文章信息
- 李博, 李伟, 张昊, 张莉莉, 王恬. 2015.
- LI Bo, LI Wei, ZHANG Hao, ZHANG Lili, WANG Tian. 2015.
- 日粮高胆碱水平对宫内发育迟缓猪背最长肌糖酵解的影响
- Effects of high dietary concentrations of choline on longissimus dorsi muscle glycolysis in intrauterine growth retardation pigs
- 南京农业大学学报, 38(2): 324-329
- Journal of Nanjing Agricultural University, 38(2): 324-329.
- http://dx.doi.org/10.7685/j.issn.1000-2030.2015.02.022
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文章历史
- 收稿日期：2014-05-18
近年来,集约化养殖的推广一定程度上提高了动物产品的产量,但也造成了动物营养不平衡。环境应激和管理不当等情况易引起动物子宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)的发生[1]。IUGR胎儿在子宫内发育受到阻碍,严重影响初生体质量和成活率,导致成年后多种代谢疾病的发生。流行病学认为,IUGR动物成年后易出现肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血压等代谢综合征;与正常出生体质量成年动物相比,IUGR动物瘦肉率较低、肉品质较差,对畜牧生产影响巨大[2, 3]。在动物屠宰上市过程中,糖原大量分解产生的乳酸使肌肉组织中pH降低,加剧了IUGR动物的肉质问题[4]。因此通过饲粮添加剂来改善IUGR猪肉品质,并缓解屠宰过程糖原大量分解等问题具有重要意义。
胆碱作为一种水溶性维生素,在动物体内主要以卵磷脂、溶血卵磷脂、磷酸胆碱、乙酰胆碱和神经胆碱等形式存在,在神经、免疫、泌尿和心血管等系统中起重要作用[5]。氯化胆碱作为饲料添加剂,已在畜牧生产中广泛使用。有研究发现,日粮中添加胆碱可以修复大鼠大脑的线粒体功能,提高运动协调能力和记忆学习功能[6];适当添加胆碱可以提高鲤鱼的免疫应答,增强抵抗力及与免疫相关基因的表达量[7]。但迄今,有关胆碱应用的研究主要集中于小鼠、禽类等动物的免疫与氧化应激方面,对猪肌肉糖代谢的研究,特别是对IUGR猪的研究报道较少,因此本试验以IUGR猪为对象,添加高水平胆碱,探讨其对肌肉糖酵解关键酶活性和表达量的影响。 1 材料与方法 1.1 试验材料
本试验在上海永昌猪场选用长白×大白二元杂交猪为试验对象,添加剂氯化胆碱购于山东恩贝集团有限公司(氯化胆碱含量为50%)。 1.2 试验设计
从胎次相近(均为第4胎)、体型相似、正常妊娠(114 d)分娩的12头母猪中挑选正常初生体质量 (NBW)和宫内发育迟缓(IUGR)的新生仔猪各12头,保证所选的每头IUGR均有对应NBW同胞仔猪,IUGR 与NBW仔猪在出生后48 h内分别寄养给2头生理状况相似的母猪(第4胎),随母猪哺乳至23 d断奶后饲喂固体饲料。将NBW仔猪和IUGR仔猪随机分为4组,即NBW+NC(正常胆碱水平日粮)、NBW+HC(添加高胆碱水平日粮)、IUGR+NC与IUGR+HC,每组6头,公母各半。试验猪每重复饲养于一栏,每猪平均占有圈舍1 m2,自由采食和饮水,饲养至200日龄结束。各生长阶段的基础日粮中含有正常含量的胆碱,其营养成分符合或超过英国NRC(1998)的营养需求(表 1)。
| 组成Composition | 饲养阶段/d Feeding stage | |||
| 23~37 | 38~73 | 74~120 | 121~200 | |
| 日粮组成Ingredient | ||||
| 玉米/% Corn | 64.00 | 65.00 | 60.00 | 68.00 |
| 豆粕/% Soybean meal | 26.00 | 25.00 | 26.00 | 24.00 |
| 鱼粉/% Fish meal | 4.00 | 2.00 | 0 | 0 |
| 麸皮/% Wheat bran | 2.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| 小麦/% Wheat | 0 | 0 | 16.00 | 0 |
| L-赖氨酸/% L-Lys | 0.25 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
