文章信息
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- MA Yuehua, GUO Shirong, DU Nanshan, SHAN Xi, SUN Jin, WANG Lei, WANG Ying, SHU Sheng. 2015.
- 外源24-表油菜素内酯对低氧胁迫下黄瓜幼苗氮代谢的影响
- Effect of exogenous 24-epibrassinolide on nitrogen assimilation of cucumber seedlings under hypoxia stress
- 南京农业大学学报, 38(4): 538-545
- Journal of Nanjing Agricultural University, 38(4): 538-545.
- http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.04.003
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文章历史
- 收稿日期：2014-10-08
2. 南京农业大学(宿迁)设施园艺研究院, 江苏 宿迁 223800
2. Facility Horticulture Institute, Nanjing Agricultural University, Suqian 223800, China
氮是植物最重要的必需元素之一,是活细胞赖以生存的蛋白质、核酸、磷脂、叶绿素等有机大分子的重要构成组分。氮营养和氮代谢可作为信号影响植物生物学的众多方面[1],植物根据环境变化调控其氮代谢[2]。
气候变化所导致的强降雨形成的洪涝灾害日益频繁,在或短或长的淹水期间,植物由于水中极低的氧气扩散速率而遭受低氧胁迫[3]。无土栽培生产实践中,深液流水培和漂浮深水培的植物在夏季高温季节根系容易发生缺氧腐烂的现象;基质栽培中有机基质比例过高,一段时间后会逐步腐烂,透气性逐渐下降;此外基质栽培时植株根垫的形成也会使植株根系供氧不足,极易形成低氧逆境[4]。尤其是根际温度较高时,根系耗氧量增大,形成明显的根际低氧逆境,影响作物正常的生长发育,而引发多种生育障碍,最终直接造成栽培效益的下降,成为无土栽培技术大规模应用于设施生产的限制性因子[5]。低氧胁迫往往造成糖酵解及三羧酸循环的代谢过程变缓甚至停滞,导致还原型辅酶Ⅰ(NADH)向氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的再生受到抑制进而阻止ATP的产生[6]。研究发现:植物通过增加硝态氮的吸收和硝酸还原酶(NR)活性适应低氧,还原NO-3的过程能够消耗NADH及H+,从而减轻细胞过度还原及胞质酸化的程度[7]。向水稻和小麦的生长介质中添加氨基酸混合物有益于小麦根系耐受低氧胁迫[8];铵态氮处理的苗期玉米NR和谷氨酰胺合成酶(GS)活性对涝渍胁迫的适应能力相对高于硝态氮及硝铵混合处理[9],表明氮同化可能与植物低氧耐性有关。油菜素内酯(BR)能诱导植物对多种非生物胁迫的耐性,例如干旱、盐害、高温、低温胁迫[10]和弱光[11],通过调控氮代谢及代谢物缓解盐胁迫对植株的伤害[12],但就其对低氧胁迫下植物氮代谢的影响了解较少。本文旨在通过研究低氧胁迫下黄瓜幼苗与氮代谢有关的生理生化变化,揭示外源油菜素内酯提高黄瓜幼苗低氧耐性的机制,为应用油菜素内酯提高黄瓜低氧耐性提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料培养与处理试验在南京农业大学温室内进行,以黄瓜(Cucumis sativus L.)品种‘中农6号’(中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供)为材料。选取整齐饱满的种子进行浸种、催芽,将出芽一致的种子播于装有石英砂的塑料盘中。育苗期间,温室保持昼/夜温度(25~27)℃/(15~18)℃,子叶展平后每天浇灌1次1/4 Hoagland营养液。2叶1心时,选取整齐一致的幼苗定植于装有1/2 Hoagland营养液[pH(6.3±0.1)]的水培箱中继续培育,营养液中硝态氮质量浓度为434.2 mg · L-1,铵态氮质量浓度为9 mg · L-1。
