草莓连作障碍在草莓种植区普遍存在,对草莓种植业危害严重,而根腐病是草莓连作障碍中最主要的病害之一,已成为制约草莓产业快速发展的主要障碍^[1]。目前,报道的最常见的引起草莓根腐病病原菌有立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、疫霉(Phytoqhthora fragariae)及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)等^{[2, 3]}。农业生产上防治草莓根腐病一般采用轮作^[4]、土壤消毒^[5]等措施。轮作效果较好,但难以适应集约化设施农业种植模式的要求;利用溴甲烷等化学药剂对土壤进行消毒,可有效降低草莓根腐病的发病率,但对土壤环境污染较大,易产生药物残留等问题,并且已被世界大多数国家禁止使用^[6]。因此,寻找更安全高效的生防制剂防治草莓根腐病具有重要的意义。

近年来,国内外科技工作者对草莓根腐病的生物防治已有研究报道,已分离获得有一定生防效果的细菌、放线菌及真菌^{[7, 8, 9]}。徐淑华等^[10]从草莓种植土壤中筛选出1株生防细菌,盆栽试验显示其对草莓根腐病的防治效果为51.75%,并能显著促进草莓的生长发育;王占武等^[11]研究发现枯草芽孢杆菌B501对草莓枯萎病(Fusaruim oxysporum f.sp.fragriae)有广谱杀菌的作用,而且也能够很好地在草莓根际定殖;申光辉等^[12]从草莓根域土壤中筛选出了对草莓根腐病有拮抗作用的真菌HF3和HF7,盆栽试验表明其对草莓有很好的促生效果,能有效地提高草莓的生物量,对根腐病的防效为53.0%和46.9%。目前,生物防治植物病害最传统的做法是将生防菌制成活菌制剂直接应用,但液体制剂存在不易保存、活性不稳定等问题。而通过固体发酵生产的活菌菌剂,其孢子数量大,活性强,便于贮藏和运输,且发酵设备简单,成本低廉,易于在生产中推广应用^[13]。本实验室前期筛选到1株生防效果优良的白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)CT205,对多种植物病原真菌均有较强的抑制作用^[14]。本研究尝试从草莓病株根茎部位分离出高致病的病原菌,对其进行初步鉴定及柯赫氏法则验证,进而研究拮抗菌CT205的固体发酵制剂对草莓根腐病的防控效果,以期为放线菌固体发酵制剂用于草莓连作障碍的修复提供科学依据。

Streptomyces albospinus CT205由本实验室分离保存。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH自然。

马丁氏培养基:葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,KH₂PO₄ 1 g,MgSO₄ · 7H₂O 0.5 g,孟加拉红30 mg,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH自然,115 ℃灭菌30 min后加入0.03 mg链霉素。

CT205种子培养基:葡萄糖45 g,黄豆粉30 g,酵母粉5 g,CaCO₃ 5 g,蒸馏水1 L,pH 7.5,121 ℃灭菌20 min。

CT205固体基础发酵培养基:麦麸500 g · kg^-1,小米粉120 g · kg^-1,黄豆粉60 g · kg^-1,米糠120 g · kg^-1,稻壳200 g · kg^-1,CaCO₃ 3 g · kg^-1,料和水质量比1 ∶ 0.8,起始pH 7.5,121 ℃灭菌20 min。

从南京麒麟镇后村草莓种植大棚中,采集草莓根腐病发病植株,采用常规组织分离法^[15],先用自来水冲洗植株根系表面泥沙,再用吸水纸吸去表面多余水分,剪去须根,在病健交界处切取适当大小的组织块,用75%(体积分数)乙醇表面消毒30 s,再用0.1%(体积分数)升汞浸泡1 min,最后用无菌水浸洗3~4次,置于马丁氏培养基上30 ℃恒温培养4~5 d,挑取病斑组织边缘长出的菌丝接种于PDA培养基上进行纯化。

观察、记录病原菌Y3的菌落形态和气生菌丝生长状况等培养特征。显微镜下观察分生孢子形态等形态特征。

采用OMEGA公司的试剂盒提取菌株基因组DNA,真菌通用引物ITS1(5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行rDNA-ITSPCR扩增,PCR扩增产物由上海美吉有限公司进行纯化并测序,测序结果登录GenBank数据库,利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)与GenBank数据库中的序列进行比对,获得最相近菌株rDNA-ITS序列,采用MEGA 4.0软件绘制系统发育树。