| 磷酸氢钙/% CaHPO4 | 0.50 | 0.50 | 0.55 | 0.50 |
| 石粉/% Limestone | 0.80 | 0.90 | 0.85 | 0.90 |
| 盐/% Salt | 0.35 | 0.35 | 0.35 | 0.35 |
| 预混料/% Premix | 2.10 | 2.10 | 2.10 | 2.10 |
| 营养组成Nutrient composition | ||||
| 代谢能/(MJ·kg-1) Metabolic energy | 15.54 | 12.47 | 12.58 | 12.53 |
| 粗蛋白/% Crude protein | 21.70 | 18.70 | 15.30 | 17.30 |
| L-赖氨酸/% L-Lys | 1.68 | 1.07 | 0.76 | 0.95 |
| 钙/% Ca | 1.06 | 0.61 | 0.52 | 0.53 |
| 总磷/% Total phosphorus | 0.84 | 0.60 | 0.52 | 0.53 |
| 注: 预混料为每kg饲料提供:8 800 IU维生素A,1 600 IU维生素D,40 mg维生素E,0.4 mg维生素B1,3.6 mg维生素B2,1 mg维生素B6,16 mg烟酸,11 mg泛酸,180 mg氯化胆碱,96 mg Cu,88 mg Fe,76 mg Zn,24 mg Mn,0.4 mg Co,0.4 mg I。 Note: Premix per kilogram of diet:8 800 IU vitamin A,1 600 IU vitamin D,40 mg vitamin E,0.4 mg vitamin B1,3.6 mg vitamin B2,1 mg vitamin B6,16 mg niacin,11 mg pantothenic acid,180 mg choline chloride,96 mg Cu,88 mg Fe,76 mg Zn,24 mg Mn,0.4 mg Co,and 0.4 mg I. |
||||
根据《中国饲料成分及营养价值表(第21版)》计算得到各阶段基础日粮中胆碱含量(表 2)。通过以氯化胆碱替代等量的玉米得到胆碱日粮,使其中胆碱含量为基础日粮的2倍(表 2)。IUGR仔猪的选择参照Xu等[8]方法,统计分析试验猪场近2年仔猪初生体质量数据,计算平均数和标准差,将体质量小于该场仔猪平均体质量两个标准差的仔猪确定为IUGR仔猪[初生体质量为:NBW,(1.5±0.2)kg;IUGR,(0.75±0.2)kg]。试验期间断牙、断尾、去势、常规补铁与免疫等均按照猪场相关规程操作。
| g·kg-1 | ||||||||
| 项目Item | 饲养阶段/d Feeding stage | |||||||
| 23~37 | 38~73 | 74~120 | 121~200 | |||||
| NC | HC | NC | HC | NC | HC | NC | HC | |
| 50%氯化胆碱添加量50% Choline chloride addition | 0 | 3.60 | 0 | 3.23 | 0 | 3.12 | 0 | 3.03 |
| 计算值Calculated level | ||||||||
| 添加量Choline addition | 0 | 1.34 | 0 | 1.20 | 0 | 1.16 | 0 | 1.13 |
| 总胆碱Total choline | 1.34 | 2.68 | 1.20 | 2.40 | 1.16 | 2.32 | 1.13 | 2.26 |
| 分析值Analyzed level | ||||||||
| 总胆碱Total choline | 1.59 | 2.98 | 1.33 | 2.77 | 1.40 | 2.71 | 1.40 | 2.75 |
| 氯化胆碱Choline chloride | 0.08 | 1.73 | 0.24 | 1.56 | 0.25 | 1.50 | 0.25 | 1.45 |
| 注: NC=基础日粮(正常胆碱水平日粮);HC=高胆碱日粮(胆碱水平为基础日粮的2倍)。根据《中国饲料成分及与营养价值表(第21版)》计算日粮的总胆碱含量。 Note: NC=Basal diet(Normal level choline diet);HC=Basal diet with high level choline addition(the content of choline in HC is twice of NC). The total dietary choline is calculated according to the Chinese Feed and Nutrients(21 edition). | ||||||||
