由尖孢镰刀菌寄生引起的植物枯萎病是一类毁灭性的真菌土传病害,该类病原菌从植株根部侵染,引起维管束病变,造成植株枯死,在植株的各个生育期均可发生^[1],造成田间普遍减产20%~30%,严重的田块可达50%~60%,甚至绝产^[2]。尖孢镰刀菌病原菌存在着种下分化,可侵染多种植物寄主,具有多种寄主专化型。其中:尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)^[3]、黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumbrum,FOC)^[4]和甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis,FOM)^[5]严重危害西瓜、黄瓜和甜瓜产业的发展。

目前,对于该病的防治方法主要有农业防治、抗病育种、化学防治和生物防治^[6],但这些方法的防治效果仍然具有一定的局限性,不能有效控制该病害的蔓延。在荷兰、挪威、以色列等国家,连作生物障碍问题同样比较突出,但发达国家可以采取国家补贴等形式实行休耕^[7]。我国人多地少,相当部分的劳动者对连作生物障碍缺乏认识,有效防治相当困难,因此,不断开发出防控该病害新的有效措施,是关系到我国该类产业可持续发展的重大技术问题。

本实验室前期研究表明,基于碳酸氢铵的土壤熏蒸能够有效降低高发枯萎病蕉园土壤中病原菌的数量,从而降低下茬作物的发病率^{[8, 9]},初步推测机制为产氨类物质可以抑制真菌的生长^[10]。氨在土壤中能够被迅速转化为亚硝酸盐,再进一步转化为硝酸盐,有报道称该类中间产物能够有效抑制土壤中的有害线虫,但其对于尖孢镰刀菌的影响依然未知^[11]。本研究旨在比较碳酸氢铵及其中间转化产物对尖孢镰刀菌的抑制效果,从而进一步探讨碳酸氢铵抑制病原菌的机制,为其在枯萎病防治的实际应用中提供理论支撑。

供试菌株:枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型(FON)^[12],由江苏省农业科学院提供。尖孢镰刀菌黄瓜专化型(FOC)^[13]和尖孢镰刀菌甜瓜专化型(FOM)^[14]由国家有机类肥料工程技术研究中心提供。

供试试剂:碳酸氢铵(NH₄HCO₃)为分析纯,购自上海久亿化学试剂有限公司;亚硝酸钠(NaNO₂)为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;硝酸钠(NaNO₃)为分析纯,购自上海晶纯生化科技股份有限公司;硝化抑制剂双氰胺(C₂H₄N₄)为分析纯(纯度为99.7%),购自天津东尚工贸有限公司。

培养基:PDA培养基^[15];尖孢镰刀菌选择性培养基^[16]:K₂HPO₄ 1 g、MgSO₄ 0.5 g、Fe-Na-EDTA 0.01 g、L-天门冬酰胺2 g、D-半乳糖20 g、KCl 0.5 g、琼脂20 g、水1 000 mL,121 ℃灭菌20 min。培养基冷却至60 ℃以下,每1 000 mL加入五氯硝基苯1 g、牛胆汁0.5 g、Na₂B₄O₇ · 10H₂O 1 g、硫酸链霉素0.3 g,最后用10%(体积分数)磷酸将pH值调至3.8~4.0。

供试土壤:健康水稻土,取自南京农业大学校园内,土壤类型为黄棕壤,pH 7.33,有机质26.44 g · kg^-1,全氮1.75 g · kg^-1,速效磷126.2 mg · kg^-1,速效钾111.5 mg · kg^-1。

将FOC、FON和FOM接种到PDA平板,于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养10 d后,向平板中加入10 mL无菌水,使孢子丝浸湿于水中,用灭菌的载玻片将孢子丝刮到灭菌的三角瓶中,最后用灭菌的3层纱布过滤以去除菌丝体碎片,利用血球计数板测定孢子液浓度。

取容积为350 mL的组培瓶,加入100 g含水量为5%的健康土壤,分别加入10 mL浓度为10⁷ mL^-1的FOC、FON和FOM孢子液到土壤中,再加适量水使土壤含水量为30%左右,置于培养箱培养1周左右,使得病原菌在土壤中稳定存活,备用。

