文章信息
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- WEI Zhong, HU Jie, DONG Yue, YANG Tianjie, SHEN Qirong, XU Yangchun. 2015.
- 基于菜粕有机肥筛选番茄青枯病高效生防菌的研究
- Screen of antagonists against Ralstonia solanacearum by using rapeseed cake compost as a selected medium
- 南京农业大学学报, 38(3): 424-430
- Journal of Nanjing Agricultural University, 38(3): 424-430.
- http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.03.011
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文章历史
- 收稿日期：2014-07-07
2. 江苏省农业科学院资源与环境研究所, 江苏 南京 210014
2. Institute of Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,青枯菌)引起的一种毁灭性细菌性维管束土传病害[1]。该病在我国主要分布于长江以南,并有向西北地区扩散的趋势,严重制约着我国番茄产业的发展[2, 3]。目前已有大量关于生防菌防控土传青枯病的报道,然而研究发现平板上抑菌作用明显的拮抗菌在盆栽和田间试验中的防病效果却不稳定[4, 5]。土壤定殖能力差可能是生防菌产品田间应用效果不稳定的重要因素之一[6],大量生防菌施用到土壤后,由于缺少营养来源,不能在土壤形成优势种群,难以有效抑制土传病害的发展。这种不一致性可能是与目前生防菌的筛选多采用人工合成的富营养培养基有关[7]。这些培养基的营养成分和含量与土壤环境截然不同,拮抗菌施入土壤后,缺少足够的营养资源,不能大量定殖或者不能产生足够的拮抗物质,进而导致其生防效率不高。若生防菌能利用人为提供的载体大量增殖并能产生拮抗物质,其防控效果可能会提高。
菜粕有机肥是以菜粕为原料经蛋白酶高效分泌微生物降解而制成的氨基酸有机肥。菜粕有机肥中大量的营养物质,可以满足微生物的养分需求,增加土壤微生物活性。近年来菜粕有机肥常用作生防菌的营养载体,用于研发防治土传病害,取得较好的生防效果[4, 8, 9, 10, 11]。本研究目的在于:1)以菜粕有机肥为培养基筛选出能充分利用菜粕有机肥,且能以菜粕有机肥为底物合成大量拮抗物质的青枯病高效拮抗菌;2)以菜粕有机肥为功能菌营养载体,将拮抗菌与菜粕二次发酵后制成生物有机肥,研究其对番茄青枯病的防治效果。 1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 病原菌
青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌株QL-Rs1115由国家有机类肥料工程技术中心提供,该病原菌分离自番茄根际,对番茄、茄子等有很强的致病力[4]。 拮抗菌筛选所用土壤来自南京市麒麟镇后村番茄种植大棚青枯病发病地块的健康番茄植株根际,将健康植株连根拔起,轻轻抖动,紧贴根的土壤为根际土壤。盆栽试验所用土壤采自同一田块。土壤风干后,装入塑料盆钵中,每盆5 kg,待用。 1.1.2 番茄品种
番茄品种为‘合作903’,种子经表面消毒后,育苗至30 d后移栽至上述盆钵中。 1.1.3 菜粕有机肥
菜粕有机肥(RC)是以菜粕为原料经高效分泌蛋白的微生物分解而制成,含有机质442 g · kg-1,氨基酸80 g · kg-1,N 44 g · kg-1,P2O5 23 g · kg-1,K2O 6.7 g · kg-1,水分28.5%,由江苏新天地生物肥料公司提供。 1.1.4 供试培养基
