伏马菌素是由轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)与串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)所产生的一类水溶性代谢产物^[1]。现已发现的伏马菌素有15种,其中伏马菌素B₁(fumonisins B₁,FB₁)是串珠镰刀菌培养物的主要成分,也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。FB₁可引起马脑白质软化症^[2]、猪肺水肿症候群^[3]、大鼠肝癌^[4]等疾病,与人类食道癌有相关性^[5],还可诱导多种细胞损伤^[6],具有生殖毒性^[7]和免疫毒性^[8]。因此,世界卫生组织(WHO)将其列为近几年需要研究的真菌毒素之一。伏马菌素对食品污染的情况在世界范围内广泛存在,能污染玉米、小麦、水稻等谷类及其制品。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计,已有6个国家制定了玉米中伏马菌素的限量标准(1~3 mg · kg^-1)^[9]。

目前国内外报道的用于检测FB₁常用的方法有色谱法和免疫法^[10]。色谱法主要包括薄层色谱法(GC)、气相色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)^{[11, 12, 13, 14]}、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)^{[15, 16, 17]},免疫法主要包括酶联免疫法(ELISA)^{[18, 19]}、生物芯片法^[20]等,以上方法均具有较好的特异性和灵敏度,并广泛应用于伏马菌素污染情况的调查和检测中。但以上仪器检测方法的前处理过程复杂,成本较高;基于抗原抗体反应的免疫检测法,具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强等优点^[21],但分析时间长,不适合现场检测。胶体金免疫法是一种基于单克隆抗体和胶体金材料的基础上发展起来的一种侧向层析技术,已成为目前真菌毒素检测的新研究方向^[22]。该方法操作简便,无需仪器检测,适应于大量样本的现场检测^[23]。本试验以FB₁单克隆抗体技术为支撑,采用免疫层析法,研制出FB₁检测用胶体金试纸条,可用于玉米中FB₁的快速检测,对控制真菌毒素的危害具有重要意义。 1 材料与方法 1.1 试验材料

7周龄BALB/c雌鼠,购于安徽医科大学实验动物中心;FB₁、黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、氯金酸(HAuCl₄ · 3H₂O)、卵清蛋白(OVA),均购于美国Sigma公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA),购于以色列Fermentek公司;伏马菌素杂交瘤细胞株F3,南京农业大学中毒病实验室惠赠;小牛血清,购于杭州四季清公司;1640培养基、Hank′s液、牛血清白蛋白(BSA),购于Solarbio公司;考马斯亮蓝试剂盒,购于南京建成生物技术有限公司;Sartorius CN140硝酸纤维素膜(NC膜),购于德国赛多利斯公司;PVC底板、玻璃纤维、吸水纸,购于上海杰一生物科技有限公司;HRP标记羊抗小鼠IgG,购于北京中杉金桥有限公司;伏马菌素B₁免疫亲和柱,购于北京普瑞邦科技有限公司;聚乙二醇(PEG)20000、柠檬酸三钠,购于国药集团化学试剂有限公司。除液相检测用试剂为色谱纯外,其他试剂均为分析纯。玉米样品,购自合肥市农贸市场。 1.2 仪器与设备

BB15二氧化碳恒温培养箱、Smart2Pure 12 UV/UF超纯水一体机,Thermo公司;XDS-1B倒置显微镜,Nikon公司;TGL-18R高速冷冻离心机,珠海黑马公司;DYCZ-24双垂直蛋白电泳仪,北京六一仪器厂;UV-3600紫外-可见-近红外分光光度计,日本岛津公司;Ulfvaflex Ⅱ基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪,德国Bruker公司;JEOL-2010高分辨透射电子显微镜,日本电子株式会社;JY-EQ03型连续式划膜仪,上海杰一生物科技有限公司;600E分析型高效液相色谱,美国Waters公司。 1.3 方法 1.3.1 单克隆抗体的制备及纯化

