南京农业大学学报  2015, Vol. 38 Issue (3): 417-423   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.03.010
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徐春淼, 韦中, 廖汉鹏, 樊晓腾, 郑海平, 沈其荣, 徐阳春. 2015.
XU Chunmiao, WEI Zhong, LIAO Hanpeng, FAN Xiaoteng, ZHENG Haiping, SHEN Qirong, XU Yangchun. 2015.
一种评价稻秆降解菌分解能力的方法
Study on evaluation of the degradation ability of rice straw-degrading bacteria
南京农业大学学报, 38(3): 417-423
Journal of Nanjing Agricultural University, 38(3): 417-423.
http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.03.010

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收稿日期：2014-07-08
引用本文
徐春淼, 韦中, 廖汉鹏, 樊晓腾, 郑海平, 沈其荣, 徐阳春. 2015. 一种评价稻秆降解菌分解能力的方法[J]. 南京农业大学学报, 38(3): 417-423.
XU Chunmiao, WEI Zhong, LIAO Hanpeng, FAN Xiaoteng, ZHENG Haiping, SHEN Qirong, XU Yangchun. Study on evaluation of the degradation ability of rice straw-degrading bacteria[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 38(3): 417-423.  DOI: 10.7685/j.issn.1000-2030.2015.03.010
一种评价稻秆降解菌分解能力的方法
徐春淼, 韦中, 廖汉鹏, 樊晓腾, 郑海平, 沈其荣, 徐阳春     
南京农业大学资源与环境科学学院/国家有机类肥料工程技术研究中心, 江苏 南京 210095
收稿日期：2014-07-08
基金项目：农业部948项目(2011-G27);国家公益性行业(农业)科研专项(201203001);国家科技支撑计划项目(2013BAD20B05)
作者简介：徐春淼,硕士研究生。
通迅作者：徐阳春,教授,研究方向为固体废弃物资源化,E-mail:ycxu@njau.edu.cn。
摘要：[目的] 探究一种评价稻秆降解菌分解能力的新方法。[方法] 以10株秸秆降解细菌为材料,研究其在羧甲基纤维素钠平板上的水解圈以及其在纯稻秆粉为碳源的液体发酵培养基中的纤维素和半纤维素酶活力与稻秆相对降解率(RDR)的关系。[结果] 菌株在羧甲基纤维素钠平板上的水解圈直径(D)、水解圈-菌落直径比(D/d)、纤维素和半纤维素最大酶活力与RDR均未达到显著关系(P>0.05);液体发酵培养1周内每天的纤维素和半纤维素酶活力与RDR没有显著线性关系。而菌株在液体发酵培养1周内的累积纤维素酶活力、累积半纤维素酶活力与RDR成显著正相关(P<0.05);培养1周内累积纤维素半纤维素酶活力与RDR达到极显著水平(P<0.01)。[结论] 说明采用单个累积酶活力和总累积酶活力(纤维素酶和半纤维酶)能够更好地评价菌株对稻秆的实际降解能力,可作为秸秆降解菌降解能力的评价指标。
关键词： 稻秆降解菌     纤维素酶     半纤维素酶     累积酶活力     稻秆相对降解率     评价方法    
Study on evaluation of the degradation ability of rice straw-degrading bacteria
XU Chunmiao, WEI Zhong, LIAO Hanpeng, FAN Xiaoteng, ZHENG Haiping, SHEN Qirong, XU Yangchun     
College of Resources and Environmental Sciences/National Enginnering Research Center for Organic-based Fertilizers, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] A better method for evaluation of the degradation ability of rice straw-degrading bacteria was explored. [Methods] Ten strains of straw-degrading bacteria were used to study the relationship between the hydrolysis ring(on CMC-Na plate), carboxymethyl cellulase(CMCase)and xylanase activity in rice straw powder as carbon source for liquid fermentation medium and the relative degradation rate of rice straw. [Results] The hydrolysis zone diameter on CMC-Na plate(D), the ratio of hydrolysis zone to colony diameter(D/d), the largest CMCase and xylanase activities of each day of strains were not significantly correlated with their relative degradation rate(RDR)on rice straw(P>0.05). Positive correlations were observed between the CMCase or xylanase activities accumulated for one week and RDR(P<0.05), while the total cumulative enzyme(CMCase plus xylanase)activity in one week was significantly correlated with RDR(P<0.01). [Conclusions] The cumulative enzyme activity of strain is better to evaluate the actual degradation effects, and this new evaluation method provides a more accurate identification of reference for the degradation ability of the straw-degrading bacteria.
Keywords: straw-degrading bacteria     CMCase     xylanase     total enzyme activity     relative degradation rate     evaluation standard    