共设3个试验:1)碳酸氢铵对尖孢镰刀菌抑制作用试验:向土壤中加入不同质量的碳酸氢铵,使其含量分别为0(对照)、1、2、3和4 g · kg^-1(以干土计,下同);2)双氰胺对碳酸氢铵抑尖孢镰刀菌作用的影响试验:向土壤中加入不同质量的硝化抑制剂双氰胺,使其含量分别为0、0.2、0.6和1.0 g · kg^-1,作为双氰胺组;向土壤中加入2 g · kg^-1的碳酸氢铵和不同质量的双氰胺,使双氰胺的含量分别为0、0.2、0.6和1.0 g · kg^-1,作为碳酸氢铵+双氰胺组;3)亚硝酸钠对土壤中尖孢镰刀菌的抑制作用试验:向土壤中加入不同质量的亚硝酸钠,使其含量分别为0、1、2、3和4 g · kg^-1。每个处理3个重复。培养箱中密封放置1周后,每个组培瓶中均匀取5 g土壤样品,采用梯度稀释平板计数法对3种尖孢镰刀菌(FOC、FON和FOM)计数^[15],方法如下:将土壤样品稀释成10^-1、10^-2、10^-3和10^-4不同梯度稀释液,用无菌吸管各取0.1 mL涂布于尖孢镰刀菌选择性培养基平板中,于28 ℃恒温培养箱中培养72 h后计数。尖孢镰刀菌数量以每克土壤干质量计算,以CFU · g^-1表示。

分别制备1 mol · L^-1的碳酸氢铵溶液、亚硝酸钠溶液和硝酸钠溶液,用0.22 μm微孔滤膜分别将3种溶液过滤除菌后备用。将一定量的3种溶液分别加入冷却至50 ℃以下的PDA培养基中并倒平板备用。固体培养基中碳酸氢铵、亚硝酸钠和硝酸钠的终浓度均分别为:0(对照)、5、10、15和20 mmol · L^-1。在PDA平板中央用直径为5 mm的打孔器分别接种尖孢镰刀菌(FOC、FON和FOM)菌块各1块,每个处理设置3个重复,于28 ℃恒温培养箱下培养3 d后,观察3种尖孢镰刀菌生长情况。

共设4个处理:PDA-CK:PDA培养基(pH 6.5);AB-CK:加入碳酸氢铵溶液终浓度为15 mmol · L^-1 PDA培养基(pH 7.5);PDA-T:PDA培养基(pH 7.5);AB-T:加入碳酸氢铵溶液终浓度为15 mmol · L^-1 PDA培养基(pH 6.5)。培养基的pH值通过加入用滤膜过滤除菌的NaOH溶液和稀盐酸来调节,用pH计进行测定。每种培养基分别用直径为5 mm的打孔器接种尖孢镰刀菌(FOC、FON和FOM)菌块各1块,每个处理设置3个重复,于28 ℃恒温培养箱下培养3 d后,观察3种尖孢镰刀菌生长情况。

试验数据采用Excel 2003和SPSS 18.0软件进行分析,使用最小显著差异法(least significant difference,LSD)检验进行多重比较。

从图 1可知:随着土壤中碳酸氢铵含量的增加,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM数量逐级减少。与对照(碳酸氢铵含量为0 g · kg^-1)相比,碳酸氢铵含量为1 g · kg^-1时,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的数量分别下降了45.73%、37.86%和46.48%;碳酸氢铵含量为2 g · kg^-1时,分别下降了91.43%、75.68%和55.83%;碳酸氢铵含量为3 g · kg^-1时,分别下降了97.86%、93.23%和81.37%;碳酸氢铵含量为4 g · kg^-1时,分别下降了99.85%、99.59%和97.70%。这表明:碳酸氢铵到达一定含量时,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM在土壤中可减少95%以上,说明碳酸氢铵可以有效降低土壤中尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的数量。

图 1 不同含量的碳酸氢铵对土壤中不同尖孢镰刀菌数量的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of ammonium bicarbonate on the numbers of Fusarium oxysporum in soil 1)FOC:尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.cucumbrum;FON:尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.niveum;FOM:尖孢镰刀菌甜瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.melonis 2)不同小写字母表示在0.05水平差异显著。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level in different treatments. The same as follows.

图选项

从图 2可以看出:土壤中只加入含量为0、0.2、0.6和1.0 g · kg^-1的双氰胺对尖孢镰刀菌的生长没有影响,同时加入碳酸氢铵和双氰胺时,尖孢镰刀菌的数量随双氰胺含量的增加而增加,对照(双氰胺含量为0 g · kg^-1)中尖孢镰刀菌的数量最少。试验结果表明,适量的双氰胺本身对尖孢镰刀菌生长无影响,碳酸氢铵可以抑制尖孢镰刀菌生长,而双氰胺抑制了硝化作用,进而抑制了碳酸氢铵对尖孢镰刀菌的抑制作用,且随双氰胺含量增加抑制作用显著提高,推测硝化作用产物亚硝酸根和硝酸根具有抑制尖孢镰刀菌功能。

	图 2 不同含量双氰胺对尖孢镰刀菌FOC(A)、FON(B)和FOM(C)生长的影响以及对碳酸氢铵抑菌作用的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of dicyandiamide on the number of FOC(A),FON(B) and FOM(C)and on the antifungal effect of ammonium bicarbonate
图选项

