无患子属(Sapindus)是无患子科(Sapindaceae)落叶乔木，广泛分布在亚洲和美洲的热带、亚热带低山丘陵及石灰岩地区(Chhetri et al., 2008)，在我国主要在秦岭淮河以南散生或居群分布。无患子属以其种实丰富的果皮皂苷和种仁油脂含量，成为重要的生物日化、生物柴油、生物医药等多功能原料树种而倍受国内外重视(贾黎明等，2012；刘济铭等，2017)。目前，在我国福建、浙江、贵州、云南、湖南等地已陆续发展了数万公顷的人工原料林(高媛等，2016)，但普遍产量产值较低，导致此问题的主要原因是缺乏优良品种和高效技术。

种质资源的丰富程度是良种选育的先决条件，而种质资源遗传多样性更是生物进化和育种工作的物质基础(曾列先等，2013)。表型性状具有变异性和相对稳定性，是植物基因型和所处环境的综合体现，因此表型变异已成为遗传多样性研究的重要内容，国内外已先后对大麦(Hordeum vulgare)(刘亚楠，2017)、大豆(Glycine max)(王燕平等，2017)、番茄(Lycopersicon esculentum)(Cebolla-Cornejo et al., 2013)、柑橘(Citrus)(孙珍珠等，2017)、油茶(Camellia Sect. Oleifera)(袁军等，2014)、麻疯树(Jatropha curcas)(王乐乐，2015)、文冠果(Xanthoceras sorbifolium)(孙琳琳，2012)等作物、林木的表型变异进行了分析和综合评价。洪莉等(2013)、刘宝等(2014)、刁松锋等(2016)、姜翠翠等(2016)、Sun等(2018)和印度学者Mahar等(2010；2011；2013)利用ISSR等分子标记技术对不同地理区域的野生、半野生及地方无患子属种质资源开展遗传多样性分析，发现无患子属居群间、居群内存在丰富的遗传变异，且居群内变异高于居群间，但研究普遍局限于无患子属内单种，鲜有学者针对大样本无患子属天然种质资源表型性状开展表型变异研究。本研究针对无患子属3种1变种，广泛收集天然种质资源，分析表型变异规律，定向筛选优良种质，为选育适合无患子多联产产业开发的优良品种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

研究建立在团队2013—2017年间广泛调查和收集种质资源的基础上，选择胸径在30 cm以上、树体生殖生长旺盛、结果主枝达到3个以上，具代表性的天然实生优株，于秋季果实成熟期完成采样。各种质来自我国河南、江苏、安徽、湖北、重庆、四川、浙江、江西、湖南、贵州、福建、广东、广西、云南14省(市、自治区)及越南的1个地区(图 1、表 1)，均为具一定代表性的天然实生种质，包括无患子(S. mukorossi)146份、川滇无患子(S. delavayi)36份、毛瓣无患子(S. rarak)10份、石屏无患子(S. rarak var. velutinus)8份，每份种质种实样品不少于5 kg。将200份样品充分阴干，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法 1.2.1 表型性状测定

四分法随机抽取种实30粒，重复3次。使用电子游标卡尺(精度0.02 mm)分别测量果实和种子的横、纵、侧径及果皮厚，使用千分之一天平测定果实、种子、果皮、种仁和种壳百粒质量，计算出仁率(出仁率=种仁质量/种子质量)、果中种子含量(果中种子含量=种子质量/果实质量)、果型指数(果型指数=果实纵径/果实横径)、果实体积指数(果实体积指数=果实横径*果实纵径*果实侧径)、种型指数(种型指数=种子纵径/种子横径)、种子体积指数(种子体积指数=种子横径*种子纵径*种子侧径)等指标。

1.2.2 油脂质量分数测定

机械碾碎样本种仁，105 ℃烘干至恒重，球磨仪粉碎，准确称取5 g样品于FOSS索氏抽提系统内，90 mL石油醚有机溶剂环境中抽提2 h，所得油样105 ℃条件下蒸干石油醚，称重计算，油脂质量分数=油样质量/样品质量，重复3次。索氏抽提系统为丹麦福斯有限公司生产，型号Soxtec 2050。

1.2.3 果皮皂苷质量分数测定

称取果皮干样粉末0.4 g，于95%乙醇溶剂、105 ℃环境下于FOSS索氏抽提系统内提取4.5 h，超声提取，水饱和正丁醇萃取3次，旋转蒸干，加入35%盐酸5 mL热回流2 h，乙酸乙酯萃取3次，旋转蒸干后甲醇溶解定容备用。取0.4 mL样品溶液于试管中水浴挥干。加入0.2 mL 5 %香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，水浴70 ℃ 15 min，冰浴2 min，加入5 mL冰醋酸摇匀，于分光光度计547 nm处检测吸收峰(唐青涛等，2008)。分光光度计型号为German bruker，VERTEX70。