微生物在秸秆降解中扮演着重要角色,筛选高效秸秆降解菌是应用的基础,而可靠的微生物降解能力评价体系是筛选获得高效秸秆分解菌的前提[1]。目前有关菌株降解秸秆能力高低的评价指标不一,Hankin等[2]以菌株在CMC-Na平板上水解圈直径(D)的大小为指标,魏桃员等[3]采用菌株在CMC-Na 平板上水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)作为评价标准,郭夏丽等[4]以培养48 h后的Cx酶活力值作为评价依据,曾青兰等[5]则采用菌株最大Cx酶活力的高低筛选菌株。这些评判标准都各具特点和优势,但也有研究表明,依据这些标准筛选所获菌株的秸秆实际降解效果并不尽人意[6]。秸秆的主要组成成分是纤维素和半纤维素[7],微生物对秸秆的降解是多种酶系协同作用的结果[8],其降解是一个连续的过程[9]。而整个发酵过程中菌株不同酶系的活力变化较大,因此客观评价菌株降解能力应综合考虑其发酵过程中的酶活力变化。本研究提出采用菌株总酶活力评价菌株降解能力的方法,即在1周内每天连续测定10株秸秆降解菌株液体发酵培养产生的纤维素和半纤维素酶活力的基础上,得到累积酶活力(S),通过线性分析研究培养1周内水稻秸秆的相对降解率与菌株总酶活力的关系,发现利用累积酶活力可以更稳定地评价菌株降解能力,该方法可为科学筛选高效秸秆降解菌提供借鉴。 1 材料与方法 1.1 供试菌株

供试的10株秸秆降解细菌保存于本实验室,相关信息见表 1。菌株经LB培养基[10]活化后用于后续试验。

表 1 供试菌株鉴定结果 Table 1 The identification results of the strains used in the experiment
菌株Strain革兰氏反应Gram reaction鉴定结果Identification results
CD2-1-Pseudomonas sp.
GS1-2+Staphylococcus saprophyticus
GS2-3+Bacillus sp.
XJ1-1+Paenibacillus sp.
ZJA-5-Enterobacter sp.
ZJA-6+Paenibacillus sp.
ZJA-7-Stenotrophomonas sp.
ZJC-3-Pseudomonas sp.
ZJE-3+Paenibacillus sp.
ZJE-4+Bacillus sp.
注: “-”表示阴性反应。“-”indicates negative reaction;“+”表示阳性反应。“+”indicates positive reaction.
表选项
1.2 培养基

羧甲基纤维素钠培养基参照文献[11]略作改动:CMC-Na 10 g、KH2PO4 2.0 g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3 g、CaCl2 0.3 g、微量元素1 mL(FeSO4 5 mg、MnSO4 1.6 mg、ZnCl2 1.7 mg、CoCl2 2 mg)、pH 7.0、去离子水1 L。

Mandels营养液[12]:(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2.0 g、Co(NH2)2 0.3 g、MgSO4 · 7H2O 0.3 g、CaC12 0.3 g、FeSO4 · 7H2O 7.5 mg、MnSO4 · H2O 2.5 mg、ZnSO4 2.0 mg、CoC12 3.0 mg,去离子水1 L。

液体产酶培养基参照文献[13]略作改动:稻秆于75 ℃烘干至恒质量后用植株粉碎机粉碎成粉,取2 g 加入250 mL三角瓶中,每瓶再加入100 mL Mandels营养液,pH 7.0。