由图 3可见:随着土壤中亚硝酸钠含量的增加,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的数量显著减少。相比于对照(亚硝酸钠含量为0 g · kg^-1),亚硝酸钠含量为1 g · kg^-1时,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的数量分别下降了15.08%、47.54%和22.78%;亚硝酸钠含量为2 g · kg^-1时,分别下降了56.17%、84.57%和93.03%;亚硝酸钠含量为3 g · kg^-1时,分别下降了73.29%、91.35%和98.10%;亚硝酸钠含量为4 g · kg^-1时,分别下降了92.46%、96.91%和99.49%。结果表明,亚硝酸钠对土壤中的尖孢镰刀菌具有显著抑制作用,且随含量增加抑制效果增强。

	图 3 不同含量的亚硝酸钠对尖孢镰刀菌生长的影响 Fig. 3 Effects of different concentrations of sodium nitrite on the numbers of Fusarium oxysporum in soil
图选项

尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM在含碳酸氢铵培养基上的生长情况如图 4所示,结合表 1的数据可知,随着碳酸氢铵浓度的增加,菌落直径逐渐减小,对照平板上的菌落直径最大,差异显著。当碳酸氢铵浓度为20 mmol · L^-1时,3种尖孢镰刀菌专化型均停止生长,表明碳酸氢铵可以抑制尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的生长。

	图 4 含碳酸氢铵培养基对尖孢镰刀菌生长的影响< Fig. 4 Effects of the ammonium bicarbonate on the growth of Fusarium oxysporum in plates CK:不加碳酸氢铵的PDA培养基PDA medium without ammonium bicarbonate;5、10、15、20:含5、10、15、20 mmol · L-1碳酸氢铵的PDA培养基PDA medium containing 5,10,15,20 mmol · L-1 ammonium bicarbonate,respectively.
图选项

含不同浓度亚硝酸钠培养基对尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM生长的影响如图 5所示,结合表 2数据可知:亚硝酸钠浓度为5和10 mmol · L^-1时,FOC菌落直径大小与对照差异不显著;亚硝酸钠浓度为15和20 mmol · L^-1时,菌落直径显著小于亚硝酸钠浓度为5和10 mmol · L^-1的处理,且浓度为20 mmol · L^-1时的菌落直径显著小于15 mmol · L^-1的处理。亚硝酸钠浓度为5 mmol · L^-1时,FON和FOM菌落直径大小与对照 差异不显著;亚硝酸钠浓度为10和15 mmol · L^-1时,菌落直径均显著小于对照;亚硝酸钠浓度为20 mmol · L^-1 时,菌落直径均显著小于低浓度处理和对照。推测低浓度的亚硝酸钠对尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM的生长抑制作用不显著,而高浓度的亚硝酸钠可以抑制其生长。

	图 5 含亚硝酸钠培养基对尖孢镰刀菌生长的影响 Fig. 5 Effects of sodium nitrite on the growth of Fusarium oxysporum in plates CK:不加亚硝酸钠的PDA培养基PDA medium without sodium nitrite;5、10、15、20:含5、10、15、20 mmol · L-1亚硝酸钠的PDA培养基PDA medium containing 5,10,15,20 mmol · L-1 sodium nitrite,respectively.
图选项

含不同浓度硝酸钠培养基对尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM生长的影响如图 6所示,结合表 3数据可知,硝酸钠浓度为5、10、15和20 mmol · L^-1时,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM菌落直径与对照相比差异不显著,表明不同浓度的硝酸钠对尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM生长无显著性影响。

	图 6 含硝酸钠培养基对尖孢镰刀菌生长的影响 Fig. 6 Effects of sodium nitrate on the growth of Fusarium oxysporum in plates CK:不加硝酸钠的PDA培养基PDA medium without sodium nitrate;5、10、15、20:含5、10、15、20 mmol · L-1硝酸钠的PDA培养基PDA medium containing 5,10,15,20 mmol · L-1 sodium nitrate,respectively.
图选项

