培养箱中培养2 h。以DMEM洗涤细胞板3次,去除未黏附的细菌,加入胰酶消化细菌,再加入ddH₂O裂解细胞,将样品进行梯度稀释,涂布麦康凯平板以进行菌落计数。重复3次。

参照文献^[10]报道,将野生菌株及缺失菌株分别培养过夜,用预冷的PBS洗涤菌液3次,重悬菌体,调整各菌含量为5×10⁷CFU · mL^-1,置于冰上备用。分别检测野生菌株及缺失菌株对外界苛刻环境(酸性、碱性及高渗透压)的耐受力。重复3次。

分别用乙酸(ethanoic acid,HAc)调整LB培养基的pH至4.0和5.0后,各取900 μL酸性LB培养基与100 μL菌液混合,37 ℃作用20 min;对照组使用普通LB培养基。

取100 μL菌液与100 μL的Tris-HCl缓冲液(100 mmol · L^-1,pH 10.0)混匀后,于37 ℃作用30 min;对照组以PBS代替。

取100 μL菌液与等体积的NaCl溶液(4.8 mol · L^-1)混匀后于37 ℃作用60 min,对照组以PBS代替。

将菌液进行上述处理后,用PBS稀释,涂布麦康凯平板,37 ℃培养过夜,菌落计数。

参照文献^[11]的方法并略有改动。将SPF鸡血清用PBS稀释至100%、50%、25%、12.5%、5%,保存备用。将野生菌株及缺失菌株培养过夜,用预冷的PBS洗涤3次,再重悬菌体,调整菌液浓度为10⁸ CFU · mL^-1。 取10 μL菌液与190 μL各稀释度的血清混合,37 ℃培养30 min。对照组采用PBS和灭活100%鸡血清与菌液作用,最后倍比稀释,涂平板,过夜培养,统计各菌的存活数量。

提取pKD46质粒电转入DE205B中,PCR检测结果与预期相符,并获得了线性打靶DNA,其大小与预期相符。产物回收后电转至DE205B-pKD46感受态中,检测结果与预期相符。提取pCP20质粒,电转入含外源Kan基因缺失菌株的感受态中,检测Kan抗性是否去除。PCR检测质粒pKD46、pCP20,发现已去除auf基因,表明缺失菌株构建成功,命名为DE205BΔauf。

通过Real-time PCR检测野生菌株及auf缺失菌株中auf基因的表达水平。如图 1所示:在缺失菌株DE205BΔauf中未检测到auf基因的表达,从mRNA水平证实auf缺失菌株构建成功。

	图 1 野生菌株及auf基因缺失菌株的相对表达率 Fig. 1 Relative expression rate of auf in wild-type and mutant strains
图选项

经测定,野生菌株和auf缺失菌株的生长曲线无明显差异(图 2),表明黏附素基因auf的缺失未对细菌的生长产生显著影响。

	图 2 野生菌株及auf野生菌株和auf缺失菌株的生长曲线 Fig. 2 Growth curve of wild-type and mutant strains
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如表 2所示:野生菌株、auf缺失菌株在雏鸭模型上的半数致死量(LD₅₀)分别为3.2×10⁵和1.2×10⁶ CFU,在小鼠模型上的半数致死量分别为5.1×10⁵和1.0×10⁶ CFU。此结果表明auf缺失菌株的毒力较野生菌株降低。

统计结果(图 3)显示:auf缺失菌株在心脏、肝脏、肺及脑中的定殖能力均有所下降,尤其在心脏中,缺失菌株的定殖能力显著降低(P<0.05)。

	图 3 野生菌株和缺失菌株在动物体内各组织中的定殖(*P<0.05) Fig. 3 Colonization of wild-type and mutant strains in vivo
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统计结果(图 4)显示:缺失菌株DE205BΔauf的黏附能力下降了80.7%,显著低于野生菌株DE205B(P<0.05),此结果表明auf缺失菌株的黏附能力下降。