当幼苗长至3叶1心时进行处理,设4个处理:1)对照(CK),用气泵正常通入空气,维持营养液溶氧质量浓度(DO)为8.0 mg · L-1左右;2)低氧处理(H),向营养液通入氮气,用溶氧浓度调节仪(QUANTUM,美国)控制营养液DO值为0.9~1.1 mg · L-1;3)对照+EBR(CK+EBR),通入空气的营养液中添加24-表油菜素内酯(EBR)(Sigma-Aldrich,美国),使其终质量浓度达到1×10-3 mg · L-1;4)低氧+EBR(H+EBR),水培箱中通入氮气维持低氧的同时添加EBR,使其终质量浓度为1×10-3 mg · L-1。于处理3、5、7和9 d取样测定相关指标。每个处理3次重复。
1.2 测定方法 1.2.1 叶片氮含量将烘至恒质量的叶片粉碎后称取0.5 g,消煮后采用凯氏定氮仪(FOSS,丹麦)测定氮含量,以100 g干样中所含的氮含量(g)表示叶片的总氮含量。
1.2.2 硝态氮和铵态氮含量参照文献[13]的方法进行测定。硝态氮含量测定410 nm波长下的光密度,以KNO3绘制标准曲线。铵态氮含量测定580 nm波长的吸光值,以丙氨酸绘制标准曲线。
1.2.3 氮代谢相关酶活性硝酸还原酶(NR):参照Glaab等[14]方法略作修改。取子叶上第4片叶及植株根系用流水冲洗干净,擦干后分别剪碎、混匀,准确称取0.3 g根和0.5 g叶,在冰浴中加少量石英砂和提取液研磨为匀浆,4 ℃、15 000 g离心15 min,上清液即为粗酶提取液。取0.4 mL粗酶提取液,加入0.5 mL反应液[100 mmol · L-1羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)-KOH(pH 7.5),内含5 mmol · L-1 KNO3、5 mmol · L-1 EDTA、0.25 mmol · L-1 NADH],混匀,30 ℃下静置30 min,对照的反应液中不含NADH。保温结束加入0.1 mL 0.6 mol · L-1醋酸锌(ZnAc)终止反应,静置15 min。加入500 μL 58 mmol · L-1磺胺(溶于3 mol · L-1 HCl)和500 μL 0.77 mmol · L-1盐酸萘乙二胺(NED)显色30 min,14 000 g离心5 min。取上清液测定540 nm波长的吸光值。
亚硝酸还原酶(NiR):酶提取按NR测定方法进行。酶活性测定参考Glaab等[14]方法并略作修改。取0.3 mL粗酶提取液,加入0.5 mL反应液[100 mmol · L-1 HEPES-KOH(pH7.5),内含5 mmol · L-1 KNO2、78 μmol · L-1甲基紫精],混匀,加入100 μL 0.2 mol · L-1 Na2S2O4(溶于0.2 mol · L-1 NaHCO3)启动反应,30 ℃下静置30 min。保温结束后加入0.1 mL 0.6 mol · L-1 ZnAc终止反应,静置15 min后加入500 μL 58 mmol · L-1磺胺(溶于3 mol · L-1 HCl)和500 μL 0.77 mmol · L-1 NED显色30 min,14 000 g离心5 min。取上清液测定540 nm波长的吸光值。
谷氨酰胺合成酶(GS):采用Lin等[15]的方法进行,以反应混合液每小时形成的γ-谷氨酰羟肟酸的吸光值表示1个酶活性单位。谷氨酸合成酶(GOGAT):采用Lin等[15]的方法进行,以反应混合液每分钟减少1 μmol NADH为1个酶活性单位。谷氨酸脱氢酶(GDH):参照邱旭华[16]的方法进行,以每分钟反应混合液变化1 μmol NADH为1个酶活性单位。
以上酶液中的蛋白含量按照Bradford[17]的方法测定,以牛血清蛋白为标准曲线。
1.3 数据分析利用SPSS PASW Statistics 17.0对数据进行统计分析,采用Duncan′s法进行差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 24-表油菜素内酯(EBR)对低氧胁迫下黄瓜植株体内氮含量的影响 2.1.1 叶片总氮含量