1.2.4 数据处理

采用Mircosoft Excel 2016整理统计数据，运用R-3.3.1和SPSS 19. 0软件进行数据分析。Shapiro-Wilk检验正态分布，描述性统计种实性状变异情况，Shannon-Wiener多样性指数(index of genetic diversity，H)表征任一性状的多样性程度，采用欧式距离ward法聚类分析。

多样性指数(H)(董玉琛等，2003)的计算：计算参试材料的平均数(μ)和标准差(σ)，将目标性状均划分为10级，(μ-2σ)≤x_i≤(μ+2σ)，每间隔0.5 σ为一级，计算每一级相对频率p_i(p_i为某性状第i级别材料份数占总份数的百分比)。

多样性指数计算公式：H＝-∑p_ilnp_i。

主成分分析法(孙珍珠等，2017；孙操稳等，2016；王纶等，2017)确定各个筛选指标权重系数，计算各种质的综合指数，进而筛选出优异种质。综合指数计算公式：${\rm{ZF = }}\sum\nolimits_{i = 1}^m {\sum\nolimits_{j = 1}^n {{W_{ij}} * {H_{ij}}} } $。式中: ZF为综合指数，m为每个主成分组下指标数，n为每组下各指标总样本数，W_ij为第j指标第i样本的权重数，H_ij为第j指标第i样本原始数据正规化后的值。

2 结果与分析 2.1 种实性状变异及表型多样性分析

根据无患子属种实性状变异情况(表 2)，发现果实百粒质量等20个性状变异系数分布在5.46%~38.19%之间，均值为17.42%，表明各种质种实性状变异显著。其中果皮皂苷质量分数(38.19%)、种仁百粒质量(30.23%)和果皮百粒质量(30.29%)变异系数较高，果型指数(5.46%)、种型指数(5.70%)及果实、种子的横径(8.25%、7.32%)和纵径(6.46%、6.61%)变异系数较低。种仁、果皮百粒质量变异幅度大表明种质间与产量相关性状变异丰富，果型、种型指数变异较小体现种实形态较为稳定，基本为椭圆球状。不同的是，果实侧径与横、纵径表现出差异趋势，果实侧径变异系数达到21.05%，其中最具代表性的为来自福建的第142号样，果实呈扁肾型。

20个种实性状不同程度地体现了无患子属内丰富的多样性，其多样性指数在1.47~2.04之间，平均值为1.95，其中油脂质量分数(2.04)、种型指数(2.03)、果实百粒质量(2.03)、种仁百粒质量(2.02)、种壳百粒质量(2.02)、果中种子含量(2.02)和果皮百粒质量(2.01)等多样性指数较大，而果实侧径(1.47)、果型指数(1.84)、果皮厚(1.90)和果实体积指数(1.92)等多样性指数较小。

2.2 种实性状相关性分析

相关性分析(表 3)发现种质间13个性状间存在着不同程度的相关性，且多数性状间为显著或极显著相关。其中，果实百粒质量与果皮百粒质量(0.927)、种子百粒质量(0.768)呈极显著正相关，种子百粒质量与种壳百粒质量(0.863)、种仁百粒质量(0.635)呈极显著正相关，表明无患子果实质量组成中果皮与种壳占比较大，占比分别为57.57%和31.55%，种仁占比仅为11.82%。果型指数与种型指数呈极显著正相关(0.254)，果实体积指数与种子体积指数呈极显著正相关(0.655)，表明果实与种子大小具有一致性。同时发现无患子油脂质量分数与果皮皂苷质量分数呈极显著负相关(-0.382)，推测无患子种实油脂与皂苷的生成存在一定程度的竞争关系。

2.3 基于种实性状的种质聚类分析

根据20个种实性状数据采用欧式距离Ward法聚类分析(图 2)，在欧式距离为40时，将200份无患子属种质分为3个类群：类群Ⅰ为小果型类群，共99份种质，主要来自河南、安徽、江苏、江西、浙江、福建、四川、广西等地，平均果实百粒质量仅为283.45 g；类群Ⅲ是中果型类群，共76份种质，果实百粒质量、油脂质量分数和果皮皂苷质量分数均在中游水平，主要为来自湖北、江西、浙江、湖南、广东、云南等地的种质，平均果实百粒质量为342.37 g；类群Ⅱ为大果型类群，共25份种质，主要为贵州、云南等地的种质，平均果实百粒质量达到438.76 g，且果皮皂苷质量分数可达16.77%。3类群体中，无患子主要分布在第Ⅰ类群中，川滇无患子主要分布在第Ⅲ类群中，毛瓣无患子主要分布在第Ⅱ、Ⅲ类群中，石屏无患子全部分布在第Ⅲ类群中。分析认为，无患子种实普遍属于小果型类群，川滇无患子、毛瓣无患子、石屏无患子均属于中、大果型类群。