当仔猪饲养至200日龄时,对所有试验猪进行空腹称体质量,每组随机选择4头,公母各半,高压电极击晕后放血致死,迅速解剖,取左侧背最长肌5 g,置于-20 ℃冰箱保存。另取2 g于离心管中-80 ℃保存,留作后期试验分析。 1.4 指标的测定与方法 1.4.1 肌肉组织中糖原和乳酸含量及糖酵解潜值的测定
取肌肉组织制备10%组织匀浆液。匀浆上清液中总蛋白含量采用BCA法测定,糖原(glycogen,GLY)、乳酸(lactic acid,LC)含量的检测按南京建成生物技术研究所试剂盒说明进行。糖酵解潜值(glycolytic potential,GP)计算公式如下:GP=2×糖原的含量+乳酸的含量。 1.4.2 肌肉组织中糖代谢酶活性的测定
取肌肉组织制备10%组织匀浆,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)检测按南京建成生物技术研究所试剂盒说明进行。 1.4.3 肌肉组织中糖酵解基因的测定
测定肝脏中糖异生关键酶糖原合酶(glycogen synthase,GS)、葡萄糖转运载体(glucose transporters-4,GLUT4)、M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)以及M-型6磷酸果糖激酶(phosphofructokinase M,PFKM)的mRNA表达量的变化。取80 mg肝脏组织样品加入1 mL Trizol(试剂购自Invitrogen公司),按照说明书的步骤进行RNA提取。使用NanoDrop1000测定所提取的RNA的纯度和浓度,RNA的完整性通过10 g ·L-1琼脂糖凝胶电泳确认。按照PrimeScriptTM说明书要求进行反转录后,其产物cDNA于-20 ℃保存。使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行qRT-PCR,所用仪器为德国ABI Step One Plus Real-Time PCR System。特异性引物由Invitrogen公司设计并合成(表 3)。PCR程序为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,40个循环。目的基因的相对表达含量以β-actin为内参,采用比较2-ΔΔCT法进行计算。
| 基因 Gene | GenBank登录号 GenBank accession No. | 序列(5′→3′) Sequence | 目的产物长度/bp Product size |
| β-actin | XM003357928 | F/R:GCGGGACATCAAGGAGAAG/GTTGAAGGTGGTCTCGTGG | 216 |
| GS | NC_010448.3 | F/R:ATGACTCCTCGGACCCTATCTT/ACGTGACCAGTGTTGCTGA | 222 |
| GLUT4 | NM001128433.1 | F/R:ACCTAAGACAAGATGCCGTCG/TGTAGCCAAACTGCAGGGAG | 133 |
| PKM2 | NC_010449.4 | F/R:TTAGCGGCAGCTTTGATAGTTC/CACAATGACCACATCTCCCTTC | 264 |
| PFKM | NM001044550.1 | F/R:GGGCCGATGCTGCCTATATT/TGTCGAAGATGCCTTTCCCC | 195 |
试验数据采用Excel 2010进行初步整理后,用SPSS 16.0软件进行统计分析,采用GLM模型分析比较主因素(胆碱与IUGR)及其交互作用对猪肌肉糖代谢指标的影响。 2 结果与分析 2.1 日粮高胆碱水平对IUGR猪背最长肌糖原和乳酸含量及糖酵解潜值的影响
如表 4所示:与正常组猪相比,IUGR猪肌糖原含量显著下降(P<0.05),但肌肉中乳酸含量显著升高(P<0.05),且IUGR猪糖酵解潜值(GP)显著升高(P<0.05);高胆碱水平日粮有增加其肌肉中糖原含量的趋势(P=0.051),且有降低乳酸含量(P=0.091)和GP值(P=0.074)的趋势。另外,IUGR与胆碱对其肌糖原、乳酸及GP值的影响均不存在交互作用。
| 项目 Item |