由于碳酸氢铵溶液呈碱性,加入培养基后会使得培养基pH值发生变化。115 ℃灭菌30 min后的PDA培养基pH值为6.5,加入碳酸氢铵溶液终浓度为15 mmol · L^-1的PDA培养基pH值为7.5。为了探究pH值变化是否对尖孢镰刀菌生长产生影响,本研究通过用稀盐酸将含15 mmol · L^-1碳酸氢铵的PDA培养基pH值调节为6.5,用1 mol · L^-1NaOH溶液将PDA培养基pH值调节为7.5。恒温培养3 d后,尖孢镰刀 菌FOC、FON和FOM生长的影响如图 7所示,结合表 4数据可知:pH值分别为6.5和7.5时,含15 mmol · L^-1 碳酸氢铵培养基上的菌落直径均显著小于不含碳酸氢铵的PDA培养基,表明在一定pH值范围内,碳酸氢铵均可抑制尖孢镰刀菌的生长。同时,当pH值分别为6.5和7.5时,PDA培养基(PDA-CK和PDA-T)上尖孢镰刀菌菌落大小无显著性差异,而含碳酸氢铵的PDA培养基(AB-CK和AB-T)菌落直径具有显著性差异。这表明:pH值在一定范围内的改变不会对PDA培养基中的尖孢镰刀菌的生长有明显的影响,碳酸氢铵抑制尖孢镰刀菌生长与pH值的改变有关,但不完全取决于pH值的改变。

图 7 pH值变化对平板上碳酸氢铵抑制尖孢镰刀菌作用的影响 Fig. 7 Effects of pH value variation on the suppression on Fusarium oxysporum by ammonium bicarbonate in plates PDA-CK:PDA培养基(pH 6.5) PDA medium with pH 6.5;PDA-T:PDA培养基(pH 7.5) PDA medium with pH 7.5;AB-CK:含15 mmol · L-1碳酸氢铵的PDA培养基(pH 7.5) PDA medium containing 15 mmol · L-1 ammonium bicarbonate(pH 7.5);AB-T:含15 mmol · L-1碳酸氢铵的PDA培养基(pH 6.5) PDA medium containing 15 mmol · L-1 ammonium bicarbonate(pH 6.5)

图选项

本研究初步探讨了碳酸氢铵抑制尖孢镰刀菌生长的机制,土壤培养试验初步表明,碳酸氢铵和亚硝酸钠对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用。而加入硝化抑制剂双氰胺后,碳酸氢铵对尖孢镰刀菌的抑制作用受到限制。硝化抑制剂双氰胺可以抑制铵态氮的硝化作用,不仅降低NH₄⁺-N的挥发损失,而且延缓其转化为NO₃^--N的速度^[18],具有专性亚硝化抑制作用^[19]。将双氰胺加入土壤中可以使铵态氮大量积累,硝态氮减少,而碳酸氢铵对尖孢镰刀菌的抑制作用减弱甚至丧失,因此,可以初步推断,土壤中碳酸氢铵的抑制病原菌作用可能与其代谢产物亚硝酸有关。本研究又向土壤中直接加入不同含量的亚硝酸钠,结果表明亚硝酸钠能够降低尖孢镰刀菌的数量,由此可见土壤中尖孢镰刀菌数量的降低应该与亚硝酸钠有关。Riga等^[20]的研究同样表明,在一定浓度下亚硝酸钠对真菌菌丝有致死作用,类似的亚硝酸盐对土传病原菌或线虫有抑制作用的报道已有不少^{[21, 22, 23]}。

平板培养试验进一步表明:在一定范围内随着碳酸氢铵浓度的增加,尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM生长受抑制的程度逐渐增强,这与柳丽梅等^[24]的研究结果类似,碳酸氢铵对意大利青霉菌丝体生长有显著抑制作用,且抑制效果有显著的浓度效应。低浓度的亚硝酸钠对尖孢镰刀菌FOC、FON和FOM生长无显著抑制作用,而高浓度的亚硝酸钠对其生长具有抑制作用。谢红霞^[25]同样研究发现,亚硝酸钠对红色毛癣菌菌丝有破坏作用,且在80~160 mmol · L^-1范围内随着亚硝酸钠浓度的增加,对菌丝形态改变的影响逐渐增强。硝酸钠对尖孢镰刀菌生长无显著影响,同样国内外也未见硝酸钠抑制真菌生长的报道。

此外,碳酸氢铵加入PDA培养基中使培养基的pH值升高,本研究结果表明,在一定范围内只改变PDA培养基的pH值不会对尖孢镰刀菌生长有影响,当PDA培养基中含有碳酸氢铵时,改变培养基的pH值会对尖孢镰刀菌的生长具有一定影响,pH值变小后碳酸氢铵对尖孢镰刀菌的抑制作用稍有减弱。这与Palmer等^[26]的研究结论一致,碳酸氢铵对灰霉病菌(Botrytis cinerea)的生长有抑制作用,抑制作用与pH值的改变有关,但不完全取决于pH值的改变。

综上所述,土壤中碳酸氢铵与亚硝酸钠对尖孢镰刀菌均具有抑制作用;碳酸氢铵与亚硝酸钠均能够抑制平板上病原菌的生长,且碳酸氢铵抑制尖孢镰刀菌的作用与其中间产物亚硝酸有关。研究结论能够为实际生产中碳酸氢铵抑制土壤中尖孢镰刀菌方面的应用提供理论依据。