RC培养基:菜粕有机肥80 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH 7.2,115 ℃灭菌30 min;NA培养基:蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,牛肉膏3 g,酵母膏0.5 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH 7.2,115 ℃灭菌30 min;青枯菌选择性培养基M-SMSA[12]:水解酪蛋白1 g,蛋白胨10 g,甘油5 mL,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH 6.5,121 ℃灭菌15 min,冷却至50 ℃,每升加入结晶紫5 mg,多黏菌素B硫酸盐100 mg,杆菌肽25 mg,氯霉素5 mg,青霉素5 mg,TZC(2,3,5-三苯基四氮)50 mg,放线菌酮100 mg。 1.2 拮抗菌筛选
称取1 g根际土壤置于装有9 mL无菌水的50 mL三角瓶中(含玻璃珠),170 r · min-1振荡30 min,土壤悬液10倍系列稀释后,涂布于NA和RC培养基平板,30 ℃培养2~4 d。挑取单菌落,纯化后用于筛选拮抗菌。从NA平板上随机挑选100株菌,分别命名为NA-1~NA-100;从RC平板上随机挑选100株菌,分别命名为RC-1~RC-100。
采用平板对峙法筛选青枯菌拮抗菌[13],具体如下:用无菌牙签将NA和RC系列菌株分别点接到NA和RC平板上,培养24 h后,将青枯菌QL-Rs1115悬液(109 CFU · mL-1)均匀地喷在平板上(约0.2 mL),30 ℃培养48 h后测定抑菌圈直径。从NA和RC平板上获得的拮抗菌NA-5和RC-14抑菌能力最强,采用平板对峙法考察拮抗菌NA-5和RC-14分别在RC和NA平板上拮抗青枯菌的能力。 1.3 拮抗菌利用菜粕有机肥的能力研究
将拮抗菌NA-5和RC-14菌液按1%(体积分数,下同)接种量加入RC液体培养基(不加琼脂),30 ℃、170 r · min-1振荡培养48 h,稀释涂布法测定发酵液中拮抗菌数量。 1.4 温室试验
生物有机肥的制备:将拮抗菌株NA-5和RC-14分别接种到RC液体培养基中,30 ℃振荡培养48 h,按照10%接种量分别接种到菜粕有机肥中,温室下发酵4~6 d,即为含菌株NA-5和RC-14的生物有机肥(分别命名为BOF5和BOF14),肥料中拮抗菌NA-5或RC-14含量达到5.0×108 CFU · g-1。
试验方案:试验采用盆栽方法,设CK(常规化肥处理)、RC(单施菜粕有机肥)、NA-5(单加NA-5菌悬液)、RC-14(单加RC-14菌悬液)、BOF5(施含NA-5菌株的生物有机肥)、BOF14(施含RC-14菌株的生物有机肥)6个处理,菜粕有机肥和生物有机肥用量为1%(质量分数),与土壤混匀。拮抗菌液体菌剂采用浇灌法,每钵50 mL(108 CFU · mL-1)。每盆移栽1株苗,每个处理重复30次。处理7 d后每钵接种100 mL青枯菌菌液(5.0×106 CFU · mL-1)。
病情调查:接种病原菌45 d后,对照处理发病严重,试验结束。统计发病率和生防效果,参照Wei等[4]的方法:根据植株叶片萎蔫程度,将发病级别分5级:0表示植株正常;1表示植株叶片萎蔫小于等于25%;2表示植株叶片萎蔫大于25%并小于等于50%;3表示植株叶片萎蔫大于50%并小于等于75%;4表示植株叶片萎蔫大于75%或死亡。发病率(disease incidence,DI)和生防效果(biocontrol efficacy,BCE)的计算公式如下:DI=∑(ni×i)/(N×imax)×100%;BCE=(DICK-DIt)/DICK×100%。其中:i为发病等级;imax为发病最高等级代表值;ni为发病等级为i的株数;N为某处理考察总株数;DICK和DIt分别为对照和处理发病率。
生物量测定:接种病原菌45 d后,将各处理的番茄植株连根拔起带回实验室,用自来水将植株地上部分清洗干净后装入大信封中,105 ℃杀青0.5 h后在80 ℃烘至恒质量,测定植株干质量。
根际病原菌数量测定:接种病原菌45 d后,采集各处理的根际土,利用M-SMSA平板稀释涂布法测定根际青枯菌的数量。 1.5 拮抗菌RC-14的鉴定