取分泌抗体稳定的杂交瘤细胞株F3,扩大培养,用于单抗腹水的制备。每只BALB/c小鼠注射0.5 mL灭菌液体石蜡进行预刺激,7~14 d后腹腔注射杂交瘤细胞悬液0.5 mL,接种量为2×10⁶个细胞。经过10 d左右,待小鼠腹部膨大,使用5 mL注射器抽取腹水,于4 ℃ 10 000 r · min^-1离心30 min,取其中间层,-20 ℃保存备用。采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,用PBS(0.01 mol · L^-1,pH 7.4)透析2 d,每天换液4次,经PEG 20000浓缩后,用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量,间接竞争ELISA方法检测抗体效价,SDS-PAGE法检测FB₁单抗纯度,-20 ℃保存备用。 1.3.2 完全抗原FB₁-OVA的制备

采用戊二醛一步法,用PBS(0.01 mol · L^-1,pH 7.4)将OVA配制成1 mg · mL^-1的蛋白悬浮液,在磁力搅拌条件下用OVA蛋白悬浮液溶解1 mg FB₁,并逐滴加入1 mL体积分数为2%的戊二醛,室温反应1 h,加入20 mg硼氢化钠终止反应,室温反应1 h后收集在透析袋中,用PBS透析偶联物3 d,每天换液4次,透析结束经PEG 20000浓缩后,用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白质含量,质谱法验证偶联效果,-20 ℃保存备用。 1.3.3 制备胶体金和金标抗体

制备胶体金及金标抗体所用试剂均用超纯水配制,并经0.22 μm滤膜过滤。采用柠檬酸钠还原法制备胶体金,称取1 g氯金酸溶于100 mL超纯水中,配成10 g · L^-1氯金酸溶液,取1 mL氯金酸溶液溶于盛有100 mL超纯水的硅化过的烧瓶中,在磁力搅拌器上加热至沸腾,2 min后加入1.5 mL 10 g · L^-1柠檬酸三钠溶液。当溶液的颜色变为透明红色时,继续加热10 min后冷却至室温,4 ℃保存备用。

取烧制好的20 nm胶体金溶液100 mL置于清洗干净的玻璃器皿中,用0.2 mol · L^-1 K₂CO₃溶液将胶体金溶液调pH值至7.0,用磁力搅拌器均匀搅拌。每10 mL胶体金溶液缓慢滴加入FB₁单抗60 μg,搅拌15 min。加入100 g · L^-1 BSA,继续搅拌15 min。4 ℃ 3 000 r · min^-1离心10 min,取上清液,然后4 ℃ 10 000 r · min^-1离心30 min,将沉淀用含100 g · L^-1 BSA的PB(0.01 mol · L^-1,pH 7.4)重悬2次,沉淀溶于10 mL含10 g · L^-1 BSA、100 g · L^-1蔗糖、25 g · L^-1海藻糖的PB中。 1.3.4 试纸条制备

选用Sartoriu CN 140的硝酸纤维薄膜,检测线T线用1 μL · cm^-1的检测抗原FB₁-OVA 划线,控制线C线用1 μL · cm^-1羊抗鼠IgG划线,T线与C线相距0.5 cm,室温干燥后保存备用。

选用GL0194型号的玻璃纤维,浸泡于含有10 g · L^-1 BSA、50 g · L^-1蔗糖的PBS(0.01 mol · L^-1,pH 7.4),37 ℃干燥2 h。将制备好的金标抗体均匀铺在玻璃纤维膜上,每条铺金标抗体1 mL,37 ℃干燥1 h后保存备用。

取空白胶体金试纸条底板,先将NC膜粘在底板中间位置,然后将金标垫粘在靠近T线的一端,部分重合,再将样品垫粘在底板上,与金标垫部分重合,再将吸水纸粘在靠近质控线的一端,将组装好的大板切成0.3 cm的胶体金试纸条,装入PVC塑料卡中,并将塑料卡装入放有干燥剂的铝箔袋中,单个密封保存备用。 1.3.5 金标抗体及C线T线浓度的选择

