大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)能够引起大豆北方茎溃疡,是北美大豆上最重要的毁灭性的病害之一。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤,并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80%的植株受到侵染。由此造成的产量损失高达50%^[1]。近年来该病害发展迅速,除美国外,阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭和意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区都有发生危害的报道^{[2, 3, 4, 5]}。因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道,我国将其列为重点关注的大豆上13种检疫性病原菌之一^[6]。为了阻止大豆北方茎溃疡病菌传播范围的不断扩大,使大豆北方茎溃疡得到控制,需要对其进行快速、准确的检测。而传统的检测方法主要有发病组织病原菌的分离,基于PCR技术的限制性片段长度多态性分析(RFLP)^{[7, 8, 9]},但这些检测或需要的检测时间较长,或准确性和灵敏度偏低。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),是日本荣研株式会社的Notomi等^[10]于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物,在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下,60~65 ℃恒温扩增,30~80 min即可观察结果,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂,反应结果可通过是否形成白色沉淀(浑浊)或SYBR greenⅠ染色后的颜色变化来判断,因而在食品检测与病害诊断等领域有着广泛的应用前景^{[11, 12]}。本文建立了一个基于新靶标translation elongation factor 1α(tef 1 α)的环介导等温扩增技术检测大豆北方茎溃疡病菌,在此基础上应用核酸染料SYBR greenⅠ判定反应结果,并对该方法的特异性、灵敏度及该技术的实际检测应用进行了较系统的研究。 1 材料与方法 1.1 材料

Bst DNA聚合酶购自NewEngland Biolabs公司;甜菜碱、MgSO₄购自Sigma公司;dNTP、DL5000 Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司;移液管购自Eppendorf公司和AXYGEN公司;DNAsecure Plant Kit购自天根公司;SYBR greenⅠ染料购自Life Technologies公司;PowerSoil^ DNA Isolation Kit购自MO BIO公司。

供试菌株寄主、来源及数量见表 1。将供试疫霉菌转至V8平板上,其他菌株转至PDA(马铃薯葡萄糖固体培养基)平板上,25 ℃黑暗培养3 d后从菌落边缘切取10块(2 mm×2 mm)菌丝块,疫霉菌菌丝块转移至V8液体培养基,其他菌株菌丝块转移至PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基),25 ℃振荡培养5~7 d,过滤收集菌丝,经冷冻抽干研磨成菌丝粉,-20 ℃保存备用。 1.2 引物设计与筛选

tef 1 α DNA序列源于GenBank网站(GenBank accession No.:JF461466),应用Bioedit软件进行序列分析,并使用PrimerExplore V4软件,设计LAMP引物,从所推荐的100套引物中,通过特异性和灵敏度试验,从中筛选出1套符合要求的LAMP引物(表 2)。引物由英潍捷基贸易有限公司合成,用ddH₂O溶解后分装,-20 ℃冰箱保存备用。 1.3 基因组DNA的提取

取少量菌丝粉,加入900 μL 2% CTAB提取液和90 μL 10% SDS,漩涡混匀,于55 ℃水浴1 h,中间每 10 min上下颠倒几次。12 000 r · min^-1离心10 min,取上清液加等体积酚/氯仿/异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1),颠倒混匀,12 000 r · min^-1离心10 min;将上清液转移至新管,加等体积氯仿,轻轻颠倒混匀,12 000 r · min^-1离心5 min。上清液转移至新管中,加入2倍体积的无水乙醇,-20 ℃静置大于1 h。12 000 r · min^-1离心10 min,倾去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤2次,室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20 μg · mL^-1 RNase),37 ℃处理1 h后-20 ℃保存。 1.4 LAMP反应体系的建立