采用伤根法接种菌株Y3的孢子悬液在健康草莓的根系周围,观察发病症状,从发病植物根部分离病原菌,并进行初步鉴定。

采用平板对峙法,将培养好的病原菌Y3及生防菌CT205用打孔器(Φ=5 mm)打块,将其分别置于PDA平板上,对峙培养,30 ℃培养5~7 d,观察抑菌效果。

菌株CT205在PDA培养基斜面上活化,28 ℃培养5~7 d,待分生孢子丰满,挑取3环孢子,接种于50 mL种子培养基中(装于250 mL三角瓶),30 ℃、170 r · min^-1振荡培养48 h,备用。

在250 mL三角瓶中,装入20 g固体基础发酵培养基,料和水质量比为1 ∶ 0.8,121 ℃灭菌20 min。接种15%(体积分数)的种子液,28 ℃培养6 d,每天用无菌玻璃棒翻动2次混匀。发酵结束后,用稀释涂布法测定制剂中菌含量。

选取长势较好且大小一致的健康草莓幼苗(红颊),移栽到装有1.5 kg草莓连作土的盆钵中,每盆1株,常规管理。试验设3个处理:固体发酵菌剂处理、菌悬液处理和对照。固体发酵菌剂处理为1%(质量分数)固体发酵菌剂(15 g)提前与盆栽土混合拌匀装入盆钵中,菌悬液处理为1%(体积分数)菌悬液(15 mL)用水稀释后沿根灌注。对照为草莓连作土,不加任何处理。病原菌Y3用PDA液体培养基摇瓶培养5 d后,收获分生孢子并调整其孢子浓度为10⁵ mL^-1。在草莓移栽缓苗1周后,采用灌注法接种在草莓根系周围,接种量为每盆5 mL,每个处理10盆。于2014年3月14日进行盆栽试验,定期观察记录草莓生长情况,2个月后结束盆栽试验,挖取植株,统计发病程度及生物量。

草莓根腐病发病程度采用Vestberg等^[16]的方法分为6级:0级为根系未发病;1级为根系发病率小于等于30%,叶片正常;2级为根系发病率大于30%小于等于60%,叶片正常;3级为根系发病率大于60%小于等于80%,叶片变黄;4级为根系发病率80%以上,叶片枯萎;5级为整株死亡,叶片干枯。病情指数^[17]和生防效果分别按照下列公式计算。

病情指数=[∑(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)]×100%;

生防效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

菌株Y3在PDA培养基上30 ℃培养7 d后,菌落特征及分生孢子形态如图 1所示。Y3菌落正面中心脐状突起,有细微同心环纹,气生菌丝茂盛,絮状,菌落白色,随着培养时间的延长,基内菌丝分泌褐色色素。在光学显微镜下观察其气生菌丝及分生孢子形态发现,Y3菌丝分隔,分化形成的分生孢子呈圆柱状或镰刀状,稍弯。

	图 1 菌株Y3的菌落(A)及分生孢子(B)形态(10×40) Fig. 1 Morphology of colony(A)and spore(B)of strain Y3
图选项

提取菌株Y3的基因组rDNA,扩增其rDNA-ITS序列,得到1条525 bp 左右的条带,在GenBank上进行同源性比对,发现与其一致性较高的菌株均属于镰刀菌属(Fusarium),与多株尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的同源性为97%,根据菌株的形态特征并结合rDNA-ITS序列分析,将菌株Y3初步鉴定为尖孢镰刀菌,构建的系统发育树见图 2。

	图 2 菌株Y3的rDNA-ITS序列同源性系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain Y3 based on rDNA-ITS sequences homology
图选项

通过致病性回接试验发现,病原菌Y3接种3周后草莓发病,植株中柱变红,并且能够从接种发病的草莓植株根部重新分离得到该病菌,符合柯赫氏法则,证明其是草莓根腐病的病原菌。