2.4 果用经济性状优良种质筛选 2.4.1 油用种质筛选

采用与种实油脂产出相关的4个性状开展主成分分析，确定各主成分及其性状指标权重，计算综合主成分值并排序，结果显示前2个主成分累积方差贡献率达82.72%，表明前2个主成分可表达影响种实油脂产出的大部分信息。根据信息重叠图(图 3)发现，第1主成分主要由果实百粒质量(FrW)、种子百粒质量(SW)和种仁百粒质量(SKW)组成，集中反映种仁产量决定油脂产出，第2主成分主要由油脂质量分数(OC)组成。根据综合主成分值对200份无患子属种质排序，筛选前10名(表 4)，其中最优油用种质为来自贵州罗甸的无患子98号种质，贵州贞丰有4份种质入选。

2.4.2 皂用种质筛选

采用与种实皂苷产出相关的4个性状进行主成分分析，结果显示前2个主成分累积方差贡献率达83.73%，表明前2个主成分可表达影响种实皂苷产出的大部分信息。根据信息重叠图(图 4)发现，第1主成分主要由果实百粒质量(FrW)、果皮百粒质量(FPW)和果皮厚(PT)组成，集中反映种实果皮产量决定皂苷产出，第2主成分主要为果皮皂苷质量分数(PSC)组成。根据综合主成分值对200份无患子属种质排序，筛选前10名(表 5)，其中最优皂用无患子种质为来自江西省龙南县的无患子67号种质。

2.4.3 无患子属种实性状综合评价

对与种实经济性状相关的10个指标进行主成分分析，由各性状指标的因子载荷及贡献率(表 6)看出，前5个主成分累积方差贡献率达到87.27%，认为前5个主成分较好地反映了各性状指标的总体信息。第1主成分贡献率(34.34%)最大，因子载荷较大的为果实百粒质量(FrW)和果皮百粒质量(FPW)，说明第1主成分主要反映了种实产量指标；第2主成分的贡献率为19.26%，因子载荷较大的为种仁百粒质量(SKW)和出仁率(SKC)，说明第2主成分重点表征了种实油脂产出能力；第3、4、5主成分贡献率分别为14.88%、10.28%和8.51%，其中果中种子含量(SCF)、油脂质量分数(OC)、果皮皂苷质量分数(PSC)和种子百粒质量(SW)的因子载荷较高，表明第3、4、5主成分重点表征种实油脂、皂苷产出效率。因第1、第2主成分均侧重种实百粒质量的各指标，这说明本研究建立的无患子种实性状筛选体系符合以经济产量为优先选择指标的筛选原则。

以第1、第2主成分为横、纵坐标构建主成分信息重叠图(图 5)，将种质与种实性状特征向量重叠，发现多数种质居于平均水平范围，只有极少数种质在果实和种子的百粒质量及果皮皂苷质量分数等指标上表现出极值状态，且油脂质量分数的特征向量与果皮皂苷质量分数的特征向量表现出明显的相反趋势。

综合计算各种质相应得分并排序，结果表明江西省龙南县的第67号种质最优，其次为来自云南临沧的162号种质。筛选出的最优10份种质(表 7)中无患子共7份、川滇无患子1份、毛瓣无患子2份。

将油用、皂用及综合评价筛选所得种质与无患子属平均水平相比(表 8)，平均增益分别达到35.27%、33.76%和36.85%。3种评价方法均显著提高了种实百粒质量各指标，表明产量相关性状是决定经济性状的基础。

3 讨论

无患子属植物经过长期的自然选择和地理隔离，其种间和种内产生了丰富的遗传变异。关于无患子属遗传多样性分析的报道中，洪莉等(2013)、刘宝等(2014)、Sun等(2018)及印度学者Mahar等(2011)均利用DNA分子标记技术对其进行了遗传多样性分析，发现存在丰富的遗传多样性，且遗传多样性主要来源于居群内，其次是地理隔离和居群间。刁松锋等(2014a)也对无患子13个天然群体的10个种实表型进行多样性分析，表型差异和分子标记聚类结果存在一定差异。本研究发现，无患子属200份种质资源种实性状表现出丰富的多样性，以果皮皂苷质量分数、种仁百粒质量和果皮百粒质量为代表的经济性状表现出30.29%~38.19%的变异幅度，多样性指数较高，而果型指数、种型指数变异较小，多样性指数较低。这可能是由于无患子属种实形态指标较为稳定，较少受环境影响；而种实产量指标为数量性状，遗传不稳定，推测为复杂环境差异与丰富的基因交流导致产量指标变异丰富，这为良种选育提供了丰富的资源和极大的空间。

