Ca²⁺在植物生长发育中起着非常重要的作用,它既是细胞膜和细胞壁的主要组成成分,可以维持细胞壁、细胞膜和膜结合蛋白的稳定性^[1];又是一种信号分子,在细胞内与钙调蛋白(CaM)结合作为第二信使,行使信号转导的功能,当植物受到外界环境改变和內源激素信号等刺激时,胞内的Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_cyt)发生变化,植物感受钙信号,经过信号传递,完成一系列的生理生化反应^[2]。植物缺钙会引起多种并发症,如叶片坏疽、果实腐烂等,严重影响产量;若植物含Ca²⁺过高,则会破坏胞内Ca²⁺的平衡,引起Ca²⁺中毒,磷代谢受到干扰^[3]。植物体内Ca²⁺浓度的调节主要是通过精细的Ca²⁺转运系统来实现的,主要包括:Ca²⁺通道、Ca²⁺-ATPase(Ca泵)和Ca²⁺/H⁺反向转运蛋白(Ca²⁺/H⁺exchanger antiporter,CAX)等^[4]。

CAX是一类重要的跨膜转运蛋白,主要存在于质膜或液泡膜上^[5]。自从大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞质膜上发现Ca²⁺/H⁺反向转运体以后^[6],已在越来越多的植物基因组中克隆或预测到CAX全长和cDNAs开放阅读框(ORF),目前基因组数据中已经有200多个^[7]。据报道CAXs广泛分布于植物、大部分动物、真菌和细菌中,但在哺乳动物、昆虫、线虫的基因组中却不存在^[8]。CAX是Ca²⁺/Cation antiporter(CaCA)大家族的一个进化分化支,也可称为阳离子/H⁺离子交换器(Cation/H⁺exchanger)。它不直接依靠ATP水解供能,而是依赖H⁺-ATPase或H⁺-PPase产生的跨膜质子梯度来驱动Ca²⁺的运输^[9]。研究表明:植物CAXs除具有Ca²⁺反向转运活性外,还可以转运其他金属离子,例如拟南芥AtCAX2可转运Mn²⁺和Cd²⁺,莱茵衣藻CrCAX1和AtCAX4能转运Cd²⁺等^{[10, 11, 12]}。过量表达CAXs可提高植物对Ca²⁺、Cd²⁺或Mn²⁺等金属离子耐受性和累积能力^{[13, 14, 15, 16]},从而降低土壤重金属对植物的毒害。近年来对水稻CAXs的研究发现,OsCAX4不仅可以参与Ca²⁺、Mn²⁺的转运,而且还可以转运Cu^{2+[17]。除此之外,CAX也可转运Na+、K+和Li+等一价阳离子[18]。}

Shigaki等^[9]根据CAXs序列和结构的相似性对其进行归类分析,可将其分成3大类:Ⅰ型(植物以及部分真菌和细菌的CAXs)、Ⅱ型(酵母类似CAXs)和Ⅲ型(大肠杆菌类似CAXs)。Ⅰ型CAXs又可分为A~G 8个不同的亚型,其中植物的CAXs被分为Ⅰ-A型和Ⅰ-B型2个截然不同的亚型^[9]。大部分植物CAXs有11个跨膜结构(TM)和4个典型的功能域:即N-端自抑制区域(NRR)、Ca²⁺功能域(CaD)、C功能域和D功能域;且在TM3~TM4、TM8~TM9之间均含有与离子转运专一性有关的保守氨基酸重复序列c-1和c-2^{[19, 20]}。许宽勇等^[21]对苹果MdCAX1的研究发现,MdCAX1属于Ⅰ-A型,编码350个氨基酸,且其N-末端调节区(NRR)对MdCAX1没有抑制作用,荧光定量PCR分析表明,Ca²⁺、Mn²⁺诱导处理后表达量较对照有大幅度提高。

本文利用生物信息学方法搜索苹果全基因组数据库,鉴定苹果CAXs基因家族成员,分析基因的结构域、序列保守性和其进化关系,并利用实时荧光定量PCR方法分析了MdCAXs家族成员在不同种类盐处理后的表达变化,以期为研究MdCAXs的生物学功能奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 苹果MdCAXs家族基因的确定

用InterProScan 5^[22]分析已克隆的MdCAX 1 基因(登录号为:FJ008871),获得3个主要结构域IPR004713(calcium/proton exchanger)(TIGR00846)、IPR004798(calcium/proton exchanger CAX)(TIGR00378)和IPR004837(sodium/calcium exchanger membrane region)(PF01699)(Na_Ca_ex),下载最新预测的‘金冠’苹果蛋白质组(下载于第8版的Phytozome)建立本地搜索,借助于隐马模型程序HMMER(3.0)^[23],获得潜在的CAX蛋白。从拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org)中下载已注册的6个AtCAXs,其他物种序列下载于NCBI。

