大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae,PGS)侵染大豆植株引起大豆茎褐腐病。该病害于1942年首次在美国的伊利诺斯州被发现,后在北美和加拿大大豆种植地区多次被报道,让美国大豆生产蒙受了巨大的损失,产量损失可达30%,最高达66%^[1]。PGS被列为欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)A1类检疫性有害生物^[2],也是我国植物检疫性有害真菌之一。目前,PGS主要发生地在巴西、美国中西部和东南部各州、加拿大、阿根廷、埃及、墨西哥、前南斯拉夫、日本等地,其中在美国和加拿大中北部地区发生尤为严重,对当地的大豆生产造成了极大威胁^{[3, 4]}。PGS的危害症状主要是大豆茎部的维管束和髓部变成褐色,随着病菌进一步扩展,发病茎部变成褐色,并在大豆生长后期引起叶片部分变色,叶脉坏死和斑点,但是也有些不发生明显褐变症状,从而使病害诊断变得很困难^[1]。根据危害症状PGS分为落叶型(A型)和非落叶型(B型),发病初期的症状易与镰孢菌引起的大豆猝死综合症的症状混淆^{[5, 6, 7]}。PGS是一种土传维管束类病害,大豆出苗阶段可侵染大豆根系,而在病残体中的分生孢子是主要的初侵染源。PGS可存活于大豆残体及土壤中3至5年^{[8, 9]},近年来随着大豆贸易的持续增加,使PGS通过贸易传入我国的风险大大增加。随着核酸相关的鉴定方法不断发展,基于PCR的方法已经成功用于检测大豆茎褐腐,虽然PCR法在特异性和敏感性上有所提高,但是检测时间耗费长,需要4~5 h,同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪^[10],其检测灵敏度一般,但是检测过程繁杂,不能满足快速检测的需求。因此目前急需一种可以快速、准确检测PGS的方法。

Notomi等^[11]于2000年开发了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。该技术已经被广泛应用于生命科学等相关领域,随着LAMP的优点逐渐为研究者所熟知,研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时,也对该技术提出了很多的改进,使得该技术逐步完善,能够成功地应用于病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体、寄生虫、肿瘤等的检测。在植物病原菌检测的应用上,已经报道的有苜蓿疫霉根腐病菌、马铃薯环腐病菌、柑橘溃疡病菌、橡树疫霉病菌等相关LAMP检测方法^[11]。

本文以ITS为靶标设计特异性引物检测PGS,应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)^[12]判定反应结果,建立了PGS的快速分子检测技术体系。

大豆茎褐腐病菌2株,常见大豆病害菌株9株,共11株。其中大豆茎褐腐病菌PGS A+(落叶型)和PGS B+(非落叶型)由江苏出入境检验检疫局提供,常见大豆病害菌株9株由南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室提供。 10×ThermoPol Buffer、Bst DNA polymerase(8 U · μL^-1)购自New England Biolabs公司;甜菜碱、MgSO₄、羟基萘酚蓝(HNB)和Proteinase K购自Sigma公司;Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司;dNTP、DL100 Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司;DNAsecure Plant Kit购自QIAGEN公司,引物由上海Invitrogen公司合成。

根据ITS序列,应用Bioedit软件进行序列比对分析后,使用PrimerExplore V4软件,参照LAMP引物设计原则,对软件自动设计并提供的28套引物进行逐一筛选,比较每对引物特异性和灵敏度,从中筛选出了1套特异性好、灵敏度高的LAMP引物(表 1)。引物由Invitrogen公司合成,用ddH₂O溶解后分装,保存于4 ℃冰箱中备用。

取PDA液体培养基液培菌丝,滤纸吸干水分后,液氮充分研磨,加700 μL 2% CTAB提取液,漩涡混匀,于60 ℃水浴30 min,中间每10 min上下颠倒几次混匀。加入700~800 μL CIA(氯仿与异戊醇的体积比为24:1),在震荡摇床上室温160 r · min^-1摇30~40 min后,13 000 r · min^-1离心5 min,取上清液加等体积 氯仿,颠倒混匀后静置10 min,13 000 r · min^-1离心5 min;将上清液转移至新管,加等体积CIA,13 000 r · min^-1离心5 min。上清液转移至新管中,加入2倍体积的无水乙醇,-20 ℃静置(时间大于1 h)。13 000 r · min^-1 离心5 min,倾去上清液,沉淀用70%(体积分数)乙醇洗涤2次,室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20 μg · mL^-1 RNase),37 ℃处理1 h后-20 ℃保存。测定浓度时,取5 μL样品加水到1 mL,用1 mL水做空白对照,把样品杯放在分光光度计比色槽上,每μL中DNA浓度即为样品在260 nm处D值的10倍。