从图 3可以看出:菌株CT205对病原菌Y3有较强的抑制作用。病原菌Y3与拮抗菌CT205对峙培养后,在显微镜下观察到Y3菌丝体中的分隔增多,并出现明显扭曲及褶皱现象。

	图 3 白刺链霉菌CT205对Fusarium oxysporum Y3 的拮抗作用 Fig. 3 Antagonistic effect of Strepomyces albospinus CT205 on the growth of Fusarium oxysporum Y3
图选项

拮抗菌CT205在固体基础发酵培养基中发酵,接种3 d后,菌丝在基质中旺盛生长,瓶壁及基质布满白色的菌丝体,并散发出放线菌特有的“土腥味”,发酵6 d后,镜检发现大量的分生孢子,菌含量可达到2.2×10⁹ CFU · g^-1,之后略有波动,涨幅不大(图 4)。因此,确定固体发酵的终点时间为6 d,发酵结束后测定制剂的含水量为57%。S.albospinus CT205固体发酵制剂形态见图 5。

	图 4 S.albospinus CT205固体发酵过程中菌含量变化 Fig. 4 The change of cell number of S.albospinus CT205 during the solid fermentation
图选项

	图 5 S.albospinus CT205固体发酵制剂形态 Fig. 5 The change of cell number of S.albospinus CT205 during the solid fermentation
图选项

施用CT205固体发酵菌剂和CT205菌悬液处理与对照相比,茎叶鲜质量分别增加21.11%和12.21%,根鲜质量分别增加42.36%和32.76%,说明菌种CT205对草莓生长有一定的促生作用,且固体发酵菌剂的促生作用更明显。CT205固体发酵菌剂与CT205菌悬液处理中,草莓病情指数均明显下降,生防效果达到61.18%和55.22%(表 1)。

草莓根腐病主要症状是中柱发红,由内向外腐烂,后期植株全株萎焉枯死,是一种难以防治的根部毁灭性病害^[18]。笔者从草莓病株分离出多株病原真菌,经回接试验验证,1株致病性最强,编号为Y3,故选择Y3为研究材料。经形态观察和分子生物学鉴定,初步鉴定其为尖孢镰刀菌属。

放线菌具有适应环境能力强,在植物根表和根围土壤中有较强的定殖能力,能产生抗生素,分泌多种胞外水解酶,能产生丰富的分生孢子,且孢子存活时间长,有利于工业化生产及应用等优点,故研制放线菌生防制剂具有更重要的意义。拮抗菌CT205是本课题组前期筛选到的1株生防效果优良的放线菌,对多种植物病原真菌均有较强的抑制作用。张园园^[19]采用单因素试验确定了CT205固体发酵最合适的碳源、氮源以及无机盐组合,并在此基础上,运用L₁₆(4⁵)正交设计优化了固体发酵条件(如最佳接种量、料水比、起始pH、发酵温度和发酵终点等)。本研究采用其优化好的培养基配方及发酵条件,进行CT205固体发酵,发酵6 d,镜检发现大量的分生孢子,活菌计数菌含量达到2.2×10⁹ CFU · g^-1。

目前国内外用于草莓根腐病的生防菌有芽孢杆菌^[11]、木霉^{[20, 21]}、丛枝菌根(AM)真菌^{[22, 23]}等,亦有较多用放线菌制剂克服草莓连作障碍的报道^{[8, 24, 25]},但尚未有用白刺链霉菌防治草莓根腐病的研究报道,本试验将白刺链霉菌CT205作为生防菌,为草莓根腐病害生物防控提供新的生防材料。生防菌剂能够保护植物根系免受病原菌侵染,其作用机制包括产生特有的抗生素,抑制病原菌菌丝生长,与病原菌竞争生存空间与营养物质,同时活菌制剂接入土壤可调控根际微生物区系,减少病原菌的数量,提高土壤对土传病原真菌的抑制能力,进而促进作物根系生长,提高抗病能力。后续将对CT205的作用机制进行深入研究。本试验研究CT205对草莓根腐病的防病促生作用是在盆栽条件下进行,盆栽试验表明CT205制剂对草莓根腐病有较好的防控作用,但盆栽试验与大田试验存在一定差异,故其实际的生防效果仍需田间试验验证。