液体发酵培养基参照文献[14]略作改动:将75 ℃烘干至恒质量的稻秆剪成2~3 cm的条,每个500 mL三角瓶装入5 g稻秆条,加入200 mL Mandels营养液,pH 7.0。

以上培养基均在121 ℃条件下灭菌30 min。 1.3 方法 1.3.1 透明圈法测定菌株相对酶活力

将10株细菌分别点接种在羧甲基纤维素钠平板培养基上,每个处理重复3次。25 ℃恒温培养72 h,测定菌落直径(d),然后用1 g · L-1刚果红染液染色20 min,弃去染液,加入1 mol · L-1 NaCl溶液,洗涤20 min后测量水解圈直径(D)。 1.3.2 菌株酶活力测定

将10株菌分别接种到LB液体培养基中,25 ℃、170 r · min-1振荡培养过夜。待菌液浓度达到106 CFU · mL-1时,接种1 mL菌液到液体产酶培养基,每处理重复3次,25 ℃、170 r · min-1振荡培养1周,每隔24 h取2 mL液体,11 000 r · min-1离心取上清液,得到粗酶液[13],用于酶活力测定。

所测定的酶活力包括纤维素酶(CMCase,C)以及半纤维素酶(xylanase,X)。酶活力测定按照IUPAC标准[15]进行,反应结束后测定540 nm的吸光度值。纤维素酶活力以产生的葡萄糖衡量,半纤维素酶活力以产生的木糖衡量。酶活力定义为在适宜的条件下,每分钟水解底物生成1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。 1.3.3 稻秆相对降解率测定

取2 mL菌液(106 CFU · mL-1)接种至液体发酵培养基,25 ℃恒温静置培养,每处理重复3次,同时设不接菌的对照。7 d后将降解剩余物料置于75 ℃烘箱中烘干至质量恒定,计算秸秆相对降解率(relative degradation rate,RDR)。RDR=(M0-M1)/M0×100%。其中:M0为对照处理残渣的干物料质量;M1为处理组发酵后干物料质量。 1.3.4 累积酶活力的定义与计算

本研究假设某株菌的酶活力Cx随时间的变化趋势如图 1-A,x轴为时间,y轴为酶活力,那么曲线的面积则为这段时间的累积酶活力(S)。若把曲线均匀分割成无数个小块(近似为梯形),则第1个小块S1=(y0+y1)×x1/2,第2个小块S2=(y1+y2)×x2/2,……,第n个小块Sn=(yn-1+yn)×xn/2,曲线的总面积S=S1+S2+……+Sn=(0.5y0+y1+y2+……+yn-1+0.5yn)×x/n(图 1-B),即菌株的累积酶活力(S)受各时段酶活力大小影响,利用一段时间内菌株单位时间酶活力可以累加出菌株在该时间段内累积酶活力。

图 1 菌株酶活力随时间变化示意图 Fig. 1 Schematic of continuous activity calculation
A:连续酶活曲线示意图Schematic of continuous activity;B:曲线面积计算示意图Enzyme activity curve segmentation map
图选项
1.4 统计分析

采用Excel 2010和SigmaPlot 12.0软件对数据进行分析。在表征纤维素和半纤维素2个酶活力的总和时,先将各时间点的酶活力进行标准化(数据在0~1之间),再进行加和,以便得到累积纤维素半纤维素酶活力(CMCase and Xylanase,CX)。 2 结果与分析 2.1 透明圈法测定10株菌相对酶活力

由图 2-A可知:在培养72 h后,水解圈直径从大到小的菌株依次为ZJC-3、ZJA-7、ZJE-4、GS1-2、CD2-1、GS2-3、ZJE-3、ZJA-6、ZJA-5和XJ1-1,ZJC-3的水解圈直径达到23.0 mm,显著大于其他菌株;而XJ1-1 的水解圈直径最小,显著小于其他菌株。水解圈直径与菌落直径的比值(D/d)从大到小的菌株依次为ZJE-4、GS2-3、GS1-2、ZJE-3、XJ1-1、ZJA-5、ZJA-6、CD2-1、ZJA-7和ZJC-3,ZJE-4的D/d值最大,达到14.55,显著大于其他菌株,而菌株ZJA-7和ZJC-3的D/d值显著小于其他菌株。

