棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的土传性真菌病害,侵害棉花的维管束系统,引起棉花病株叶片枯萎凋落,蕾铃大量脱落,纤维品质明显下降,被称为“棉花癌症”^{[1, 2]}。棉花黄萎病已成为影响我国棉花持续高产、高质的主要障碍,尤其在我国最大商品棉生产基地——新疆,由于连作种植模式的限制,病害呈逐年加重、扩大趋势^{[3, 4, 5]}。

目前防治棉花黄萎病的主要方法有培育抗性品种、倒茬轮作、化学农药和生物防治^{[6, 7]}。随着国家把生态文明建设纳入“五位一体”总体布局,发展绿色生态农业,利用高效、无毒、无害的生物防治措施防治植物病虫害,促进农业可持续发展越来越受到人们的重视和关注。生物防治的优点包括:对人畜安全,对环境无污染,不易使病原微生物产生抗性^{[8, 9]}。

获得高效拮抗菌株是生物防治的前提。与真菌相比,细菌具有繁殖能力快、环境适应能力强以及代谢物质多样性等特点,因此在生物防治中扮演着重要角色。目前土传性病害应用较多的生防细菌主要是芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和农杆菌(Agrobacterium spp.)^{[10, 11]}。芽孢杆菌能产生耐热、耐干燥的内生芽胞,分泌多种抑菌化合物,生产工艺简单,存储期长,是一种理想的生防微生物^{[12, 13, 14]}。除了营养、生态位竞争和诱导植物产生系统抗病性,利用脂肽类化合物对抗植物病原菌是芽孢杆菌发挥拮抗作用的另一种机制^{[15, 16, 17]}。Mora等^[18]利用srfAA等6种抗菌肽合成基因分析了184株芽孢杆菌合成的脂肽类化合物的潜力,为发掘具有广谱、高效抑菌能力的拮抗菌株提供了技术指导。

新疆具有干旱少雨、昼夜温差大、紫外线辐射强等特殊的气候条件,孕育着具有特殊适应性的拮抗芽孢杆菌。本研究通过对新疆连作棉田根际土壤中芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定及其拮抗机制研究,筛选出对大丽轮枝菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌S12,为新疆棉花黄萎病的生物防治提供菌株资源和理论指导。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),由石河子大学农学院植物病理教研室提供。

供试棉花品种为‘新陆早13号’,由作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室提供。

从新疆农垦科学院试验区、石河子大学多年连作且黄萎病较重的棉田中,采集未发病棉株地表以下5~15 cm处土壤样品4份,保存于密封袋中,带回实验室进行细菌分离,剩余土样保存于4 ℃冰箱。

NA培养基^[19],用于拮抗细菌的分离和培养。NB培养基^[19],用于细菌的液体摇瓶培养。PDA培养基^[19]和察氏培养基^[19],用于大丽轮枝菌的培养。纤维素酶培养基:CMC-Na 5.0 g,MgSO₄ · 7H₂O 0.1 g,(NH₄)₂SO₄ 0.5 g,K₂HPO₄ 0.25 g,刚果红0.4 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.2;β-1,3葡聚糖酶培养基:KH₂PO₄ 7 g,K₂HPO₄ 18 g,酵母膏5 g,茯苓粉4 g,苯胺蓝0.1 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.2;蛋白酶培养基:葡萄糖10 g,酵母粉4 g,酪蛋白10 g,K₂HPO₄ 1 g,MgSO₄ · 7H₂O 0.2 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.2;几丁质酶培养基:胶体几丁质5.0 g,MgSO₄ · 7H₂O 0.5 g,FeSO₄ · 7H₂O 0.01 g,KH₂PO₄ 0.3 g,K₂HPO₄ 0.7 g,ZnSO₄ 0.001 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.2;用于拮抗细菌的水解酶试验。所用试剂均为分析纯。

土壤细菌的分离采用梯度稀释法,称取10 g土样放入装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中,充分振荡混匀后于80 ℃水浴20 min,取1 mL混合液进行梯度稀释,分别取10^-3、10^-4和10^-5稀释液0.1 mL涂布于NA培养基平板上,每个梯度重复3次,于30 ℃恒温培养箱中倒置黑暗培养24 h,挑取形态、大小、色泽不同的单菌落划线纯化,转接到NA斜面上,并分别进行菌株编号,置于4 ℃冰箱保存备用。

初筛:将4 ℃斜面保存的大丽轮枝菌转接到PDA平板上活化,7~10 d后,在菌落边缘区域用灭菌打孔器制成直径5 mm菌饼,接种在直径为90 mm的PDA平板中央。25 ℃培养4 d后,距离菌饼四周20 mm处接种同一种供试细菌菌株,以不接种细菌的PDA平板为对照,继续置于25 ℃培养箱中培养,10 d后观察并测量大丽轮枝菌的菌落直径,计算抑菌率^[20]。复筛:将初筛的菌株接入NB培养基中,30 ℃、200 r · min^-1发酵培养48 h后,4 ℃、8 000 r · min^-1离心20 min,收集上清液,并经细菌过滤器(孔径0.22 μm)过滤,即得无菌发酵液。将活化的大丽轮枝菌菌饼接种至100 mL察氏培养基中,26 ℃、220 r · min^-1摇床培养4~6 d,用双层纱布除去菌丝,获得孢子悬浮液,然后用无菌水稀释至1×10⁵ mL^-1。取0.1 mL孢子稀释液涂布于PDA培养基平板上,等距放置3个牛津杯,向牛津杯中加入拮抗菌株的无菌发酵液150 μL,以不加无菌发酵液的PDA平板为对照,25 ℃培养5 d,测量抑菌圈直径^[21]。

