草地早熟禾(Poa pratensis L.)是一种多年生草本植物,其叶色诱人,绿期长,不仅观赏效果好,耐践踏,而且抗寒能力较强。因此,草地早熟禾被广泛用于公共绿地的绿化。然而,由子囊菌门病原菌(Magnaporthe poae)侵染草坪根际引起的夏季斑枯病是夏季高温高湿时发生在冷季型草坪草上的一种严重病害,在持续高温天气下(白天高温达28~35 ℃,夜温超过20 ℃),病情迅速发展,草坪多处呈现不规则形斑块,形成大面积的不规则枯草区,给草坪管理者及草坪生产企业带来严重的经济损失^[1]。

氯苯嘧啶醇(fenarimol)是一种重要和常用的广谱性杀菌剂,能抑制病菌菌丝的生长发育,使其不会侵染植物组织^{[2, 3]}。该杀菌剂喷施10~14 d对草坪夏季斑枯病斑枯病具有优越的预防和杀菌效果。近年来,使用化学杀菌剂对农田土壤真菌所造成的直接和/或间接影响已有研究报道^[4]。杀菌剂对土壤的污染是由于杀菌剂的直接施用或喷施农药时漂浮在大气中的杀菌剂随着灌溉水流入土壤造成的。尽管杀菌剂的施用可以有效地抑制植物病虫害的发生和发展,但是残留在土壤中的杀菌剂对于环境的影响越来越大^[5]。目前,对氯苯嘧啶醇的研究主要集中在早期的药效试验和毒性毒理试验以及残留分析方法方面,关于氯苯嘧啶醇施用后对土壤真菌的影响鲜有报道。

传统的土壤微生物研究方法主要依赖于平板稀释分离培养和基因克隆等技术手段,这些分析手段不仅耗时长,而且通量较低。随着分子生物学技术的发展,一系列不依赖于平板培养的土壤微生物研究方法得到广泛应用^{[6, 7]}。高通量测序技术(high-throughput sequencing)是近年来运用于土壤微生物研究的重要手段之一^{[8, 9, 10, 11]}。本试验使用Illumina公司的Genome Analyzer IIx测序仪对氯苯嘧啶醇喷施后的草地早熟禾致病菌及其根际土壤真菌的影响进行研究,旨在为进一步阐明该广谱性杀菌剂对草坪斑枯病病原菌及土壤真菌的影响提供理论依据。

本试验在Rutgers大学草坪试验田进行。草坪为夏季斑枯病致病菌(Magnaporthe poae)侵染的草地早熟禾试验田。草坪土壤为沙壤土,pH 6.5。草坪每周灌溉2次,硝酸钙施用量为39.8 kg · hm^-2。本试验设2个处理:对照和氯苯嘧啶醇喷施处理。对照为不施用任何杀菌剂的草坪土壤;氨苯嘧啶醇喷施处理为氯苯嘧啶醇喷施后的草地早熟禾根际土壤。每隔28 d喷施氯苯嘧啶醇,共喷施3次。样品采集于最后1次杀菌剂喷施后1 d,随机采集3份圆块状草坪(直径约为10 cm,土层厚度为0~20 cm)和土壤,土壤样品放入无菌袋中带回实验室,用刷子轻轻刷下靠近根周围的土壤后过2 mm筛,收集到的土壤为根际土壤,立即存放于-80 ℃冰箱,采用美国强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil^® DNA Isolation Kit)(深圳安必胜科技有限公司)进行DNA提取。

使用PCR扩增仪Thermocycler(BioRad,USA)对草坪根际土壤微生物的ITS基因进行扩增,引物为真菌ITS基因通用引物ITS5和ITS4^{[12, 13]}。ITS基因的PCR扩增体系为:1×PCR Buffer Ⅱ(Mg²⁺ Free)(Applied Biosystems,CA)2.5 μL,1.25 mmol · L^-1 dNTPs(ABI,USA)2 μL,10 μmol · L^-1引物各1 μL,2.5 mmol · L^-1 MgCl₂ 3 μL_,5 ng模板DNA 1 μL,AmpliTaq^®酶(ABI,USA)0.25 μL,ddH₂O补足至25 μL。PCR扩增程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,25个循环;72 ℃ 10 min。所有处理样品的60 ng PCR产物混合均匀后,采用Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit(Illumina公司,产品号:PE-400-1001)试剂盒构建土壤样品的ITS宏基因组文库。PCR扩增程序为:98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,25个循环;72 ℃ 5 min。PCR扩增产物用10 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳检测后经EB染色检查,纯化回收后委托Illumina公司进行测序。