图 2 不同菌株羧甲基纤维素钠平板上的水解圈直径(D)(A)和水解圈直径与菌落直径比(B) Fig. 2 Diameters of hydrolytic zone of straw-degrading bacteria(D)(A)and ratios of diameter of hydrolytic zone to colony diameter(D/d)(B)
不同字母表示在0.05水平差异显著。Different letters indicate significant difference at 0.05 level.The same as follows.
图选项
2.2 菌株酶活力特征与相对降解率

供试10株菌株在整个发酵周期中的纤维素酶活力呈现出逐渐增加或先增加后降低的变化趋势(图 3-A)。菌株ZJE-4在整个发酵过程中检测不到纤维素酶活力,其他9株菌的最大纤维素酶活力(Max-C)为0.04~0.49 U · mL-1,菌株ZJE-3在整个发酵周期中纤维素酶活力呈持续上升趋势,说明其能较好地利用稻秆底物产纤维素酶。在整个发酵周期中,10株菌的半纤维素酶活力曲线均呈现2个峰值(图 3-B),可能的原因是在培养时菌株衰亡导致胞内酶释放出来,使酶活力再次升高[16];10株菌的最大半纤维素酶活力(Max-X)为1.90~16.10 U · mL-1。不同菌株培养1周的稻秆相对降解率为10.00%~33.27%,降解率从大到小的菌株依次为GS2-3、ZJA-6、XJ1-1、ZJA-5、ZJE-3、ZJE-4、CD2-1、ZJC-3、GS1-2和ZJA-7,其中菌株GS2-3在1周内对稻秆的降解率最大,为33.27%,显著高于其他菌株。

图 3 培养1周内不同菌株的纤维素酶活力(A)和半纤维素酶活力(B)以及稻秆相对降解率(C) Fig. 3 Carboxymethyl cellulase(CMCase)(A)and xylanase(B)activities of ten strains and their relative degradation rate(RDR)of rice straw(C)in a week
图选项

按照累积酶活力定义的方法计算得出10株菌累积纤维素酶活力和累积半纤维素酶活力,并将2种酶活统一标准后得到累积纤维素半纤维素酶活力(表 2)。10株菌在1周内累积纤维素酶活力为0.06~1.47 U · mL-1,累积半纤维素酶活力为3.58~87.37 U · mL-1,菌株ZJE-3的累积纤维素酶活力显著高于其他9株菌,菌株ZJE-4的累积半纤维素酶活力显著高于其他9株菌,累积纤维素半纤维素酶活力从大到小的菌株依次为ZJE-4、ZJA-6、ZJE-3、GS2-3、ZJA-5、XJ1-1、CD2-1、ZJA-7、GS1-2和ZJC-3,其中ZJE-4在1周内累积纤维素半纤维素酶活力最高,达到5.43 U · mL-1。

表 2 菌株累积纤维素酶活力、累积半纤维素酶活力和累积纤维素半纤维素酶活力 Table 2 The cumulative CMCase activity(SC),cumulative xylanase activity(SX)and cumulative CMCase and xylanase activity(SCX)of strains used in the experiment
菌株Strain累积纤维素酶活力/(U·mL-1)SC累积半纤维素酶活力/(U·mL-1)SX累积纤维素半纤维素酶活力/(U·mL-1)SCX
CD2-10.53c4.83fg1.38d
GS1-20.29e3.58g0.81de
GS2-30.75b29.27c3.35b
XJ1-10.47cd16.87d2.02c
ZJA-50.40d26.03c2.43bc
ZJA-60.53c62.75b4.99a
ZJA-70.23e10.23e1.11d
ZJC-30.24e4.15g0.75e
ZJE-31.47a6.93f3.43b
ZJE-40.06f87.37a5.43a
表选项
2.3 酶活力与相对降解率的关系 2.3.1 不同酶活力评价指标与相对降解率的关系