采用凹玻片法^[22]进行测定。分别取10 g · L^-1葡萄糖、1×10⁵ mL^-1大丽轮枝菌孢子悬浮液和无菌发酵液各30 μL滴于凹玻片内,以无菌水代替无菌发酵液作为对照,将凹玻片放于铺有湿润滤纸的培养皿内保持湿度,26 ℃培养。试验设3次重复。每2 h使用显微镜(10×40)观察分生孢子的萌发情况,计算孢子萌发率。孢子萌发率=(萌发孢子数/总孢子数)×100%;孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100%。

将活化后的菌株S12划线接种于NA平板上,30 ℃培养24 h,观察菌落形态,并进行革兰氏染色,显微镜下观察其菌体形态。参考《现代微生物学实验技术》^[19]及《伯杰细菌鉴定手册》^[23]对菌株进行生理生化鉴定。生理生化试验包括:V.P反应、酪素水解、硝酸盐还原、吲哚产生、淀粉水解、过氧化氢酶、硫化氢产生试验、糖发酵试验、柠檬酸盐利用、甲基红试验、耐盐试验、酪氨酸水解等;16S rRNA基因的序列分析:提取菌株S12基因组DNA,采用27F/1492R通用引物对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增,产物经纯化试剂盒纯化后,送上海美吉生物医药科技有限公司测序。将菌株S12的16S rRNA基因序列在GenBank中进行同源性比对。根据比对结果,利用MEGA 4软件中邻接法(Neighbour-joining methods,NJ)构建系统发育树,Bootstrap检验值≥50%,1 000次重复^[24]。

用灭菌牙签蘸取平板中的单菌落,在4种水解酶培养基平板上分别接种5个点,置于30 ℃恒温培养箱中倒置培养。3~5 d后将适量的5%三氯乙酸溶液加入到蛋白酶培养基平板中,静置30 min后弃去多余溶液,观察平板上是否出现透明圈;分别将适量1 mg · mL^-1刚果红染液加入到几丁质培养基和纤维素酶培养基平板中,染色10 min后弃去染液,再加入适量1 mol · L^-1 NaCl溶液洗涤10 min,观察是否有透明圈出现;β-1,3葡聚糖酶培养基平板直接观察是否有透明圈出现。用直尺测量透明圈的直径。

采用PCR法检测拮抗细菌编码合成抗菌肽的基因。提取细菌的基因组DNA,以其为模板扩增抗菌肽合成基因。试验中所扩增的抗菌肽合成基因的种类、引物序列及其片段长度见表1。PCR反应体系为:2×Taq Mastermix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol · L^-1)各1 μL,模板DNA 0.5 μL,ddH₂O 10 μL,总体积25 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,退火(温度见表1)45 s,72 ℃ 1 min,32个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 10 min。

从采集的棉田土壤样品中共分离出152株菌落形态不同的细菌,经平板对峙初筛,共得到对大丽轮枝菌抑菌率大于50%的菌株8株,其中S12的抑菌率为56%;通过复筛获得抑菌圈直径大于15 mm的菌株3株,其中S12的抑菌圈直径为20 mm(图1)。菌株S12经过10次传代后仍然具有较好的拮抗效果,故后续研究均采用菌株S12。

	图 1 菌株S12(左)及其发酵液(右)对 大丽轮枝菌的拮抗作用 Fig. 1 Antagonistic effect of strains 12(center)and fermentation liquid(center)against Verticillium dahliae on PDA plates
图选项

采用凹玻片法,测定菌株S12无菌发酵液对棉花黄萎病病原菌孢子萌发的抑制效果,结果(表2)显示:培养6 h时菌株S12对孢子萌发的抑制率为95.93%;培养8 h时的显微观察(图2)可见,无菌发酵液处理组只有少数孢子萌发,且芽管长度明显较对照组(无菌水)短,说明菌株S12发酵过程中产生了具有强烈抑制分生孢子萌发的活性物质,后续试验对活性物质成分进行了进一步分析。

菌株S12在NA平板上单菌落呈圆形,乳白色,不透明,湿润黏稠状,边缘整齐,表面不光滑微有褶皱,革兰氏染色阳性,菌体呈杆状;该菌株为好氧生长;接触酶、脲酶、明胶水解、淀粉水解、酪氨酸水解、甲基红反应、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用等反应均为阳性;吲哚试验、硫化氢试验等反应为阴性;耐100 g · L^-1 NaCl;利用葡萄糖和甘露醇产酸。