为了摸索最优的LAMP反应体系,对LAMP反应中的MgSO₄浓度(2~8 mmol · L^-1)、dNTPs浓度(0.2~2.0 mmol · L^-1)、引物浓度(0.2~2.0 μmol · L^-1)、甜菜碱浓度(0.8~1.6 mol · L^-1)、Bst DNA聚合酶添加量(1~10 U · μL^-1)和不同的反应时间(30~90 min)进行优化,确定最终的反应体系为:2.5 μL 10×ThermoPol Buffer,8 mmol · L^-1 MgSO₄,1.2 mmol · L^-1 dNTPs,内引物FIP和BIP各1.6 μmol · L^-1,外引物F3和B3各0.4 μmol · L^-1,环引物LF和LB各0.8 μmol · L^-1,0.8 mol · L^-1甜菜碱,8 U · μL^-1 Bst DNA聚合酶,3 μL模板DNA,灭菌水补至25 μL。64 ℃水浴锅中等温反应60 min。试验至少重复3次。 1.5 LAMP扩增产物判断方法

LAMP反应结束后,可以通过两种方法来判断是否发生了LAMP扩增:1)在反应结束后向体系内加入SYBR greenⅠ染料,观察溶液颜色变化,阳性为荧光绿色,阴性为橙色;2)反应产物经20 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳,观察扩增的条带,出现典型的梯形条带即为阳性。 1.6 特异性检测

分别提取大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、拟茎点种腐病菌、大豆锈菌、胶胞炭疽菌、平头炭疽菌、稻瘟病菌、链格孢菌、球黑孢菌、大豆疫霉菌、苎麻疫霉菌、致病疫霉菌、米曲霉菌、菊池尾孢菌的基因组DNA(表 1),进行LAMP扩增。试验至少重复3次,反应结束后按照1.5节的方法判定反应结果。

大豆北方茎溃疡病菌基因组DNA模板经测定浓度后,进行10倍系列稀释,使得质量浓度梯度依次为100 ng · μL^-1、10 ng · μL^-1、1 ng · μL^-1、100 pg · μL^-1、10 pg · μL^-1、1 pg · μL^-1、100 fg · μL^-1和10 fg · μL^-1。分别取3.0 μL作为LAMP反应模板,试验至少重复3次。反应结束后按照1.5节中加入SYBR greenⅠ的方法判定反应结果。 1.8 人工接种大豆植株的发病组织检测

取6株接种大豆北方茎溃疡病菌6 d后的大豆植株发病组织,每份样本取200 mg鲜组织,按照DNAsecure Plant Kit的说明书提取发病组织DNA,将其作为模板用于LAMP扩增,将大豆北方茎溃疡病菌纯DNA作为阳性对照,以灭菌水作为阴性对照。同时提取接种空白PDA和健康植株DNA作为参照。试验至少重复3次。反应结束后按照1.5节中加入SYBR greenⅠ的方法判定反应结果。 1.9 进口大豆中夹带的大豆植株残体人工添加子囊孢子的检测 1.9.1 DPC子囊孢子悬浮液制备

取已培养好的PDA板上的DPC菌株,加入5 mL无菌水,轻轻将板表面的子囊孢子刮下,将该孢子悬浮液置于已灭菌的50 mL三角瓶内,瓶中预先放置数粒无菌玻璃球,充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤,并用无菌水冲洗滤渣2~3次,最终使滤液体积达到10 mL,即为待测孢子悬浮液。 1.9.2 不同浓度梯度DPC子囊孢子与大豆植株残体样本的混合洗涤液总DNA的提取

进口大豆植株残体(由江苏省出入境检验检疫局提供)作为供试样本(前期检测均不含DPC)。每份样本取10 g,倒入250 mL干净三角瓶中,加入无菌水至200 mL,滴入20%吐温20 3~5滴。加入含不同DPC孢子数量(0、10、50、100、1 000、10 000个)的孢子悬浮液,每个梯度设置3个重复。封住瓶口,置于摇床上200~250 r · min^-1洗涤5 min。以不加入DPC的大豆植株残体样本为阴性对照。洗涤后用200目钢筛将混合液过滤到干净的烧杯中;用少量纯水反复冲洗钢筛上的大豆植株残体,滤液集中到烧杯中。把收集到的滤液分装到50 mL离心管中,7 000 r · min^-1离心5 min,弃上清液,收集沉淀。将沉淀置于37 ℃恒温箱中晾干后按照PowerSoil^ DNA Isolation Kit说明书进行总DNA的提取。 1.9.3 人工添加孢子检测