将菌株RC-14于NA培养基平板上划线,30 ℃培养48 h后,观察其菌落的形态特征。菌体经简单染色及革兰氏染色后,在光学显微镜油镜观察菌体形态,并进一步在透射电子显微镜下观察细胞的形态和大小。菌株RC-14的分子生物学鉴定采用菌体直接扩增16S rRNA基因的方法。PCR扩增菌株的16S rRNA基因序列引物为27F和1492R[14]。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循 环;72 ℃延伸10 min,4 ℃下保存。PCR产物经纯化后由上海立菲生物技术有限公司进行测序。菌株RC-14 的16S rRNA基因测序结果于GenBank数据库中进行BLAST同源性比对,以MEGA 4.1构建系统发育树。 1.6 数据分析与处理
试验数据处理使用Excel 2003程序和SigmaPlot 11.0等统计分析软件。数据进行ANOVO方差分析,分析方法为邓肯氏多重检验(Duncan′s Multiple Range Test)。 2 结果与分析 2.1 拮抗菌的筛选
采用NA和RC培养基分别从健康番茄根际土壤中各分离到100株细菌,分别命名为NA-1~NA-100和RC-1~RC-100。NA系列中有9株细菌在NA平板上对青枯菌QL-Rs1115有抑制作用(表 1),抑菌圈直径为3.4~ 29.0 mm,其中菌株NA-5抑菌圈最大。RC系列中有5株细菌在RC平板上对青枯菌QL-Rs1115有抑制作用(表 1),抑菌圈直径为3.0~24.0 mm,其中菌株RC-14抑菌圈最大。故选择菌株RC-14和NA-5作进一步研究。
| 菌株Strains | 抑菌圈直径/mmDiameters of inhibitioni zones | 菌株Strain | 抑菌圈直径/mmDiameters of inhibitioni zones | |
| NA-3 | 14.2±0.20c | RC-1 | 7.2±0.30c | |
| NA-5 | 29.0±0.30a | RC-7 | 3.0±0.30e | |
| NA-15 | 14.5±0.50c | RC-9 | 4.2±0.60d | |
| NA-19 | 3.4±0.40f | RC-10 | 13.1±0.40b | |
| NA-41 | 14.0±0.04cd | RC-14 | 24.0±0.40a | |
| NA-52 | 7.0±0.20e | |||
| NA-62 | 14.6±0.50c | |||
| NA-81 | 13.5±0.30d | |||
| NA-83 | 21.0±0.40b | |||
| 注:同列数字后标有不同字母表示Duncan′s检验在0.05水平差异显著。 Note:Different letters in lowercase in the same column represent significant difference at 0.05 level by Duncan′s test.The same as follows. | ||||
菌株NA-5在NA平板上对青枯菌抑制能力强,抑菌圈直径达29.0 mm(图 1-A),但在RC平板上对青枯菌抑制能力微弱(图 1-B);而菌株RC-14在RC平板上对青枯菌的抑制能力强,抑菌圈直径达24.0 mm,但在NA平板上对青枯菌抑制能力微弱。菌株NA-5和RC-14在菜粕液体培养基中生长速度较快,48 h后两者数量分别为8.92和9.13 lg(CFU · mL-1)。
 | 图 1 菌株RC-14和NA-5在NA(A)和RC(B)平板上对青枯菌的抑制效果 Fig. 1 Inhibition effects of strains RC-14 and NA-5 against R.solanacearum on NA(A)and RC(B)plates |
从表 2可知:单施菜粕有机肥与对照相比无明显促生效果;施用拮抗菌及其生物有机肥可显著提高番茄地上部干质量,单施菌株NA-5 和RC-14番茄地上部干质量分别较对照增加22.10% 和38.20%;施用菜粕有机肥与拮抗菌二次发酵的生物有机肥能显著提高番茄生物量,与对照相比,BOF5和BOF14地上部干质量分别增加44.90%和72.90%;与单施拮抗菌(NA-5和RC-14)相比,分别增加18.70%和25.10%。施用BOF14对生物量影响最显著,地上部干质量比施用BOF5增加了19.30%。
| 处理Treatments | 地上部干质量/gDry weight of tomato shoot | 增长率/%Increase rate |