由图 1可见:低氧处理9 d显著降低了黄瓜幼苗叶片的总氮含量,与通气对照相比减少了近一半。与单纯低氧胁迫处理相比,营养液添加EBR使叶片氮积累恢复至对照水平;通气条件下添加EBR也促进了叶片的氮积累。
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图 1 24-表油菜素内酯(EBR)对低氧胁迫下黄瓜幼苗叶片总氮含量的影响 Fig. 1 Effect of 24-epibrassinolide(EBR)on total N content of cucumber leaves under hypoxia stress
1)CK:对照Control;H:低氧胁迫处理Hypoxia stress treatment;CK+EBR:对照+EBR处理Control+EBR treatment;H+EBR:低氧胁迫+EBR处理Hypoxia stress+EBR treatment 2)不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different small letters mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same as follows. |
由图 2可以看出:低氧胁迫显著提高了黄瓜幼苗叶片硝态氮含量,且在整个处理期间均维持较高水平;添加EBR对低氧胁迫下幼苗叶片的硝态氮含量无明显影响。低氧处理3 d时,胁迫植株根系硝态氮含量显著提高,但到处理7 d时降至对照水平,至处理9 d时根系硝态氮水平则显著低于通气对照。营养液添加EBR使低氧处理3 d的幼苗根系硝态氮恢复至通气对照水平,但处理7 d时添加EBR的胁迫植株根系硝态氮水平较单纯低氧植株显著升高,随着处理时间延长EBR的这种促进作用消失。
 | 图 2 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗硝态氮含量的影响 Fig. 2 Effect of EBR on NO3--N content of cucumber seedlings under hypoxia stress |
由图 3可见:低氧胁迫显著抑制了黄瓜幼苗叶片铵态氮的积累,营养液添加EBR对低氧胁迫下叶片铵态氮的积累没有影响。根系铵态氮水平在低氧处理早期与通气对照相比无明显变化,至处理7 d后低氧胁迫幼苗根系铵态氮积累急剧增加;与单纯低氧胁迫处理植株相比,营养液添加EBR对处理前期的根系铵态氮积累有促进效果,但二者未达显著水平,随着处理时间延长,EBR显著促进了低氧胁迫下植株根系的铵态氮积累。
 | 图 3 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗铵态氮含量的影响 Fig. 3 Effect of EBR on NH4+-N content of cucumber seedlings under hypoxia stress | |
由图 4可见:低氧胁迫下黄瓜幼苗叶片NR活性受到显著抑制,随着胁迫时间延长,低氧抑制NR活性的程度也加大,处理7 d时NR活性较通气对照显著下降,到低氧处理9 d时叶片NR活性较前期有所恢复,但仍显著低于通气对照。添加EBR对低氧胁迫下幼苗叶片的NR活性无明显影响。低氧处理显著促进了黄瓜幼苗根系的NR活性,处理5 d时,NR活性较通气对照提高了58%,到7 d时酶活性较对照增加了1.85倍,处理9 d时根系NR酶活性降至对照水平。与单纯低氧胁迫处理相比,营养液添加EBR显著促进了胁迫5和9 d时黄瓜幼苗根系的NR活性。
 | 图 4 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗硝酸还原酶(NR)活性的影响 Fig. 4 Effect of EBR on nitrate reductase(NR)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | ||
由图 5可见:低氧胁迫明显促进了黄瓜幼苗叶片亚硝酸还原酶活性的提高,增加幅度在低氧处理7 d时达到最大,但到9 d时酶活性又恢复至对照水平。与单纯低氧胁迫处理相比,营养液添加EBR进一步提高了低氧胁迫叶片的NiR活性,且在整个处理期间均显著高于单纯低氧处理植株。低氧下NiR活性变化趋势与叶片相同,但营养液添加EBR对根系的酶活性无明显促进作用。