将上述人工添加不同数量子囊孢子的大豆残体样本总DNA作为模板用于LAMP扩增,以大豆北方茎溃疡病菌纯DNA作为阳性对照。试验至少重复3次。反应结束后按照1.5节中加入SYBR greenⅠ的方法判定反应结果。 2 结果与分析 2.1 针对DPC的tef 1 α-LAMP引物的特异性

以笔者研究设计的特异性引物对大豆北方茎溃疡病菌进行LAMP扩增,以水作为阴性对照,并用其他相近种真菌和疫霉菌(表 1)基因组作为对照以验证引物的特异性。经过60 min的LAMP扩增反应,反应管中加入SYBR greenⅠ染料后,只有含有DPC基因组的反应管产生绿色荧光的阳性反应,其他参试菌均呈橙色的阴性反应(图 1-A)。反应产物经20 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳,大豆北方茎溃疡病菌反应管中出现了典型的梯形条带,而其他参试菌株均没有出现梯形条带(图 2-B)。表明:以SYBR greenⅠ为染料的显色反应可作为检测阳性和阴性的判别标准,并可缩短检测所需的时间。

图 1 LAMP反应的特异性试验 Fig. 1 Specificity of LAMP detection1)A:添加SYBR green Ⅰ 染料的可视化检测The Specificity of LAMP for detection of Diaporthe phaseolorum var.caulivora visualized by SYBR green Ⅰ; B:20 g · L-1琼脂糖凝胶电泳检测Electrophoresis(20 g · L-1)applied to LAMP products from different strains. 2)M.DL5000分子标记DL5000 DNA marker;1~2.100 ng · μL-1大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora;3.大豆南方茎溃疡病菌D.phaseolorum var.meridionalis;4.拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla;5.大豆锈菌Phakopsora pachyrhizi;6.胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides;7.平头炭疽菌Colletotrichum truncatum;8.稻瘟病菌Magnaporthe grisea;9.链格孢菌Alternaria sp.;10.球黑孢菌Nigrospora sphaerica;11.大豆疫霉菌Phytophthora sojae;12.苎麻疫霉菌Phytophthora boehmeriae;13.致病疫霉菌Phytophthora infestans;14.米曲霉菌Aspergillus oryzae;15.菊池尾孢菌Cercospora kikuchii;16.阴性对照Negative control

图选项

	图 2 LAMP反应的灵敏度试验 Fig. 2 Sensitivity of tef 1 α-LAMP method using serially diluted genomic DNA from D.phaseolorum var. caulivora by SYBR greenⅠ1.100 ng · μL-1;2.10 ng · μL-1;3.1 ng · μL-1;4.100 pg · μL-1;5.10 pg · μL-1;6.1 pg · μL-1;7.100 fg · μL-1;8.10 fg · μL-1;9.阴性对照Negative control
图选项

将10倍梯度稀释的大豆北方茎溃疡病菌基因组DNA进行LAMP扩增,结果(图 2)显示:1.2节的引物(表 2)和1.4节的反应体系检测灵敏度为1 pg · μL^-1。

将接种大豆北方茎溃疡病菌6 d后的大豆植株发病组织的基因组DNA进行LAMP扩增。结果(图 3) 显示:该方法能够在人为模拟田间发病组织检测的条件下,排除寄主植物DNA等其他非目标菌的干扰,准确地检测出目标菌。