金标抗体设A、B、C 3个组,分别取0.1、0.2、0.3 mL金标抗体稀释至1 mL,均匀铺在0.5 cm×30 cm金标垫上,每组检测线上检测抗原划膜量0.1、0.2、0.3和0.4 μg · cm^-1,选择出检测线颜色强度较为适中的组合。确定了金标抗体包被浓度和T线划膜浓度后,设置不同浓度的羊抗鼠抗体浓度,优化至T线、C线显色深度相同。 1.3.6 试纸条的灵敏度及检测限

用甲醇将FB₁标准品溶解为1 mg · mL^-1,70%甲醇水溶液(体积比7 ∶ 3)分别稀释为0、10、50、100、150、200、400和500 ng · mL^-1,再用上样缓冲液(含2 g · L^-1 BSA、10 g · L^-1蔗糖、25 mL · L^-1 Tween-20、10 g · L^-1 PEG 20000的PB)将其稀释5倍,使其终质量浓度为0、2、10、20、30、40、80和100 ng · mL^-1,各取70 μL加样检测,10 min后观察结果。 1.3.7 试纸条特异性及稳定性测定

分别加入FB₁、AFB₁、DON、ZEN和OTA 5种毒素各70 μL,每种毒素设定10、20、40和100 ng · mL^-1 4种质量浓度,对试纸条做交叉试验。

将试纸条分别置于4 ℃、室温、37 ℃条件下,每隔7 d取阳性样品(含FB₁标准品40 ng · mL^-1)和阴性样本各10份进行测试,测试2个月。 1.3.8 加标样品测定

将不含有FB₁的玉米粉碎,过20目筛,称取1 g,分别加入0、50、250、500、750和1 000 ng的FB₁标准品,放入10 mL离心管中,加入70%甲醇水溶液5 mL。加标样品在漩涡混匀器上震荡10 min,4 ℃ 4 000 r · min^-1离心5 min。每个样品用上样缓冲液5倍稀释后取70 μL加样。每个样品测试3次。 1.3.9 玉米样品测定

采用本试验研制出的FB₁胶体金免疫层析试纸条对从合肥市农贸市场收集的16份玉米样品进行检测,分析样品污染程度,并采用高效液相色谱法对其检测结果进行验证。FB₁胶体金免疫层析试纸条检测样品处理同1.3.8节所述,采用免疫亲和柱提取样品。色谱条件为:C₁₈色谱柱(5 μm,150.0 mm×4.6 mm);流动相为甲醇-磷酸二氢钠(0.1 mol · L^-1)(体积比为77 ∶ 23),磷酸调节pH值为3.3,流速0.8 mL · min^-1,进样量20 μL,柱温25 ℃;荧光激发波长335 nm,发射波长440 nm。衍生剂:5 mg邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇,用0.05 mol · L^-1四硼酸钠溶液定容至50 mL,加入25 μL巯基乙醇,混匀备用。每个样品重复检测3次。 2 结果与分析 2.1 FB₁抗体的浓度、纯度及效价

经测定,纯化后的抗体质量浓度为1.3 mg · mL^-1。SDS-PAGE法检测抗体结果如图 1所示。由电泳图可观察到纯化后的抗体电泳条带清晰,纯度明显比未纯化高,通过间接ELISA方法检测出抗体效价为1：1 024。

	图 1 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图 Fig. 1 SDS-PAGE of monoclonal antibody 蛋白质标准品Protein marker;2.纯化后腹水Ascites after purified;3.未纯化腹水Ascites before purified
图选项

FB₁-OVA偶联物经测定,蛋白质量浓度为0.8 mg · mL^-1。 质谱法检测结果如图 2所示,OVA和FB₁-OVA的质荷比分别为44 305.0和48 476.9,即OVA与FB₁-OVA的相对分子质量为44 035.0、48 476.9;人工抗原FB₁-OVA质谱峰质荷比与OVA的质荷比相差4 441.9,由此可推断出FB₁与OVA偶联成功。