 | 图 5 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗亚硝酸还原酶(NiR)活性的影响 Fig. 5 Effect of EBR on nitrate reductase(NiR)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | |||
由图 6可以看出:低氧也促进了黄瓜幼苗叶片GS活性的增加,在整个处理过程中叶片GS活性均显著高于通气对照;营养液添加EBR对低氧下叶片GS活性具有促进作用,但与单纯低氧胁迫处理相比未达显著差异水平。根系GS活性在低氧处理前期与通气对照相比无明显变化,至7 d时GS活性显著高于通气对照根系,但处理9 d时又恢复至对照水平。营养液添加EBR对低氧处理幼苗根系GS活性无明显影响。
 | 图 6 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响 Fig. 6 Effect of EBR on glutamine synthetase(GS)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | ||||
由图 7可以看出:低氧胁迫显著提高了黄瓜幼苗叶片GOGAT活性,处理5 d时叶片酶活性较通气对照增加了1.08倍,其后恢复至对照水平;添加EBR对低氧胁迫植株叶片的GOGAT活性无显著影响。根系GOGAT活性在低氧胁迫处理前7 d无明显变化,至9 d时酶活性显著低于通气对照,营养液添加EBR使根系GOGAT活性恢复至对照水平。
 | 图 7 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影响 Fig. 7 Effect of EBR on glutamate synthase(GOGAT)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | |||||
由图 8可见:低氧胁迫显著促进了低氧胁迫下黄瓜幼苗叶片的氧化型GDH(NAD+-GDH)活性,其中5 d时酶活性较通气对照增加了1.27倍,增幅最大;添加EBR进一步促进了低氧胁迫下幼苗叶片的NAD+-GDH活性的提高,且处理9 d时其促进效果达显著差异水平。根系NAD+-GDH活性则在整个低氧胁迫处理过程中无明显变化,营养液添加EBR对NAD+-GDH活性无影响。
 | 图 8 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗氧化型谷氨酸脱氢酶(NAD+-GDH)活性的影响 Fig. 8 Effect of EBR on oxidized glutamate dehydrogenase(NAD+-GDH)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | ||||||
由图 9可见:低氧胁迫增强了黄瓜幼苗叶片和根系还原型GDH(NADH-GDH)活性,其中叶片酶活性在整个处理过程中均显著高于通气对照,处理7 d时较对照提高了1.25倍。根系NADH-GDH在低氧处理前期无明显变化,处理7 d时根系酶活性显著高于通气对照,但增加幅度远小于叶片,只较通气对照增加了18%,处理9 d时根系NADH-GDH活性恢复至对照水平。营养液添加EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗叶片和根系NADH-GDH活性均无明显作用。
 | 图 9 EBR对低氧胁迫下黄瓜幼苗还原型谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)活性的影响 Fig. 9 Effect of EBR on reduced glutamate dehydrogenase(NADH-GDH)activity of cucumber seedlings under hypoxia stress | |||||||