1.2 MdCAXs家族基因的生物信息学鉴定

利用MEGA 6.0软件对预测的苹果MdCAXs蛋白序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)、盐地碱蓬(Suaeda salsa)、蓖麻(Ricinus communis)、毛果杨(Populus trichocarpa)、绿豆(Vigna radiata)、裂叶牵牛(Ipomoea nil)、胡菜(Arabidopsis lyrata subsp.lyrata)、桃(Prunus persica)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等NCBI数据库中已收录的CAX序列进行序列同源性分析,并利用邻接算法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,Bootstrap重复设1 000。利用perl程序选取MdCAXs基因的染色体位置信息,并利用MapDraw工具进行染色体定位作图。利用DNAMAN生物学软件进行保守域序列比对分析。

用相关网站分析:氨基酸的理化性质(http://web.expasy.org/protparam/)、跨膜区域预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)、结构功能域预测(http://smart.embl-heidelberg.de/和http://www.ebi.ac.uk/interpro)、亚细胞定位预测(http://psort.hgc.jp/form2.html)。内含子外显子预测参照http://genes.mit.edu/GENSCAN.html。

1.3 MdCAXs基因表达分析

选取同一批生根培养、生长状态一致的‘长富6号’苹果组培苗进行液体培养,培养液为Hoagland营养液,取生长一致的苗进行处理。将材料分成5组,1组为对照(CK),用正常的Hoagland营养液培养,其他4组分别用不同种类的盐处理:Na⁺盐处理,在Hoagland培养液中添加80 mmol · L^-1 NaCl;Ca²⁺盐处理,添加100 mmol · L^-1 CaCl₂;Mg²⁺盐处理,添加50 mmol · L^-1 MgCl₂;Mn²⁺盐处理,添加2 mmol · L^-1 MnCl₂。处理16 h后取根、茎、叶液氮冷冻。采用改良CTAB法^[24]提取RNA,用TaKaRa公司的PrimeScript^ RT reagent Kit进行反转录,cDNA用于实时荧光定量PCR进行表达分析。所用的特异引物和预计产物长度见表 1,所用内参基因为Mdtubulin(GU317944)。

通过搜索苹果全基因组数据库,共获得8个MdCAXs基因家族成员,将这些MdCAXs基因与拟南芥(6个)、水稻(6个)、玉米(2个)、大麦(1个)、盐地碱蓬(1个)、蓖麻(1个)、毛果杨(1个)、绿豆(1个)、裂叶牵牛(1个)、胡菜(1个)、桃(1个)、荠菜(1个)、莱茵衣藻(2个)和酿酒酵母(1个)的CAX基因序列进行系统进化分析(图 1)。结果表明:进化树被分为4个不同的进化分支,其中8个MdCAXs基因与高等植物拟南芥、水稻、玉米、大麦、盐地碱蓬、蓖麻、毛果杨、绿豆、裂叶牵牛、胡菜、桃和荠菜的CAXs形成独立的A亚型和B亚型两大分支,而酿酒酵母VCX 1和莱茵衣藻CrCAX1、CrCAX2 分别位于独立的F亚型和C亚型,这与Shigaki等^[19]的分析结果相似。A亚型包含4个基因,即MdCAX 1、MdCAX3、MdCAX4、MdCAX5 ;B亚型包含4个基因,即MdCAX 2、MdCAX6、MdCAX7、MdCAX8。其中MdCAX1、MdCAX3位于第4染色体上,MdCAX 2、MdCAX8 位于第9染色体上,MdCAX 7 位于第3染色体上,MdCAX 4 位于第11染色体上,MdCAX 5 位于第12染色体上,MdCAX 6位于第17染色体上(表 2)。

	图 1 苹果MdCAXs与其他物种CAXs的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of apple MdCAXs family and other species CAXs
图选项

从表 2可见:苹果MdCAXs蛋白中A亚型蛋白质含有氨基酸数比B亚型少,等电点在4.97~6.81之间,氨基酸序列的平均亲水系数(grand average of hydropathicity,GRAVY)均为正值,表明它们的蛋白质均属于疏水蛋白,但疏水程度不同。

2.2 苹果MdCAXs的基因结构

利用苹果MdCAXs的开放阅读框(ORF)和基因组序列,确定了苹果MdCAXs基因的内含子和外显子的分布情况(图 2),分析表明,A亚型的内含子数目为10~11个,B亚型的内含子数目为12~14个;内含子在0、1、2相位均有出现。