含量Content | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NBW+NC | NBW+HC | IUGR+NC | IUGR+HC | 种类Type | 胆碱Choline | 种类×胆碱Type×choline | ||
| 糖原/(mg·g-1) Glycogen | 0.187 | 0.238 | 0.153 | 0.168 | 0.008 | 0.005 | 0.051 | 0.252 |
| 乳酸/(mmol·g-1) LC | 0.230 | 0.228 | 0.373 | 0.283 | 0.013 | 0.002 | 0.091 | 0.104 |
| 糖酵解潜值GP | 0.664 | 0.655 | 0.730 | 0.670 | 0.009 | 0.041 | 0.074 | 0.169 |
| 注:NBW:正常体质量新生仔猪The normal body weight piglets;IUGR:宫内发育迟缓新生仔猪Intrauterine growth retardation piglets | ||||||||
从表 5可以看出:IUGR猪LDH酶活性有提高的趋势(P=0.057),但其CK、SDH的酶活性变化不显著(P>0.05),在饲料中添加高水平胆碱后,其CK酶活性显著升高(P<0.05),但对LDH、SDH酶活性的影响不显著(P>0.05)。另外,IUGR与胆碱对其肌肉组织糖代谢酶活性的影响均不存在交互作用。
| 酶 Enzymes |
酶活性/(U·mg-1) Enzyme activity | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NBW+NC | NBW+HC | IUGR+NC | IUGR+HC | 种类Type | 胆碱Choline | 种类×胆碱Type×choline | ||
| 乳酸脱氢酶LDH | 8.908 | 10.09 | 10.66 | 10.75 | 0.287 | 0.057 | 0.288 | 0.364 |
| 肌酸激酶CK | 0.182 | 0.291 | 0.233 | 0.257 | 0.012 | 0.717 | 0.018 | 0.109 |
| 琥珀酸脱氢酶SDH | 1.479 | 1.390 | 1.332 | 1.457 | 0.046 | 0.671 | 0.848 | 0.269 |
| Note:LDH:Lactate dehydrogenase;CK:Creatine kinase;SDH:Succinate dehydrogenase | ||||||||
从表 6可以看出:与正常组猪相比,IUGR猪GS mRNA表达量显著降低(P<0.05),且GLUT 4 mRNA表达量有降低的趋势(P=0.074),同时PKM 2 及PFKM mRNA的表达量显著提高(P<0.05)。在日粮中添加高水平胆碱后,IUGR猪GS和GLUT 4 mRNA的表达量显著升高(P<0.05),且PFKM mRNA表达量有下降的趋势(P=0.087),但PKM 2 mRNA表达量无显著变化(P>0.05)。另外,IUGR与胆碱对其肌肉组织糖酵解基因的影响均不存在交互作用。
| 基因 Gene |
基因表达量Expression level of mRNA | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NBW+NC | NBW+HC | IUGR+NC | IUGR+HC | 种类Type | 胆碱Choline | 种类×胆碱Type×choline | ||
| GS | 1.005 | 1.153 | 0.716 | 1.084 | 0.056 | 0.034 | 0.005 | 0.168 |
| GLUT4 | 1.001 | 1.152 | 0.704 | 1.057 | 0.048 | 0.074 | 0.029 | 0.323 |
| PKM2 | 1.003 | 1.206 | 1.804 | 1.969 | 0.135 | 0.020 | 0.514 | 0.946 |
| PFKM | 1.003 | 0.949 | 1.163 | 1.020 | 0.040 | 0.048 | 0.087 | 0.415 |
| 注: GS:糖原合酶Glycogen synthase;GLUT 4 :葡萄糖转运载体Glucose transporters-4;PKM 2 :M2-型丙酮酸激酶Pyruvate kinase M2;PFKM:M-型6磷酸果糖激酶Phosphofructokinase M | ||||||||