反应体系为27 μL:2.5 μL 10×ThermoPol Buffer,8 mmol · L^-1 MgSO₄,1.4 mmol · L^-1 dNTPs,内引物FIP 和BIP各1.6 μmol · L^-1,外引物F3和B3各0.2 μmol · L^-1,环引物LB和LF 0.8 μmol · L^-1,甜菜碱0.8 mol · L^-1,Bst DNA聚合酶8 U · μL^-1,HNB 192 μmol · L^-1,2 μL模板DNA,灭菌水补至27 μL。64 ℃水浴锅中恒温反应60 min,反应结束后根据颜色变化观察结果。每个试验至少重复3次。

LAMP反应结束后,通过肉眼观察指示剂颜色变化判定扩增结果。在反应前向体系中加入HNB指示剂,反应后直接观察溶液颜色变化,阳性为天蓝色,阴性为紫色。

供试的2株大豆茎褐腐病菌菌株,参试的其他大豆常见真菌包括立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、链格孢(Alternaria nees)、平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、油瓶霉(Legionella anisa),室温液培7 d后分别提取各菌株基因组DNA进行LAMP扩增,反应结束后观察LAMP反应的特异性结果。

大豆茎褐腐病菌的基因组DNA模板经测定浓度后,依次进行10倍稀释,使得质量浓度梯度依次为 100 ng · μL^-1、10 ng · μL^-1、1 ng · μL^-1、100 pg · μL^-1、10 pg · μL^-1、1 pg · μL^-1、100 fg · μL^-1、10 fg · μL^-1、1 fg · μL^-1。 分别取2.0 μL作为LAMP反应模板,每个梯度设置3个重复。反应结束后观察结果,确定LAMP的灵敏度。

供接种的大豆品种为‘合丰35’,分别取6~8颗播种于直径15 cm盆中。播种后放置于温室中,大豆出苗后2周左右,在茎基部位进行创伤接种。用灭菌手术刀,切取1 cm²大小的PGS菌丝块贴于茎基部伤口上,用灭菌脱脂棉敷于接种点上,持续保湿。每盆设3个重复,同时设置空白PDA平板接种作为对照,接种4周后,取发病组织液氮研磨提取DNA,用于LAMP检测。

进口大豆样本6份和进口大豆中夹带的大豆植株残体样本3份,共计9份(表 2)。

大豆残渣样本在盘子内摇晃混匀后5点取样。分别取9份大豆残体样本各10 g,倒入250 mL干净三角瓶中,加入无菌水至200 mL,滴入20%(体积分数)吐温3~5滴,封住瓶口,置于摇床上200~250 r · min^-1洗涤20 min。洗涤后用200目钢筛将混合液过滤到干净的烧杯中;用少量纯水反复冲洗钢筛上的大豆残体,滤液集中到烧杯中。把收集到的滤液分装到50 mL离心管中,6 500 r · min^-1离心5 min,弃上清液,收集沉淀。将沉淀置于37 ℃恒温箱中烘干。由于沉淀物中含有大量土壤成分,所以采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒(PowerSoil^ DNA Isolation Kit)进行提取,方法稍加改进:取烘干的沉淀物0.25 g加入到含有振荡珠的管中,加入60 μL C1,漩涡震荡10 min;室温10 000 g离心30 s。取上清液400~500 μL转移到2 mL收集管中,向管中加入250 μL C2,涡旋振荡5 s,置于4 ℃ 5 min;室温10 000 g离心1 min。将600 μL上清液转移到新的2 mL收集管中,加入200 μL C3,涡旋振荡5 s后,置于4 ℃ 5 min;室温10 000 g离心1 min。取上清液750 μL转移到新的2 mL收集管中;向其加入1.2 mL C4,涡旋振荡5 s。将上清液和C4的混合液每次675 μL转移到离心过滤管,10 000 g离心1 min;向其加入500 μL C5,室温 10 000 g离心30 s。倒掉滤液后,将离心过滤管放回到2 mL收集管中,10 000 g离心1 min,离心后开口置于室内1 min使管中液体充分挥发。将离心过滤管转移到新的2 mL收集管中,加入100 μL C6,溶解2 min后离心。丢弃离心过滤管,向每管中加入4 μL 5 mol · L^-1的NaCl,涡旋振荡30 s;向其中加入200 μL无水乙醇,涡旋振荡30 s;10 000 g离心5 min,弃上清液,将2 mL收集管置于37 ℃恒温箱,晾干其中水分后向收集管中加入60 μL去离子水,所提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存,供LAMP检测。