	图 2 苹果MdCAXs基因结构分析 Fig. 2 Structure of MdCAXs genes in apple
图选项

MdCAXs在进化上是相对保守的,在氮末端具有一段32个氨基酸左右的NRR,在序列的羧基端有C-端功能区域,在M3~M4、M8~M9之间均含有保守的c-1和c-2序列,其保守序列与离子转运专一性有关^{[19, 20]};M6~M7之间有一个酸性氨基酸序列,将MdCAXs分成大约相等的两部分;虽然A亚型和B亚型的保守氨基酸重复序列稍有不同,但A亚型的M4后均含有高亲水氨基酸区域,B亚型中含有CAF残基;M1~M2之间有9个同源性较差的氨基酸序列,可能是识别阳离子的重要区域^[25];M5~M6之间有相似性较低的一个亲水区域,对拟南芥CAXs的研究发现,这段序列对胞质pH值起调节作用,称为D功能区(图 3)。

	图 3 苹果MdCAXs家族氨基酸序列比对 Fig. 3 Alignment of the amino acid sequences of apple MdCAXs family
图选项

用Pfam在线软件对苹果MdCAXs蛋白序列进行分析,结果表明:8条序列中都含有Na⁺/Ca²⁺转运蛋白保守结构域,位置位于第96~456个氨基酸之间,该区域是一个保守序列比较集中的区域。其中MdCAX2在第29~202个氨基酸之间含有2个植物自交不亲和蛋白S1结构域(self-incomp-S1),MdCAX6在第490~545个氨基酸之间含有1个N末端结构域(PMR5N),MdCAX7在第490~636个氨基酸之间含有1个氨基酸跨膜转运蛋白结构域(Aa-trans)。

利用TMHMM Server v.2.0软件对MdCAXs蛋白进行跨膜结构分析,结果(图 3)表明:MdCAX2蛋白有12个跨膜区域,前2个跨膜区域位于植物自交不亲和蛋白S1结构域内,MdCAX7蛋白有14个跨膜区域,后3个跨膜区域位于氨基酸跨膜转运蛋白结构域内。其余的蛋白都是11个跨膜区域,跨膜位置基本上都位于保守的Na⁺/Ca²⁺转运蛋白保守结构域内。

2.5 苹果MdCAXs的亚细胞定位预测

用PSORT在线工具预测MdCAXs的亚细胞定位,分析结果见表 3。A亚型蛋白主要分布在质膜上,少量分布在内质网上;B亚型蛋白也是主要分布在质膜上,除内质网外,线粒体、液泡、高尔基体也有少量分布。许宽勇等^[21]对MdCAX1亚细胞定位研究表明,该蛋白是一种质膜蛋白。

将生根的组培苗进行4种不同盐处理后,检测MdCAXs家族8个基因在苹果根、茎和叶中的表达水平。由图 4可见:MdCAX 1 经Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺处理后,与对照相比,叶和茎中的表达量增加,其中以Ca²⁺和Mn²⁺处理增加较为明显;而根中与对照相比出现下调,Mg²⁺处理后表达量几乎检测不到。4种离子处理后,MdCAX 2 在叶片中表达下调;在根中,除了Mn²⁺外,其他3种离子处理MdCAX 2 表达上调,其中以Ca²⁺处理上调最为明显。MdCAX 3 在4种离子处理后叶片中的表达量均上调,其中Ca²⁺和Mn²⁺处理后增加较为明显;在茎中,Na⁺、Ca²⁺处理后表达量增加,而在根中表达量基本不受影响,Mg²⁺和Mn²⁺处理,在茎和根中表达呈下调趋势。MdCAX 4的表达趋势与MdCAX1 类似,处理后茎和叶表达增加;而根中表达量下调,Mg²⁺处理后表达量几乎为零。MdCAX 5 只有在Ca²⁺处理后茎中的表达量有少量增加;叶片中的表达量在4种离子处理后都出现不同程度的下降;根中的表达量在Ca²⁺、Mg²⁺处理下出现下降,Na⁺、Mn²⁺处理后基本保持不变。MdCAX 6 在不同的离子处理后,茎中几乎没有变化,叶片和根中呈上调表达,以叶片中(尤其Mg²⁺处理)上调表达明显。MdCAX 7 在处理后主要是茎中的表达量增加,以Ca²⁺处理茎中增加最为显著;而叶和根中变化不明显,而Mg²⁺、Mn²⁺处理MdCAX 7在根、茎、叶的表达量变化较小。MdCAX8在Na⁺、Ca²⁺、Mn²⁺处理后根中表达量明显增加,而Mg²⁺处理表达量没有变化;4种离子处理茎中MdCAX 8 基因呈上调表达,尤以Mg²⁺处理为甚,而对叶中MdCAX 8 表达影响较小。因而,苹果MdCAXs家族基因经不同盐离子处理后,在不同器官中表现差异表达,这可能是其功能差异所导致,具体原因还需进一步研究。