在集约化养殖模式下,由于追求高产仔数,大约有15%~20%的新生仔猪受到IUGR的影响。研究表明,IUGR会降低猪出栏时的肉品质,致使猪肉市场价格下降[9]。近年来,通过向日粮中添加一些特定的营养性添加剂可改善猪出栏时的肉品质。肌肉糖代谢是影响屠宰后肉品质的关键因素之一。Stephens等[10]研究报道,屠宰后肌肉组织中肌糖原在无氧条件下发生酵解,产生乳酸,导致肉的pH值降低,影响肉品口感及色泽等。
肌糖原主要为肌肉收缩提供能量,其在屠宰后的分解情况是决定肉质优劣的关键因素,本试验发现,IUGR猪肌糖原含量显著下降,乳酸含量显著升高,Thorn等[11]试验发现IUGR猪肌糖原大量分解,乳酸含量升高,与在其他动物如小鼠[12]、反刍动物[13]的研究结果一致。这可能是造成IUGR猪pH值较低、肉质较差的主要原因。GP主要是用来衡量动物肌肉中含有的通过糖酵解作用产生乳酸的底物(如肌糖原、6-磷酸-葡萄糖和葡萄糖)以及乳酸的总量,一定程度上反映了pH值高低[14]。另外,本试验发现IUGR猪GP含量显著升高,与Magnusson等[15]、Thorn等[16]研究结果一致。可见IUGR猪肌肉糖原大量分解,糖酵解潜能显著提高,乳酸含量升高,从而可能影响胴体质量。在日粮中添加高水平胆碱后,IUGR猪肌糖原含量有升高的趋势,且乳酸含量有降低的趋势,同时GP也有降低趋势。边连全等[17]在肉鸡试验上发现,胆碱日粮可以提高肉质pH值,降低乳酸含量。研究表明,胆碱对线粒体内脂肪酸氧化功能有显著影响[18],在Pemt-/-大鼠模型中,高胆碱日粮在降低大量脂肪累积的同时,使TG大量分解进入线粒体进行β-氧化,从而产生更多的乙酰辅酶A流向三羧酸循环[19],而线粒体有氧氧化的增强可提高机体能量供给水平[20],ATP供给增多,也就降低了糖原作为一种能源物质的利用分解,故保存了肌糖原。这可能是高胆碱日粮降低糖原分解的原因之一。可见胆碱延缓了猪肌糖原分解的速度,同时可改善猪肌肉酸解程度。
乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解中的关键限速酶,对糖原分解有重要作用。本试验发现IUGR猪有提高LDH酶活性的趋势,同Lee等[21]试验结果一致。但Nakajima等[22]研究发现,IUGR个体LDH酶活性没有显著变化,而当饲料中添加高水平胆碱后,肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性显著升高。研究表明肌酸激酶的含量与机体受损伤程度密切相关[23],其活力的高低可作为评价肉品质量的指标之一[24]。这可能由于胆碱减少了IUGR猪糖原的大量分解,使肌肉组织中葡萄糖含量有所降低,从而使CK活性提高。周秀菊等[25]认为,肌肉组织中高血糖对CK作用明显,可显著降低CK基因表达。另外,高胆碱日粮在促进线粒体氧化分解产生大量ATP,而ATP的升高与CK活性的增加密切相关[26];同样Perry等[27]认为当机体运动后,ATP大量增强,CK活性显著升高。可见IUGR猪有降低糖酵解酶活性的趋势,而胆碱日粮有缓解其快速酵解的趋势,改善IUGR的不良影响。
为进一步研究其影响机制,本试验对糖酵解关键酶的mRNA表达量进行测定。糖原合成酶(GS)是催化糖原合成途径不可逆反应的关键酶,其表达量的多少决定了糖原代谢程度,影响糖原的合成。葡萄糖转运载体(GLUT4)是骨骼肌细胞中主要的葡萄糖转运载体,而在肌肉糖原无氧分解中的大多数可逆反应中,M2-型丙酮酸激酶(PKM2)和M-型6磷酸果糖激酶(PFKM)催化的反应是不可逆的,是糖无氧分解途径流量的重要环节。研究表明[28],PKM 2 mRNA表达量下调时,葡萄糖的消耗量和乳酸生成量均显著降低。本试验发现,IUGR猪背最长肌GS的表达量显著降低,且GLUT 4 mRNA表达量有降低趋势,同时IUGR猪背最长肌PKM 2 及PFKMmRNA的表达量显著提高,可见IUGR猪的糖原合成作用降低,葡萄糖转运能力下降,糖酵解作用显著增强,表现为肌糖原含量降低,乳酸含量显著升高。Tsirka等[29]也表明IUGR会下调GLUT 4 mRNA的表达量。但Magnusson等[15]认为IUGR个体PKM 2 的表达量没有显著变化。而在日粮中添加高水平胆碱后,GS的表达量有增加的趋势,GLUT 4 mRNA的表达量显著升高,且有降低PFKM mRNA表达量的趋势,这与Hartwell等[30]的研究一致。胆碱可提高糖酵解关键酶的表达量,可见胆碱可缓解肌糖原大量分解,并降低糖酵解关键酶活性,减少肌肉组织中乳酸的累积。
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