为明确本文研发的LAMP检测技术在大豆植株残体样本携带多少PGS分生孢子时可检测出该病菌,作者根据1.9节的检测结果,选择未携带PGS的大豆植株残体为基质,分别在每10 g大豆植株残体中人为添加10 000、1 000、100、50、10、0个PGS分生孢子,按照1.9.2节的方法收集PGS分生孢子,提取DNA,备用。

取不含有PGS的大豆植株残体样本作为供试样本。每份样本取10 g,倒入250 mL干净三角瓶中,加入无菌水至200 mL,滴入20%吐温3~5滴。将不同浓度梯度的PGS孢子液依次加入,每个梯度设置3个重复。封住瓶口,置于摇床上200~250 r · min^-1洗涤20 min。以不加入PGS的大豆植株残体样本为阴性对照,按1.9.2节的方法提取各样本DNA。

以本研究设计的特异性引物对PGS进行LAMP扩增,以水作为阴性对照,并用其他一些大豆上常见真菌基因组作为对照以检测LAMP反应的特异性。结果如图 1所示,PGS反应管均呈天蓝色,为阳性结果,其他大豆上常见真菌和阴性对照反应管均呈紫色,为阴性结果。表明:本文所筛选的引物对PGS具有特异性。

图 1 LAMP反应的特异性试验 Fig. 1 Specificity of LAMP detection 1~4.PGS(落叶型)分别为240、90、180和120 ng · μL-1;5.立枯丝核菌;6.大豆紫斑病菌;7.胶胞炭疽菌;8.禾谷镰孢菌;9.大豆炭腐病菌;10.米曲霉;11.链格孢;12.平头炭疽菌;13.油瓶霉;14,15.水(阴性对照) 1-4.Phialophora gregata f.sp.sojae(Deciduous type)respectively 240,90,180,and 120 ng · μL-1;5.Rhizoctonia solani;6.Cercospora kikuchii;7.Colletotrichum gloeosporioides;8.Fusarium graminearum;9.Macrophomina phaseolina;10.Aspergillus oryzae;11.Alternaria nees;12.Colletotrichum truncatum;13.Legionella anisa;14,15.Water(Negative control)

图选项

将10倍梯度稀释的大豆茎褐腐病菌基因组DNA进行LAMP扩增,图 2结果显示:最低检测灵敏度为10 pg · μL^-1。

	图 2 LAMP反应的灵敏度试验 Fig. 2 Sensitivity of ITS-LAMP method using serially diluted genomic DNA from Phialophora gregata f.sp.sojae as template 1:240 ng · μL-1;2:100 ng · μL-1;3:10 ng · μL-1;4:1 ng · μL-1;5:100 pg · μL-1;6:10 pg · μL-1;7:1 pg · μL-1;8:100 fg · μL-1;9:10 fg · μL-1;10:1 fg · μL-1;11:水(阴性对照)Water(Negative control)
图选项

对接种发病的大豆病茎组织及空白PDA接种的大豆茎杆提取DNA,用PGS的LAMP特异性引物进行扩增。结果(图 3)显示:接种大豆茎褐腐病菌后发病的大豆茎组织提取的DNA反应管均呈天蓝色,为阳性结果;而空白接种PDA及未接种的健康大豆茎组织的对照反应管均呈紫色,为阴性结果。表明:此套LAMP检测引物可以从感染PGS并发病的病组织中检测出PGS,该技术可用于PGS的田间病害诊断。

	图 3 LAMP法检测人工接种大豆发病组织 Fig. 3 Detection of inoculated diseased soybean stem tissue by LAMP assay 1.阳性对照;2.健康大豆茎杆;3.接种PDA培养基未发病的大豆茎杆;4~9.接种PGS发病的大豆茎杆;10.阴性对照 1.Positive control;2.Healthy soybean stem tissue;3.Soybean of inoculate PDA;4-9.Diseased soybean stem tissue of inoculate by Phialophora gregata f.sp.sojae;10.Negative control
图选项

对1.9.1节各样本提取的DNA进行PGS的LAMP检测,结果(图 4)显示:9份样本中检测出一份携带有PGS(图示编号8,检疫局编号:201303755,产地:阿根廷)。阳性对照以及8号大豆样本提取的DNA反应管均呈天蓝色,为阳性结果;而阴性对照以及其他大豆残体样本提取的DNA反应管均呈紫色,为阴性结果。表明:本文研发的PGS-LAMP检测技术体系可望用于口岸进口大豆中PGS的检测。

	图 4 LAMP法检测进口大豆及夹带的大豆植株残体样本 Fig. 4 Detection of imported soybeans and soybean plant residues by LAMP assay 1,2.阳性对照;3~8.大豆样本;9~11.大豆植株残体样本;12.阴性对照 1,2.Positive control;3-8.Samples of soybeans;9-11.Samples of soybean plant residues;12.Negative control
图选项