将10株菌的D、D/d、Max-C和Max-X值与菌株对稻秆的RDR值进行线性分析得到表 3,其中PD=0.070,R2D=0.353,说明D值与RDR之间未达到显著相关水平,且试验数据和使用这组试验数据拟合出的直线之间的偏离较大;PD/d=0.116,R2D/d=0.280,同样可以得出D/d值与RDR之间没有达到显著相关水平;PMax-C=0.531,R2Max-C=0.051,说明两者之间不能达到显著相关并且拟合度差;PMax-X=0.193,R2Max-X=0.201,说明菌株的最大半纤维素酶活力与其对稻秆的相对降解率之间无显著相关。

表 3 不同评价指标与稻杆相对降解率相关性分析 Table 3 Linear correlation analysis between existing evaluation indexes and RDR
指标ParameterF值F-valueP-valueR2
D4.3600.0700.353
D/d3.1050.1160.280
Max-C0.4280.5310.051
Max-X2.0170.1930.201
注: Max-C:最大纤维素酶活力The largest CMCase activity;Max-X:最大半纤维素酶活力The largest xylanase activity
表选项
2.3.2 纤维素酶活力与稻秆相对降解率的关系

分析供试菌株培养1周内纤维素酶活力与其对稻秆相对降解率之间的线性关系(表 4)发现,培养第1、2、6、7天两者之间的线性分析结果达到显著水平,而培养第3天的酶活力与降解率无显著线性关系。把培养1周的菌株纤维素酶活力进行累积得到累积纤维素酶活力(SC),SC与相对降解率进行线性分析,得到PSc=0.048,R2Sc=0.416,表明菌株的累积纤维素酶活力与稻秆相对降解率之间呈显著正相关关系(P<0.05)。

表 4 纤维素酶活力与相对降解率相关性分析 Table 4 Linear correlation analysis between CMCase and RDR
发酵时间段Fermentation timeF值F-valueP值P-valueR2
第1天The 1st day6.4990.034*0.379
第2天The 2nd day5.5890.046*0.338
第3天The 3rd day4.0950.0780.256
第4天The 4th day3.7330.0890.233
第5天The 5th day0.8730.3780.067
第6天The 6th day6.7190.032*0.389
第7天The 7th day1.0100.033*0.053
1周(SC)1 week4.8100.048*0.416
Note:*P<0.05,* *P<0.01.The same as follows.
表选项
2.3.3 半纤维素酶活力与稻秆相对降解率的关系

分析供试菌株在培养1周内的半纤维素酶活力与其对稻秆相对降解率之间的线性关系,结果(表 5)表明,培养第4、5、6天的半纤维素酶活力与稻秆相对降解率达到显著水平,而其他培养时间的半纤维素酶活力与稻秆相对降解率均未达到显著相关水平。将培养1周内各个菌株的半纤维素酶活力进行累积得到累积半纤维素酶活力(SX),SX与其对稻秆的相对降解率进行线性分析,发现PSx=0.003,R2Sx=0.653。可见,菌株培养1周的累积半纤维素酶活力与稻秆相对降解率之间呈正相关,并且达到极显著水平(P<0.01),且其线性关系拟合性较好。

表 5 半纤维素酶活力与相对降解率相关性分析 Table 5 Linear correlation analysis between xylanase and RDR
发酵时间段Fermentation timeF值F-valueP值P-valueR2
第1天The 1st day4.7250.0610.293
第2天The 2nd day4.5850.0650.285
第3天The 3rd day4.0170.0800.251
第4天The 4th day6.1880.038*0.366
第5天The 5th day5.5810.046*0.337
第6天The 6th day14.9820.005**0.608
第7天The 7th day2.7660.1140.133
1周(SX)1 week17.9200.003**0.653
表选项
2.3.4 累积纤维素和半纤维素酶活力与稻秆相对降解率的关系