	图 2 OVA(A)和FB1-OVA(B)的质谱分析图 Fig. 2 Mass spectrogram of OVA(A)and FB1-OVA(B)
图选项

根据偶联物相对分子质量的大小和如下偶联比的计算公式,可计算出FB₁与OVA间的偶联比为6.2：1。

制备的胶体金溶液呈酒红色,且均质澄清无沉淀。以超纯水作对照,用紫外可见分光光度计在400~600 nm进行扫描,测定吸收曲线和吸收峰。胶体金结果如图 3所示。最大吸收波长(λ_max)为520 nm,此波长处吸光值A₅₂₀为0.771,波峰宽度较小,分散性良好。透射电镜观察结果(图 5)显示:胶体金粒径分布均匀,无异性颗粒,平均直径为20 nm。

	图 3 胶体金紫外吸光值光谱图(A)和透射电镜(B)扫描图 Fig. 3 UV/visible absorption spectra(A)and TEM photos(B)of colloidal gold
图选项

由图 4可见:金标抗体和检测抗原量越大,颜色越深。小分子物质在使用胶体金技术进行检测时采用竞争法,金标抗体和检测抗原量越低,试纸条的灵敏度越高。试验组中最适组合为B3组,金标抗体量为0.4 μg · cm^-1,检测抗原为0.3 μg · cm^-1。

	图 4 不同量金标抗体和检测抗原组合的检测结果 Fig. 4 The test results of different combination of gold nanoparticle-McAb and detecting antigen 金标抗体Gold nanoparticle-McAb:A.0.2 μg · cm-1,B.0.4 μg · cm-1,C.0.6 μg · cm-1;检测抗原Detecting antigen:1.0.1 μg · cm-1,2.0.2 μg · cm-1,3.0.3 μg · cm-1,4.0.4 μg · cm-1
图选项

在优化好金标抗体和检测抗原量后,设羊抗鼠IgG为0.25、0.15和0.10 mg · mL^-1 3个质量浓度,阴性样品检测结果如图 5所示。0.25 mg · mL^-1的羊抗鼠质控线颜色比检测线深,0.15和0.10 mg · mL^-1质控线与检测线颜色相当,最终选择了0.10 mg · mL^-1的羊抗鼠IgG作为质控线划膜质量浓度。

	图 5 不同浓度羊抗鼠IgG检测结果 Fig. 5 The test results of different concentration of goat anti-mouse IgG 1~3表示羊抗鼠IgG浓度,分别为0.25、0.15和0.10 mg · mL-1。 Concentrations of goat anti-mouse from 1 to 3:0.25,0.15 and 0.10 mg · mL-1
图选项

用甲醇溶液和上样缓冲液稀释后的FB₁标准品,质量浓度分别为0、2、10、20、30、40、80和100 ng · mL^-1,检测结果如图 6所示。当FB₁标准品质量浓度为2 ng · mL^-1时,检测线与0 ng · mL^-1相比明显减弱,随着FB₁标准品质量浓度的增高,检测线显色越弱,当FB₁标准品质量浓度为大于40 ng · mL^-1时检测线完全消失,因此该试纸条的最低检出限为2 ng · mL^-1,最佳判定质量浓度为40 ng · mL^-1。

	图 6 不同质量浓度FB1标准品检测结果 Fig. 6 The test results of different concentration of FB1 standard 1~8表示FB1标准品质量浓度,分别为0、2、10、20、30、40、80和100 ng · mL-1。 The mass concentrations of FB1 standard from 1 to 8:0,2,10,20,30,40,80 and 100 ng · mL-1.
图选项

胶体金试纸条检测不同浓度的FB₁、ZEN、DON、AFB₁和OTA,结果如表 1所示。可见研制的试纸条与ZEN、DON、AFB₁和OTA几种常见真菌毒素无特异性结合。