自然界中,无机氮化物是植物主要的氮源,植物通过特定的转运蛋白以主动运输的方式吸收无机氮进入根毛的表皮细胞中。本试验中,由于低氧胁迫显著抑制了叶片的NR活性,导致植株吸收的NO-3不能被转化而在叶片中积累。NR是硝酸还原过程的限速酶,因此,尽管叶片NiR活性受到低氧促进,但仍未改变叶片的硝酸还原受到抑制的现实。根系的硝态氮含量先升高后下降,说明在低氧处理早期,根系增加了对NO-3的吸收,但随着胁迫时间延长,至处理后期时吸收减少。低氧胁迫条件下,GS活性的提高加速了叶片经NO-3还原产生的NH+4向有机态氮的转化,最终造成叶片NH+4含量的降低。低氧下植株根系铵态氮含量显著增加,表明根系的硝酸还原受到低氧促进,导致其转化产物铵态氮的积累。EBR显著缓解了盐胁迫下植株氮代谢产物的下降,其抑制剂加剧了盐胁迫对氮代谢的不利影响[11]。本试验中,EBR使低氧胁迫植株叶片的总氮含量恢复至对照水平,提高了胁迫处理末期植株根系的铵态氮含量,表明EBR促进了低氧胁迫下植株根系的硝酸还原。低氧胁迫导致NADH向NAD+的再生受到抑制,Igamberdiev等[18]认为硝酸盐还原产生NO,随后NO被氧基血红素氧化是低氧下细胞维持能量和氧化还原水平的一种机制。低氧条件下的硝酸还原是一种替代呼吸途径,硝酸盐作为一种中间媒介电子受体,有助于NADH的氧化。NR可催化NO-3还原,最终生成NH+4和各种含氮化合物,同时将NADH氧化生成NAD+以传递电子,并将NAD+补充至糖酵解途径,保证糖酵解途径顺利进行,为维持植株的生长提供能量[19]。缺氧通过解除14-3-3蛋白与酶蛋白的结合,提高NR去磷酸化,从而提高NR活性[20],对氧气缺失具有耐性的品种较敏感品种表现更高的NR活性[21],遗传调控NR活性缺失或添加钨酸盐(NR活性抑制剂)降低NR活性时加剧了低氧胁迫症状[22, 23]。由于NR喜较低的pH值,因此低氧诱导的细胞质酸化可能增加其活性[24]。本研究发现,低氧胁迫下黄瓜幼苗根系NR、NiR活性显著升高,加快了根系的硝酸盐还原。但就叶片而言,低氧下NR活性较通气对照植株显著降低。Kaiser等[24]发现叶片NR活性与气孔有关,气孔关闭后叶片NR失活,只有最大活性的20%~40%。EBR显著缓解了盐胁迫对豌豆幼苗及开花期植株的NR和NiR活性的抑制[20]。本研究中,与单纯低氧胁迫处理相比,营养液添加EBR显著促进了低氧植株根系的NR活性,但对叶片的NR及植株NiR活性没有影响。
本试验结果表明:低氧胁迫下黄瓜幼苗与氮代谢有关的酶活性发生了明显的变化,低氧胁迫下黄瓜通过提高叶片GS、GOGAT及根系GS活性,增强了氨同化能力,缓解了铵离子积累引起的铵毒害,这与Gao等[25]的研究结果一致。与单纯低氧胁迫植株相比,营养液添加EBR对植株GS和叶片GOGAT活性无明显影响,但缓解了低氧胁迫9 d的幼苗根系GOGAT活性降低,使之恢复至对照水平。
Miflin等[26]认为GDH是碳代谢和氮代谢的平衡使者,对维持碳氮平衡起着重要作用,具有双重功能。植物在低氧等逆境下GDH活性发生变化,其原因可能是逆境引起植物蛋白质降解,释放大量NH+4;而组织中NH+4含量的显著上升,诱导了还原型GDH(NADH-GDH)活性的上升,使NADH-GDH在NH+4同化中所起的作用加强,以减轻植物因NH+4的积累而造成的伤害。本研究中,低氧胁迫诱导了黄瓜幼苗叶片和根系NADH-GDH活性,说明低氧胁迫下黄瓜通过增强NADH-GDH活性加强了NH+4的同化。当植物缺少有机碳源(例如黑暗下光合作用不能进行)时,氧化型GDH(NAD+-GDH)分解谷氨酸(Glu),为三羧酸循环(TCA)提供碳骨架。碳饥饿处理的植物中,NAD+-GDH活性明显增加,Glu被分解,碳素以α-酮戊二酸的形式补充进入TCA,以满足其他代谢过程的需求[27]。在本试验中也发现低氧胁迫显著诱导了黄瓜幼苗叶片的NAD+-GDH活性,且酶活性在整个处理期间均保持较高水平;与单纯低氧胁迫处理相比,营养液添加EBR显著促进了低氧处理9 d的植株叶片NAD+-GDH活性。
研究表明,外源油菜素内酯能够通过增强植株抗氧化系统活性和光合能力提高植物对多种环境胁迫的耐性[28]。本研究表明:黄瓜植株通过增强硝酸还原、加强氮代谢缓解了低氧胁迫对植株的伤害;EBR通过进一步增强根系硝酸还原活性、提高叶片NAD+-GDH活性来提高植株的低氧耐性。
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