	图 4 缺失菌株对DF-1的相对黏附率(*P<0.05) Fig. 4 Relative adhesion rate of mutant strains to DF-1 cells
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对野生菌株和auf缺失菌株进行酸、碱及高渗处理,通过菌落计数统计缺失菌株相对于野生菌株的存活率。如图 5所示:在酸性、碱性及高渗的环境中,auf缺失菌株的相对存活率均极显著降低(P<0.001)。其中在pH 4.0和pH 5.0的酸性环境中分别降低86.7%、77.3%,在高渗环境下降低98.3%,在碱性环境中降低59.0%。此结果表明:与野生菌株相比,auf缺失菌株耐酸、耐碱及耐高渗透压的能力显著下降。

	图 5 缺失菌株在不同环境条件下的相对存活率(* * * P<0.001) Fig. 5 The relative survival rate of the mutant strain compared to wild-type strain under different environmental stress
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血清被稀释后,其中的抑菌因子均被稀释,如图 6所示:将野生菌株和缺失菌株进行相同条件处理后,发现auf缺失菌株在鸡血清含量分别为100%、50%和25%的条件下存活率均极显著下降(P<0.01),分别降低70.7%、82.0%、45.7%。说明auf缺失菌株的抗血清杀菌能力显著下降。

	图 6 缺失菌株在不同稀释度血清中的相对存活率(* * *P<0.001,* *P<0.01) Fig. 6 The relative survival rate of the mutant strain compared to wild-type strain under different dilutions of serum
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肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)可在人和动物体内引起几乎每个器官的感染。在ExPEC中,禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起禽类严重的肠道外疾病,进而导致高患病率和致死率,从而造成巨大的经济损失^[12]。Li等^[13]提出假设:家禽可能成为人源肠道外致病性大肠杆菌的宿主,并可能是尿道致病性大肠杆菌(UPEC)和新生儿脑膜炎大肠杆菌(NMEC)毒力相关基因的潜在提供者。

本试验选取的DE205B株属于禽高致病性大肠杆菌,是从具有败血症和神经症状的鸭脑中分离得到,经系统进化分群(ECOR)分析属于B群^{[14, 15, 16]}。APEC DE205B基因组上编码有一个auf黏附素基因,通过BLAST比对,此基因与大肠杆菌APEC O1、UTI89编码的auf基因同源性高达99%,与CFT073编码的auf基因同源性达96%,可见auf基因在大肠杆菌强毒株中普遍存在,且同源性较高,表明其可能与大肠杆菌的毒力相关。

细菌黏附于不同宿主组织及无生命物质表面的能力对于其定殖、生存和感染至关重要^{[4, 17]}。对DF-1细胞的黏附试验结果显示,auf缺失菌株的黏附能力显著低于野生菌株DE205B,这说明auf能促进APEC DE205B对宿主细胞的黏附。在体内感染试验中,发现缺失菌株在心脏、肝脏、肺脏及脑中的定殖能力均有下降,尤其是在心脏中的定殖能力显著低于野生菌株,进一步表明auf基因能影响细菌DE205B在宿主体内的定殖能力。用auf缺失菌株及野生菌株对小鼠及雏鸭进行感染试验,auf缺失菌株对小鼠和雏鸭的LD₅₀均上升了一个数量级,而auf的缺失未对细菌生长产生显著影响,因此可得出结论,auf基因通过促进APEC DE205B对宿主细胞的黏附与定殖,从而增强细菌的毒力。

有研究表明大肠杆菌可调节自身对环境的耐受能力,这种适应能力对大肠杆菌在特异环境(比如宿主的胃、肠等)的存活至关重要^[18]。从环境耐受力试验结果中发现,auf缺失菌株对酸性、碱性及高渗环境的耐受力均极显著低于野生菌株,表明auf基因能增强细菌对环境的适应能力。抗血清杀菌性是APEC的一个重要的毒力因素,APEC的抗血清杀菌能力与败血症密切相关^{[19, 20]}。本试验结果表明,auf的缺失导致APEC DE205B对血清的抗杀菌能力显著下降,表明auf基因能促进DE205B在宿主血清中的存活,以便更有效地感染宿主。