	图 2 显微镜(10×40)下观察菌株S12发酵液对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制作用 Fig. 2 The inhibition effect of strain S12 fermentation liquid on spore germination of V.dahliae under microscope(10×40)
图选项

为进一步确定菌株的分类学地位,测定其16S rRNA基因序列,扩增目的基因序列长度为1 451 bp。将菌株S12的16S rRNA基因序列与GenBank中相关细菌菌株进行比对分析,然后通过MEGA 4软件采用邻接法绘制系统发育树。结果表明:供试菌株与芽孢杆菌属的标准菌株同源相似度都在97%以上,并且与标准菌株NR112686枯草芽孢杆菌处在同一分支(图3),序列相似性高达99.58%。因此,根据16S rRNA基因序列相似性分析,结合形态特征及生理生化试验,确定菌株S12为枯草芽孢杆菌。

	图 3 基于S12菌株及相关菌株的16S rRNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree established using Neighbour-joining method,based on 16S rRNA gene sequences of S12 strain and related strains
图选项

分解真菌细胞壁的酶包括葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等,能够使病原菌菌丝裂解,抑制病原菌生长,最后导致其解体而死亡^[8]。通过对4种酶类进行测定,结果菌株S12能产生蛋白酶,水解圈直径为20 mm(图4);其他水解酶未被检测出。

	图 4 菌株S12产真菌细胞壁水解酶(蛋白酶)的检测 Fig. 4 Activities tests of fungal cell wall degrading enzymes(protease)produced by strain S12
图选项

	图 5 菌株S12的部分抗菌肽合成基因的PCR扩增结果 Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of PCR products of antibiotic peptide genes in strain S12 M.Marker(DL2000);A.srfAA;B.spaS;C.bacA;D.bmyB;E.fenB;F.ituC
图选项

通过PCR方法从拮抗菌S12中扩增得到3个抗菌肽合成基因,分别是srfAA(201 bp)、spaS(375 bp)和bacA(498 bp)(图5),对应的抗菌肽分别是表面活性素(Surfactin)、枯草菌素(Subtilin)和溶杆菌素(Bacylisin)。序列分析表明:菌株S12的srfAA、bacA分别与Bacillus subtilis TU-B-10(CP002905.1)的srfAA、bacA同源性均为99%,spaS与Bacillus subtilis TU-B-10(CP002905.1)和Bacillus subtilis DSM:15029(HQ871873.1)的spaS同源性为99%。由此可知,菌株S12具有合成能强烈抑制真菌生长的表面活性素、枯草菌素和溶杆菌素的潜力^[18]。

新疆地处欧亚大陆中部,远离海洋,四周高山环抱,形成了典型的干旱少雨、昼夜温差大、紫外辐射强等大陆性气候,这些特殊的气候环境使得从新疆地区筛选特殊适应性的菌株资源存在可能。本研究从发病严重棉田的健康棉花植株根际筛选到黄萎病拮抗芽孢杆菌S12,在平板对峙试验和琼脂扩散试验中对棉花黄萎病的病原菌表现出明显的拮抗效果;菌株S12无菌发酵液对病原菌孢子的萌发表现出显著的抑制效果。但有研究报道,拮抗菌的平板抑菌试验效果同盆栽、大田试验的生防效果并不存在相对应的关系^[25]。由于拮抗菌田间试验受地域病菌种类、土壤理化性质、气候条件等多因子影响,应用后防治是否能达到预期效果,是否能稳定持久,还需长时间、多地域的试验^{[26, 27]}。本研究中枯草芽孢杆菌菌株S12的盆栽和田间防治效果还有待进一步验证。

芽孢杆菌具有分布广泛、对人畜无害、能产生内生芽胞、存储期长等优点,是理想的生物制剂菌株资源。另外,芽孢杆菌属菌株在农田土壤中繁殖快且能分泌多种抗菌物质,包括抗生素、抗菌肽、抗菌蛋白等,可以抑制多种植物病菌的生长^[28]。韦巧婕等^[29]通过PCR方法从黄瓜枯萎病拮抗菌B中扩增得到Fengycin、Bacillomycin和Iturin表达的相关基因。本研究中菌株S12除了可分泌蛋白酶外,其基因组中包含Surfactin、Subtilin和Bacylisin表达的相关基因,具有产生表面活性素、枯草菌素和溶杆菌素的潜力。李宝庆等^[30]、谢永丽等^[31]通过高效液相色谱(HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分离纯化了芽孢杆菌菌株BAB-1、RYS41和DR20分泌的抑菌物质并鉴定为脂肽类化合物。下一步工作将对抗菌肽的种类进行分离纯化和鉴定。

综上所述,通过对棉花黄萎病病原菌孢子萌发抑制效果和抗菌肽合成基因分析,枯草芽孢杆菌菌株S12具有一定生防潜力,但其最终能否成功应用于生物防治,还需要从盆栽和田间防效等方面进行深入研究。