菌株对秸秆的降解机制主要是菌株产生的胞外酶作用于秸秆的纤维素和半纤维素,所以菌株在发酵培养1周内产生的纤维素、半纤维素酶活力对稻秆的酶解作用应该体现在对稻秆的相对降解率上。将菌株每天的纤维素酶活力与半纤维素酶活力统一标准化后累加,再分析每天的纤维素半纤维素酶活力、1周的累积纤维素半纤维素酶活力与其对稻秆的相对降解率之间的线性关系,结果(表 6)表明,第1、2、4、5、6、7天的纤维素半纤维素酶活力都与其对稻秆的相对降解率达到显著水平。同时,分析各株菌1周内累积纤维素半纤维素酶活力(SCX)与其对稻秆的相对降解率的关系,发现PScx=0.004,R2Scx=0.626,可见两者之间达到极显著水平(P<0.01)。说明采用单位时间内菌株累积纤维素半纤维素酶活力能够更好地评价菌株对秸秆的实际降解能力。

表 6 累积纤维素和半纤维素酶活力与相对降解率相关性分析 Table 6 Linear correlation analysis between CMCase and xylanase and RDR
发酵时间段Fermentation timeF值F-valueP值P-valueR2
第1天The 1st day6.2830.037*0.370
第2天The 2nd day9.5980.015*0.489
第3天The 3rd day4.5630.0650.284
第4天The 4th day8.4740.020*0.454
第5天The 5th day10.4800.012*0.567
第6天The 6th day15.6600.004**0.620
第7天The 7th day15.9430.004**0.622
1周(SCX)1 week16.0600.004**0.626
表选项
3 讨论

前人对筛选秸秆纤维素降解菌的研究较多,但评价降解能力的方法各异。张庆华等[17]以菌株在羧甲基纤维素钠平板上水解圈的大小为标准判断菌株的降解能力,也有不少学者认为用D/d判断菌株的降解能力更好[18, 19]。Chang等[20]指出,木质纤维素酶多是胞内酶,即便菌株没有降解稻秆的能力,也能分解刚果红色素使刚果红平板产生透明圈;刘尧等[21]也发现,仅仅依靠菌株在CMC-刚果红平板上的生长情况作为评价菌株产纤维素酶活力大小的定量指标不可靠,其原因有多方面,如不同菌株具有不同的生长和产酶的速度及不同纤维素酶系、菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等。本试验对10株纤维素降解菌的研究结果表明,菌株在羧甲基纤维素钠平板上水解圈直径D以及D/d值均与其对稻秆的最终降解效果没有显著相关关系(PD=0.070,PD/d=0.116),因此采用测定水解圈的方法筛选秸秆高效降解菌株值得商榷。

为评价菌株降解能力,一些研究者常采用测定菌株在某一培养时期酶活力的方法。Lee等[22]选取培养48 h后的纤维素酶活力大小作为评价降解菌能力的标准,顿宝庆等[23]则以培养72 h后的纤维素酶活力值作为评价依据,这些评价标准缺乏广泛的适应性。本研究发现,菌株的纤维素和半纤维素酶活力并不是规律曲线,不同株菌的最大产酶时间并不相同,培养48和72 h的酶活力与其相对降解率多数无显著相关关系。李慧君等[24]仅选取菌株在一段时间内最大酶活力值来判断菌株在这段时间内的降解能力,Rastogi等[25]研究发现筛选所获纤维素酶活力最大的菌株,其实际降解效果并不是最好。本研究中培养1周的菌 株最大纤维素酶活力和最大半纤维素酶活力与菌株对稻秆的相对降解率之间都未达到显著相关(PMax-C= 0.531,PMax-X=0.193),说明最大纤维素酶活力和最大半纤维素酶活力并不能代表菌株的降解能力。

微生物对秸秆的降解是多种酶系协同作用的结果,其降解是一个连续的过程,采用菌株的瞬时酶活力去筛选高效降解菌株,本身就存在局限性。本研究提出菌株在一段时间内对秸秆的降解效果与其在该时间段累积酶活力有关,通过连续测定菌株酶活力,分析累积酶活力与相对降解率的关系,发现两者呈显著正相关,说明使用单位时间内累积酶活力来评价菌株的降解能力更可靠。这种评价方法只是初步研究结果,今后需要进一步优化测定总酶活力的方法,同时还需对其他相关酶进行研究,以便更全面地验证该方法的可靠性,以期建立一种简单、快速、准确的筛选降解菌株并评测菌株能力的新方法。

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