将对照和氯苯嘧啶醇处理后的草坪根际土壤ITS宏基因文库所产生的双末端Illumina高通量测序初始片段采用Perl语言进行处理,移除长度少于75 bp、有难以辨识的字母“N”和含有2个以上难辨识的“B”字母的序列。在除去上述质量不合格的序列后,所有的假阳性序列通过软件UCHIME被进一步移除。最后,运用UCLUST软件对所有的序列进行分类,以NCBI网站真菌ITS序列数据库为参照进行Local Blast鉴定。所有序列用97%参数作聚类分析,分析后的序列采用MEGAN 4.0软件进行分类学分析^[14]。使用MEGAN 4.0宏基因组序列分析软件(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/)对2个处理产生的测序片段进行归类和组分分析。MEGAN4-MEtaGenome Analyzer软件分析参数设置为:Min Support=1,Min Score=100。

对照和氯苯嘧啶醇施用后的草坪根际土壤分别产生4 851 438和3 037 924条Illumina双末端测序序列(表 1),初始双末端片段长度为40~140 bp,平均长度约为100 bp。CLC软件对初始序列进行初步剪切处理后,对照和氯苯嘧啶醇施用后草坪根际土壤的Illumina测序有效序列分别为4 040 050和2 628 810条(表 1)。经过再次剪切和质量控制后,对照根际土壤中真菌有效测序序列长度从原来的100.9 bp变为96.4 bp,氯苯嘧啶醇喷施处理的真菌有效测序序列长度从原来的101.2 bp变为96.8 bp,剪切比例分别为13%和11%(表 1)。

MEGAN 4.0分析结果表明:对照和氯苯嘧啶醇处理后草坪根际土壤样品分别产生851 438和437 924个有效聚类。进一步用USEARCH 5.1软件(http://www.drive5.com/usearch/)程序中的命令(97%的相似性)“usearch-cluster input.fasta-uc results.uc-id 0.97”将序列分别归为28 219和21 288个代表分类操纵单元(operational taxonomic unit,OTU)。

由图 1可知:氯苯嘧啶醇喷施后,子囊菌门巨座壳科(Magnaporthaceae)中的5个真菌菌属Gaeumannomyces、Magnaporthe、Mycoleptodiscus、Phialophora和Pyricularia所占的比例发生了明显变化。顶囊壳属真菌(Gaeumannomyce)所包含的柱孢顶囊壳(Gaeumannomyces cylindrosporus)、禾瘟病菌(Gaeumannomyces graminis)和小麦全蚀菌(Gaeumannomyces incrustans)所占的比例亦有明显变化。氯苯嘧啶醇喷施后,柱孢顶囊壳(G.cylindrosporus)所占比例比对照减少了97%,禾瘟病菌(G.graminis)的比例增加了9%,小麦全蚀菌(G.incrustans)比例减少了78%。

	图 1 氯苯嘧啶醇施用后根际土壤中病原真菌的变化 Fig. 1 Fungi varation of control and fenarimol treated rhizosphere soil
图选项

氯苯嘧啶醇喷施后,与子囊菌门真菌Magnaporthe属中的亲缘关系较近的3个菌属M.grisea、M.oryzae和M.rhizophila所占比例均有明显变化。其中,由子囊菌门Magnaporthe属病原菌引起的稻瘟病菌M.rhizophila和M.oryza均减少了100%,M.grisea减少了16%。由于稻瘟病菌的ITS序列与夏季草坪斑枯病菌(M.poae)的ITS基因序列完全一致^[1],因此,氯苯嘧啶醇施用后根际土壤中急剧减少的M.rhizophila很可能是夏季草坪斑枯病病原菌M.poae。因为稻瘟病菌是引起小麦根部发病的一种病原菌,尚未有关于该病原菌在草坪根际有致病性的相关报道,该结果进一步证实了本研究中根际土壤中减少的真菌M.rhizophila为夏季草坪斑枯病致病菌M.poae。Phialophora属中有3个种在杀菌剂施用后根际土壤所占比例增长显著,与对照相比,P.mustea、Phialophora sp.kings_park_Tc01和Phialophora sp.N21分别增长了49%、97%和89%。

由表 2可知;对照和氯苯嘧啶醇施用后草坪根际土壤均有11个真菌门类。对照草坪根际土壤真菌组分为45个纲、143个目、406个科、1 192个属和2 831个种;而氯苯嘧啶醇施用后的草坪根际土壤真菌有47个纲、143个目、399个科、1 040个属和2 631个种。氯苯嘧啶醇施用后,根际土壤中的真菌在科的分类单位上减少7个,在属的水平上减少152个,在种的水平上减少200个。