聚类分析表明无患子属不同种、不同地理来源的种质在遗传水平上存在明显差异。Mahar等(2011)利用聚类分析将印度55份无患子种质划分为3类，发现遗传多样性与地理距离存在显著一致性；而刁松锋等(2016)发现无患子居群间与地理距离无显著相关性；Sun等(2018)将61份无患子属种质划分为川滇无患子、无患子亚群a与无患子亚群b 3类，2个亚群混杂分布，并推测长江流域为我国无患子发源地。本研究将200份无患子属种质划分为3个类群，其中类群Ⅰ、Ⅲ在地理分布上呈现混杂分布，且88.36%的无患子种质来源于类群Ⅰ、Ⅲ，表明无患子在我国分布并无显著地理变异趋势，这与刁松锋等(2016)、Sun等(2018)结论相似。不同的是，种质份数占比仅为12.5%的类群Ⅱ集中聚集在贵州南部和云南区域，其平均果实百粒质量较类群Ⅰ和类群Ⅲ超出54.79%和28.02%，无患子、川滇无患子、毛瓣无患子在类群Ⅱ中均有分布，推测该区域处于无患子属内种间混杂区域，丰富的基因交流与独特的干热气候类型共同作用导致其碳水化合物的快速积累，表明类群Ⅱ具有显著的筛选高产、高质量优良品种的潜力。

由无患子属种实性状综合评价的主成分信息重叠图(图 5)发现，油脂质量分数与果皮皂苷质量分数特征向量呈现近相反的趋势，推测无患子属在特定生态环境中展现的权衡策略，即种实在生长发育过程中，通过不断地优化自身的资源分配来适应环境的变化(Fabbro et al.，2004)，即对皂苷产物积累过程投入的增加要以减少对种仁油脂积累的投入为代价(Bazzaz et al.，1987；孙儒泳，1997)，这为无患子属种实养分运移提出新假设。

国内对于无患子属优良种质的评价筛选已开展多年，范辉华等(2014)、刁松锋等(2014b)、孙操稳等(2016)先后筛选出多批具有优良性状的种源、家系和单株，但研究仍存在采样量小、评价多集中于单果性状等问题。本研究收集我国14省(市、自治区)和越南1地区共200份无患子属种质资源，北起河南新乡南太行山山脉，南至云南西双版纳热带雨林，涵盖了南亚无患子属种质资源的大部分类型，包含资源信息丰富。研究采用相关性和主成分分析结合的方法，针对油用、皂用和综合利用分别筛选出10份最优种质，其中油用最优种质种子百粒质量增益56.08%，皂用最优种质果皮百粒质量增益71.29%，较孙操稳等(2016)最高增益超出近30%，各种实性状增益显著。3种评价模式所得种质均在种实百粒质量方面表现出一致的提高，但侧重不同，油用评价模式侧重种子和种仁的百粒质量，皂用评价侧重果皮百粒质量与果皮厚，而综合评价将前二者相结合。3种评价体系共同表明产量才是决定种质质量的首要条件，这与Sun等(2018)的结果相似。因此，无患子属种质资源评价体系应侧重产量相关指标体系的构建，引入单位面积产量等指标，弱化油脂质量分数等较稳定指标的影响，这对于无患子属优良种质评价体系的建立具有一定参考价值。

本研究经综合评价筛选所得的10份最优种质中，7份为无患子，2份为毛瓣无患子，1份为川滇无患子，且有7份种质属于第Ⅱ类群大果型群体，推测无患子、毛瓣无患子相比于川滇无患子和石屏无患子更具发展潜力，这佐证了孙操稳等(2016)提出的无患子更具综合发展潜力。无患子属最优种质集中出现在云南、贵州两省，其原因可能为云南、贵州两省为我国无患子属内种间分布交叠区域，种间、种内基因交流频繁，且云贵高原光、热资源丰富，基因与环境共同作用导致该区域无患子属可利用的正向变异丰富，推测云南、贵州部分区域拥有更适合发展无患子产业的优良种质和环境条件。

4 结论

无患子属种质资源种实性状遗传变异丰富，以果皮皂苷质量分数和果皮百粒质量为代表的产量指标变异幅度最大，为无患子良种选育提供了丰富的资源和极大的空间。果型指数和种型指数变异较小，种实形态相对稳定。油脂质量分数与果皮皂苷质量分数特征向量呈现相反的趋势，表现出无患子属在特定生态环境中的权衡策略，即对皂苷产物积累过程投入的增加要以减少对种仁油脂积累的投入为代价。针对不同用途筛选无患子属最优种质，3种评价体系表明产量指标才是决定种质质量的首要条件，评价体系筛选出油用、皂用及综合利用无患子属最优种质各10份，较平均水平增益显著，优良种质多分布于云南、贵州区域，推测云南、贵州部分区域拥有更适合发展无患子产业的优良种质和环境条件。