| CK | 6.75±0.23d | — |
| RC | 6.83±0.12d | 1.19 |
| NA-5 | 8.24±0.32c | 22.10 |
| RC-14 | 9.33±0.24b | 38.20 |
| BOF5 | 9.78±0.41b | 44.90 |
| BOF14 | 11.67±0.31a | 72.90 |
| 注: CK:对照(常规化肥处理)Control(The treatment was treated with chemical fertilizer);RC:单施菜粕有机肥The treatment was treated with rapeseed cake compost;NA-5:单施NA-5菌悬液The treatment was treated with bacterial suspension of strain NA-5;RC-14:单施RC-14菌悬液The treatment was treated with bacterial suspension of strain RC-14;BOF5:施含NA-5菌株的生物有机肥The treatment was treated with bio-organic fertilizer containing strain NA-5;BOF14:施含RC-14菌株的生物有机肥The treatment was treated with bio-organic fertilizer containing strain RC-14. The same as follows. | ||
拮抗菌及其生物有机肥能有效抑制番茄青枯病的发生(表 3)。接种病原菌45 d后,对照发病率最高,达72.50%,显著高于其他处理。单独使用液体菌剂NA-5和RC-14的防病能力较差,生防效果分别为23.60%和22.10%。拮抗菌NA-5和RC-14与菜粕有机肥发酵后的生物有机肥BOF5和BOF14能显著抑制青枯病的发生,发病率分别为35.70%和17.50%。BOF14生防效果最好,达75.90%,显著高于其他处理。比较液体菌剂和生物有机肥的防控效果可知,菜粕极显著影响NA-5和RC-14的防病能力(P<0.001),BOF5和BOF14的生防效果分别提高1.15和2.44倍。
| 处理Treatments | 发病率/%Disease incidence | 生防效果/%Biocontrol efficacy | 青枯菌数量/[lg(CFU·g-1)]Number of R.solanacearum |
| CK | 72.50±1.30a | — | 8.81±0.25a |
| RC | 62.50±1.70b | 13.80 | 7.95±0.11b |
| NA-5 | 55.40±1.60c | 23.60 | 8.04±0.21b |
| RC-14 | 56.50±2.10c | 22.10 | 7.88±0.14c |
| BOF5 | 35.70±1.90d | 50.80 | 7.29±0.16c |
| BOF14 | 17.50±1.20e | 75.90 | 6.26±0.17d |
拮抗菌及其生物有机肥显著影响番茄根际青枯菌的数量(表 3)。接种青枯菌45 d后,对照番茄根际青枯菌数量达8.81 lg(CFU · g-1),显著高于其他处理。单独施用菜粕、液体菌剂NA-5和RC-14对番茄根际青枯菌抑制较弱,与对照相比,青枯菌数量下降不到1个数量级。施用拮抗菌NA-5和RC-14与菜粕发酵后的生物有机肥BOF5和BOF14显著抑制番茄根际青枯菌的生长,接种青枯菌45 d后,根际青枯菌数量分别为7.29和6.26 lg(CFU · g-1),与对照相比,分别下降了1.5和2.5个数量级。 2.4 拮抗菌RC-14的鉴定
菌株RC-14呈杆状,革兰氏染色阳性,菌体大小为(0.60~1.00)μm×(2.00~3.50)μm。在NA平板上菌落呈圆状、边缘规则,初期为乳白色、略有光泽、不透明,表面皱褶、中间略有突起,培养3 d以上易产生色素,菌落变成黄色,表面生成大量水珠,用接种环挑起无黏性、易破碎(图 2)。菌株RC-14的16S rRNA基因片段大小为1 439 bp(GenBank登录号为KF906612)。测序结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对,系统发育树构建结果(图 3)表明:菌株RC-14为土芽胞杆菌属(Geobacillus sp.)细菌。