	图 4 不同盐处理后MdCAXs家族基因在苹果不同营养器官中的表达分析 Fig. 4 Expression analysis of MdCAXs genes in the different vegetative organs after the different salt treatments
图选项

通过苹果全基因组搜索,本文检索到8个CAX基因家族成员,MdCAXs A亚型的内含子数目为10~11个,B亚型的内含子数目为12~14个,与拟南芥等植物中CAXs内含子数目9~11相近,这说明CAX在进化过程中是相对保守的。氨基酸保守序列和进化分析表明,苹果MdCAXs蛋白都符合高等植物CAX基本特征,即含有5个典型的功能区,即N-端自抑制区域(NRR)、C-端功能区域、Ca²⁺功能域(CaD)、C功能域和D功能域。NRR功能域存在于大多数CAX蛋白中,调节CAX的功能,拟南芥CAX1的NRR区S、R、T等氨基酸残基在NRR调节Ca²⁺/H⁺反向转运活性中起重要作用^[25];也有研究表明去除NRR功能域对MdCAX1转运功能影响不大^[21];苹果所有CAX蛋白在氮末端都含有NRR功能域,NRR功能域在调节苹果CAX转运活性中的作用还有待进一步研究。CaD是识别Ca²⁺的重要区域,MdCAXs在TM1和TM2之间有9个同源性较差的氨基酸序列为钙离子结合区(CaD),对Ca²⁺转运的选择具有专一性,且决定CAXs转运Ca²⁺的能力^[25]。拟南芥AtCAX2的C功能域与Mn²⁺专一性转运相关,CAF氨基酸残基赋予其转运Mn²⁺的功能^[26],氨基酸序列表明MdCAX2、MdCAX6、MdCAX7和MdCAX8均含有CAF残基,同归为B亚型,推测它们可能参与Mn²⁺转运。D功能域对胞质的pH起调节作用^[27],序列中的His残基是结合H⁺、感知pH的关键位点;sAtCAX2的D功能域是位于M5~M6之间的1个亲水区域,含有2个His²²²和His²²⁶残基,当把His^222/226定点突变为带正电荷的碱性赖氨酸(K)时,突变体对Ca²⁺和Mn²⁺敏感性与sAtCAX2的一致,且不影响sAtCAX2对Mn²⁺转运的专一性,但突变为带负电荷的酸性天冬氨酸(D)时突变体无转运活性^[28];苹果MdCAXs B亚型的M5~M6之间D功能区域中含有带正电荷的碱基K、R和H,可能是结合H⁺,感知pH的关键位点。A亚型在其他跨膜区域有多个His残基,影响蛋白对离子选择与转运的作用^[27];MdCAX1的H³³¹在8条序列中都是保守的,位于c-2区域中,可能与离子的选择转运相关。

对CAXs的亚细胞定位发现,CAXs主要定位于液泡膜、质膜和叶绿体类囊膜上,在线粒体膜上也有报道^{[29, 30]}。目前已克隆的植物CAXs中大豆GmCAX1^[18]、苹果MdCAX1^[21]、水稻OsCAX3^[17]定位于质膜上;拟南芥中的AtCAX1、AtCAX2、AtCAX3、AtCAX4,豇豆的VCAX1,水稻中的OsCAX1a,盐地碱蓬中的SsCXA1^[31]和碱茅中的Put-CAX1^[32]等都定位于植物的液泡膜上。本文中对苹果的CAXs进行预测,发现8个基因主要定位于质膜上,但还需进一步进行试验验证。

CAXs基因家族在不同的组织表达模式不同^[33],如盐地碱蓬SsCAX 1主要在茎和叶片表达而在根部几乎检测不到,棉花GhCAX3 主要在叶、茎、柱头、花瓣和胚珠中表达,在根和纤维组织中的表达量较少^[34]。苹果MdCAXs基因也有组织特异表达特征,不同的MdCAX在根、茎、叶中表达量不同。同时,CAX对不同阳离子有特异性的应答反应,说明CAX不仅是钙离子转运蛋白,还可能转运其他金属离子。在Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺盐处理下,MdCAX 1、MdCAX3、MdCAX4、MdCAX6和MdCAX7 基因在叶中的表达量增加,其中Ca²⁺处理后最为明显,而根中变化幅度不大,甚至表达量下调。而MdCAX 2 在4种离子处理后,叶中表达量下调,根中表现上调(除Mn²⁺处理外);MdCAX 8 对离子处理响应的器官主要在茎和根中,4种离子处理后表达明显上调,尤其是茎中MdCAX 8 对Mg²⁺处理响应强烈。因此,苹果不同器官内CAX对外界离子具有特异性应答反应,暗示它们存在不同的离子转运功能。