试纸条分别置于4 ℃、室温(25 ℃左右)、37 ℃条件下,结果表明,随着温度的变化,试纸条的检测结果没有明显差异。依据37 ℃条件下1 d相当于室温下7 d计算,试纸条可以在室温下至少保存6个月,且不同批次胶体金试纸条检测同一样本的检测结果无明显差异。 2.8 加标样品的测定

样品加标最终质量浓度为0、2、10、20、30和40 ng · mL^-1,检测结果(图 7)显示:当加标质量浓度为40 ng · mL^-1时,检测线消失,结果为强阳性,换算成样品中的FB₁含量为1 000 μg · kg^-1。

	图 7 玉米加标样品检测结果 Fig. 7 Detection result of spiked corn 1~6表示样品的加标质量浓度,分别为0、2、10、20、30和40 ng · mL-1。 The mass concentrations of spiked samples from 1 to 6:0,2,10,20,30 and 40 ng · mL-1.
图选项

采用本试验研制出的试纸条及高效液相色谱法分别检测从合肥市农贸市场收集的16份玉米样品,检测结果(表 2)显示:经试纸条测试,16份玉米样品,有4份结果为阴性,10份为阳性,2份为强阳性;经HPLC对比检测,上述2份强阳性样品中FB₁含量均超过1 000 μg · kg^-1。本试验研制的试纸条与高效液相色谱法相关性良好,检测结果一致。

用胶体金免疫层析法检测FB₁时,由于采用竞争性免疫层析,因此抗体的纯度和效价、抗原的偶联效果、胶体金质量及金标抗体和检测抗原的包被量确定是该检测方法的关键。本试验选用F3株杂交瘤细胞,制备出的单克隆抗体,提高了试纸条的特异性。FB₁是小分子物质,其相对分子质量为721.8,是典型的半抗原,只具有反应原性而没有免疫原性,因此本试验采用戊二醛一步法对FB₁与载体蛋白OVA进行偶联,制备完全抗原,并采用质谱法对偶联结果进行验证,该方法是目前报道验证完全抗原最有效的检测方法之一^{[10, 24]}。

高质量的胶体金,是制备金标抗体和层析试纸条的必要前提。在烧制胶体金溶液的过程中,玻璃器皿的清洁及试剂溶液的配制会干扰胶体金颗粒的产生,因此本试验采用硅化过的玻璃器皿,并使用超纯水配制试剂,且经0.22 μm滤膜过滤。汪琳等^[25]报道,选择20 nm左右的胶体金粒子既可以保证其在硝酸纤维素膜上的爬膜速度,又可以使试纸条呈现肉眼观察最敏感的颜色。本试验采用柠檬酸钠还原法制备了20 nm粒径的胶体金溶液,粒径大小适中,可在检测结果中提供最大的可视性和最小的空间位阻。在制备金标抗体的过程中可能还存在未标记的蛋白和粒径大小不等的金标抗体,因此要对金标抗体进行纯化,以达到制备试纸条的要求^[26]。本试验采用低温低速离心除去粒径较大的胶体金颗粒,用低温高速离心除去未标记的蛋白,得到纯度较高的金标抗体。

在胶体金免疫层析技术中,金标抗体、T线及C线上抗原的包被量直接影响试纸条条带的显色效果。包被量过小,膜上的条带将不显色或显色不清晰;包被量过大,则会导致灵敏度降低。若要获得反应稳定、显色清晰的试纸条,须对金标抗体包被量及2条线上抗原的划膜量进行调整和比对,以期得到最佳显色结果和较高的灵敏度。

一种检测方法的建立,需要有样品的临床检测以及相关方法的验证。本试验对合肥市农贸市场收集的16份玉米样品进行了检测分析,并采用高效液相色谱法进行了验证,两种方法得到的检测结果一致,具有良好的相关性,说明本试验研制的FB₁胶体金免疫层析试纸条适用性较好,可用于农产品的快速检测,有效控制农产品的质量安全,保障人畜的健康。