在已确定不携带PGS的进口大豆夹带的大豆植株残体(主要为豆荚)中人工添加不同浓度梯度的孢子液,并对1.10.2节中提取的样本DNA进行LAMP检测。结果(图 5)显示:每10 g大豆植株残体样本分别添加孢子量为10 000、1 000、100、50个时,提取的DNA样本经LAMP扩增均呈天蓝色,为阳性结果;而阴性对照以及每10 g大豆样本分别添加孢子量为10、0个时反应管均呈紫色,为阴性结果。表明:该技术对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为每10 g大豆残体50个孢子。

	图 5 LAMP法检测人工添加不同数量PGS分生孢子的大豆病残体 Fig. 5 Detection of soybean residues with different amount of conidia of Phialophora gregata f.sp.sojae 图中数字分别表示人工添加分生孢子数量。The number of figures in the picture indicates the number of aritificially added spores.
图选项

PGS被列为欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)A1类检疫性有害生物^[2],也是我国植物检疫性有害真菌之一。迄今PGS在我国未见有发生的报道,随着我国大豆贸易近年来的持续增加,PGS通过贸易传入我国的风险大大增加,所以需要一种可以快速、准确检测PGS的方法。目前基于PCR的方法已经成功用于口岸检测大豆茎褐腐病,但普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散,这是实验室污染的一个主要来源;而且溴化乙锭(EB)有巨毒,可累积致癌,对人体产生巨大危害;长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。本文首次报道应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测PGS,相对于普通的PCR方法,具有以下优势:1)在等温条件下(64 ℃)就能进行扩增反应,同时反应时间短,仅需1 h左右;2)不需要昂贵的热循环仪器,普通水浴锅或者保温瓶即可进行LAMP反应,检测费用低;3)特异性较好,4条内外引物与靶序列的6个结合区完全匹配的情况下才可以进行LAMP扩增反应;4)检测结果可用肉眼观察显色剂变化进行判定^[10]。

本文主要是通过在反应前向体系中加入HNB指示剂,反应后直接观察溶液颜色变化判断反应结果(阳性为天蓝色,阴性为紫色)。目前为止,LAMP研究常用于可视化体系的染料主要有溴化乙锭(EB)、SYBR GreenⅠ、钙黄绿素和金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)等,其中SYBR GreenⅠ和HNB的检测灵敏性均较高,是钙黄绿素的10倍^[12]。但染料SYBR GreenⅠ在LAMP反应结束后加入,反应后必须开盖,开盖后产物形成的气溶胶会增加LAMP扩增产物污染风险。本文研究中的LAMP检测选用HNB染料,反应结束后即可观察结果,无需开盖,极大减少污染,且颜色区分明显,易于观察、判定结果。

由于PGS未测序,基因组序列信息较少,相关报道少,靶标选择难。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(internal transcribed space,ITS),它首先由Gonzalea在1990年提出^[13],后逐步发展起来成为全新的分子标记,其优点在于:具有高拷贝数;同时包含保守与变异序列;能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的ITS总的说来是相对保守的,但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较,而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵敏。作者通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),下载PGS的ITS相关序列信息,经过比对,选择差异较大的一段,参照引物设计原则,软件自动设计并提供28套引物用于筛选,最终获得一套用于检测PGS的特异性强、灵敏度高的LAMP引物。在LAMP检测特异性试验中,PGS反应管均呈天蓝色,为阳性结果,其他大豆上常见真菌和阴性对照反应管均呈紫色,为阴性结果,表明PGS引物可以特异地检测出PGS。在LAMP检测灵敏度试验中,结果显示最低检测灵敏度为10 pg · μL^-1,在大豆植株残体中PGS的检测灵敏度达到每10 g大豆残体50个孢子。

在口岸实际检疫中,进口大豆材料中除大豆以外还含有许多土壤微生物、豆荚、豆杆、碎叶片、土块等组分。要对进口大豆样本进行LAMP检测是否含有PGS,必须要了解检测结果是否会受到这些因素的影响。本试验在不含有PGS的进口大豆残体中人为加入目标病菌分生孢子来研究其检测灵敏度,目的在于验证所研发的LAMP检测技术是否能从中检测出PGS,并测定在该检测条件下的检测灵敏度,以确定该技术应用于我国口岸对PGS的快速检测的可行性。

本文研发的PGS-LAMP检测体系在64 ℃恒温条件下,能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到PGS,不需要复杂昂贵的仪器,能较好满足对PGS的检测,为检疫性病菌PGS的检测提供了新的技术平台,可以满足目前对PGS的快速检测的迫切需要。