 | 图 2 菌株RC-14在NA培养基上的菌落形态(A)和在透射电镜下的细胞形态(B) Fig. 2 The colony morphology of RC-14 on NA medium plate(A)and visualized under electro-microscope(B) |
 | 图 3 基于生防菌RC-14和相关菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by 16S rRNA gene sequences of RC-14 and related bacterial strains |
与传统筛选方法不同,本研究以菜粕有机肥为培养基,筛选能充分利用菜粕有机肥产生拮抗物质的拮抗菌,最终获得1株拮抗青枯菌的高效菌株RC-14,经初步鉴定为土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)。目前关于该属菌株防治土传病害的报道较少[15]。Ren等[16]分离到1株Geobacillus sp.M-7,其产生的挥发性有机化合物对烟曲霉、白地霉、油菜菌核病、绿色木霉、灰霉病和黄萎病等病原真菌具有生物活性。Abdelkader等[17]报道施用G.caldoxylosilyticus能帮助玉米减少盐胁迫。目前尚未发现有关Geobacillus sp.用于生物防治青枯病的报道。本研究结果表明,以营养载体为筛选培养基可以获得新种属的生防微生物资源。
本研究利用常规培养基(NA)筛选到1株拮抗菌NA-5(鉴定为Bacillus amyloliquefaciens解淀粉芽孢杆菌,结果未提供),其在NA平板上对青枯菌的抑制作用显著高于菌株RC-14,但菌株NA-5在菜粕培养基上的抑菌能力明显低于RC-14。在温室条件下分别单独接种NA-5和RC-14菌悬液防控番茄青枯病的效果并不好,两者的防病能力差异不显著;这一结果再次说明生防菌在常规平板上的抑菌能力与实际防效相关性不大。生防菌NA-5和RC-14以菜粕有机肥为载体发酵制成生物有机肥(BOF5和BOF14)后,其防病能力都显著提高,说明了增加生防菌营养载体的重要性。生物有机肥产品质量的好坏直接影响施用的效果,而产品质量的关键指标是产品的有效活菌数。生物有机肥的活菌数量决定于产品生产工艺,而供微生物生长的有机质载体是其重要的决定因素。本试验中,由于菌株NA-5和RC-14均能充分利用菜粕有机肥增殖,以菜粕有机肥为载体可能有助于增加生防菌在土壤中的定殖数量,进而有效提高生物有机肥的防病效果。同时研究认为营养载体的投入,也可能刺激了土壤微生物的活性,微生物总数量显著增加,使病原菌生长受到抑制[18]。
生物有机肥BOF14的温室防病效果显著高于生物有机肥BOF5,这一现象与生防菌NA-5和RC-14在RC平板上的表现一致。BOF14处理番茄根际青枯菌的数量仅为6.26 lg(CFU · g-1),而CK、RC和RC-14处理根际青枯菌数量分别高达8.81、7.95和7.88 lg(CFU · g-1),说明在菜粕有机肥存在的条件下,RC-14能更好地抑制病原菌生长,可能与RC-14以菜粕有机肥为营养合成了大量的拮抗物质有关。尽管NA-5在NA平板上抑菌能力比RC-14强,但其利用菜粕有机肥产生拮抗物质的能力微弱,因而在土壤中不能产生足够的拮抗物质来抑制病原菌的生长,所以BOF5处理番茄根际的青枯菌数量显著高于BOF14处理。此前有研究报道[19]在黄豆粉和玉米粉琼脂培养基上筛选拮抗放线菌的效果比在PDA和高氏1号培养基上好,玉米粉和黄豆粉琼脂均可作为拮抗放线菌的筛选培养基。曹亮亮等[20]研究同一功能菌株添加不同有机载体制成的生物有机肥时,发现添加膨化羽毛粉制成的生物有机肥不及添加菜粕制成的生物有机肥对香蕉的促生作用显著。这一研究结果给我们一个重要启示,在筛选生防菌资源时,应以产品开发为主导,根据不同的有机载体,筛选并获得具有较大潜力的功能菌株。
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