	图 3 LAMP法检测人工接种大豆发病组织 Fig. 3 Detection of inoculated diseased soybean stem tissue by LAMP assay1.阳性对照Positive control;2~7.接种DPC发病的大豆茎杆Diseased soybean stem tissue of inoculate by D.phaseolorum var.caulivora;8.接种PDA培养基未发病的大豆茎杆Soybean of inoculate PDA;9.健康大豆茎杆Healthy soybean stem tissue;10.阴性对照Negative control
图选项

取口岸截获的进口大豆中夹带的大豆植株残体,经本文研发的检测技术检测确认未携带DPC。提取人工添加不同DPC子囊孢子数量的大豆病残体总DNA进行LAMP扩增(图 4)。该检测技术在10 g大豆植株残体中含有10个DPC子囊孢子的条件下检测出目标病原菌。表明:本方法可用于进口大豆病残体中携带DPC的检测,且灵敏度高,可满足口岸检疫的要求。

图 4 LAMP法检测人工添加DPC子囊孢子大豆病残体 Fig. 4 Detection of soybean residues with different amount of ascospore of D.phaseolorum var.caulivora1.未添加DPC子囊孢子的大豆残体Soybean residues without ascospore;2~6.添加不同数量子囊孢子(10,50,100,1 000,10 000)的大豆残体Soybean residues with different amount of ascospore(10,50,100,1 000,10 000);7.100 ng · μL-1 DPC纯基因组100 ng · μL-1 pure DNA of D.phaseolorum var.caulivora;8.阴性对照Negative control

图选项

大豆北方茎溃疡病菌引起的大豆茎溃疡病对欧洲和美洲的大豆生产造成严重的损失。迄今,该病在我国未有发生的报道,近年来因我国自产大豆不足,大豆进口量日益增加,该病随进口大豆传入我国的危险性加大。研究简便、灵敏、准确的检验检疫技术,提升口岸检疫技术水平,对阻止该病的传入十分必要。本文首次报道应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测大豆北方茎溃疡病菌。相比于普通PCR方法,LAMP扩增技术具有以下优点:1)在恒温条件下(60~65 ℃)就可以进行扩增反应,反应时间可以缩短到1 h左右;2)不需要昂贵的热循环设备,仅需水浴锅或者保温杯即可进行扩增;3)特异性高,针对靶标序列的6个区段设计的4条特异性引物,在完全匹配的情况下才能进行LAMP扩增反应;4)LAMP扩增方法的灵敏度较传统PCR扩增高出10~10³倍;5)可视化检测,在反应结束后,加入荧光染料根据颜色变化就能判断扩增与否,完成一次检测仅需2 h左右,从而能够快速检测^{[13, 14]}。

大豆北方茎溃疡病菌所引起的植株发病症状与其相近种大豆南方茎溃疡病菌、拟茎点种腐病菌引起的植株发病症状通常会形成一个症状复合体^[8],仅凭发病症状很难鉴定是何种病原菌。迄今,普通PCR检测方法仍然难以区分大豆北方茎溃疡病菌与大豆南方茎溃疡病菌。本文研发的针对tef 1 α-LAMP检测技术,能够从携带有DPC的大豆病组织中检测出大豆北方茎溃疡病菌。该技术可以准确区分同一种不同变种、亲缘关系十分相近的大豆南方茎溃疡病菌,证明该检测技术对DPC具有很强的特异性。本文采用的SYBR GreenⅠ染料的检测灵敏度高,且阳性结果和阴性结果颜色差异明显,易于判读。

大豆北方茎溃疡病菌作为我国的口岸检验检疫对象,要阻止该病菌随大豆的进口贸易入侵我国,提高我国口岸的检验检疫技术水平就显得尤为重要。笔者向口岸进口的大豆中夹带的大豆植株残体中人工添加DPC孢子,利用tef 1 α-LAMP检测方法能够在10 g病残体携带10个目标菌的子囊孢子的条件下检测出该病菌,检出率高,表明该技术可以应用于口岸对大豆北方茎溃疡病菌的检验检疫。