2.4.1 门分类单元 由图 2可知:氯苯嘧啶醇施用对草地早熟禾根际土壤子囊菌门真菌(Ascomycota)和担子菌门真菌(Basidiomycota)的比例有显著影响。与对照相比,氯苯嘧啶醇施用后的根际土壤子囊菌门真菌的比例从53%减少到35%,而担子菌门真菌(Basidiomycota)比例从6%增加到38%。壶菌门类真菌(Chytridiomycota)和球囊菌门真菌(Glomeromycota)均占土壤根际真菌总比例的2%,且无显著变化。对照土壤中有34%的测序序列在NCBI数据库的ITS基因文库中没有归类,而氯苯嘧啶醇施用后的土壤中有19%的序列没有归类。

	图 2 对照和氯苯嘧啶醇施用后根际土壤中真菌的组分变化(门分类单位) Fig. 2 Pie chart of control and fenarimal treated fungi phylum in the rhizosphere soil
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使用MEGAN4-MEtaGenome Analyzer软件对ITS基因的宏基因组文库的Illumina测序结果进行进一步分析,结果表明在草地早熟禾根际土壤中有10个真菌属占主要部分,分别为疱霉属 (Phoma)、弯孢霉属(Curvularia)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、黑孢子菌属(Nigrospora)、镰刀菌属(Fusarium)、 被孢霉属(Mortierlla)、短梗蠕孢属(Trichocladium)、红酵母属(Rhodotorula)、红菇属(Russula)和瓶霉属(Phialophora)真菌。氯苯嘧啶醇施用后疱霉属(Phoma)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、镰刀菌属(Fusarium)和瓶霉属(Phialophora)真菌所占比例均有所下降,而弯孢霉属(Curvularia)、黑孢子菌属(Nigrospora)、被孢霉属(Mortierlla)、短梗蠕孢属(Trichocladium)和红酵母属(Rhodotorula)真菌所占比例却有不同程度的增长(图 3)。

	图 3 对照和氯苯嘧啶醇施用后根际土壤的优势真菌 Fig. 3 The dominant genus of control and fenarimal treated rhizosphere soil
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近些年来,关于化学杀菌剂对土壤健康及土壤微生物的影响受到越来越多的关注^{[4, 8]}。化学药剂的施用对土壤微生物的影响是土壤可持续发展与否的重要条件之一。本研究中,在Illumia高通量测序技术测序深度一致的条件下,杀菌剂氯苯嘧啶醇的施用不仅对草地早熟禾根际土壤中夏季草坪斑枯病病原真菌有抑制作用,而且对根际土壤中子囊菌门真菌亦有较强的抑制作用。

氯苯嘧啶醇在土壤中的吸附转化与土壤类型有关,而且氯苯嘧啶醇在土壤、动植物体内和环境水体中的降解主要以光化学降解为主,而其水解和微生物降解则相对困难。土壤中的微生物是一个动态平衡的过程,本研究中氯苯嘧啶醇施用后子囊菌门所占比例的减少很可能是由于氯苯嘧啶醇的施用有效地阻滞了子囊菌门真菌麦角甾体分子中麦角甾醇的脱甲基化过程,从而使子囊菌门真菌相关的生物合成及代谢途径受阻,最终导致子囊菌门真菌受到抑制,而担子菌门真菌所占比例相应提高。

本研究结果表明,草地早熟禾根际土壤中有10种优势真菌,氯苯嘧啶醇施用前后根际土壤真菌在门、纲、目的真菌分类单元上并无显著差别,只在科、属、种的分类水平上分别减少7、152和200个真菌种类。其中,氯苯嘧啶醇施用后疱霉属(Phoma)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、镰刀菌属(Fusarium)和瓶霉属 (Phialophora)真菌均比例有所下降,而弯孢霉属(Curvularia)、黑孢子菌属(Nigrospora)、被孢霉属(Mortierlla)、 短梗蠕孢属(Trichocladium)和红酵母属(Rhodotorula)真菌比例有不同程度的增长。这一结果很可能与微生物对环境的适应性、土壤微生物动态平衡和氯苯嘧啶醇在土壤环境中的光催化降解速度以及环境毒理学特性有关^{[3, 4]}。

本试验首次建立了真菌ITS基因的Illumina高通量测序片段分析步骤和流程,旨在为研究者使用该技术研究土壤真菌群落多样性提供初步的参考依据。虽然Illumina高通量测序方法给研究者提供了大量的测序信息,但是如何着手分析这些庞大的数据信息至今为止鲜有相关报道。本研究中Illumian高通量测序技术及其结果分析步骤的建立不仅为今后研究土壤微生物提供更全面、更深入、更准确的信息,还将为微生物研究者探究土壤环境微生物多样性开启新的大门^{[15, 16, 17]}。